Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng igy nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang f1 của vi khuẩn dịch hạch yersinia pestis và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KH&CN VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT MAI THỊ THU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA DÒNG IgY NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA PESTIS VÀ ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 11/2017 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi tự thực Tất số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn hồn tồn trung thực, chưa tác giả công bố trước Nếu lời cam đoan không thật tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Tác giả Mai Thị Thu LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Hòa, trưởng phịng Kỹ thuật Gen, Viện Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy hướng dẫn, giúp đỡ thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, dạy dỗ, giúp đỡ suốt trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn cấp Thủ trưởng cán phòng Sinh học, Viện Hóa học - Mơi trường Qn nơi tơi cơng tác, đặc biệt đồng chí Nguyễn Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn bạn bè gia đình, người ln ủng hộ suốt thời gian qua! Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017 Học viên Mai Thị Thu MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU 10 CHƯƠNGI: TỔNG QUAN 12 I Bệnh dịch hạch nguyên nhân gây bệnh dịch hạch 12 I.1 Bệnh dịch hạch 12 I.2 Tình hình dịch hạch giới Việt Nam 13 I.2.1 Tình hình dịch hạch giới 13 I.2.2 Tình hình dịch hạch Việt Nam 14 I.3 Biểu bệnh dịch hạch 16 I.3.1 Dịch hạch thể hạch 16 I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết 18 I.3.3 Dịch hạch thể phổi 19 I.4 Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch vi khuẩn Y pestis 20 I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch 20 I.4.2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y pestis 22 I.5 Kháng nguyên nang F1 24 I.5.1 Cấu trúc kháng nguyên nang F1 24 I.5.2 Tính chất kháng nguyên nang F1 25 I.6 Các phương pháp phân tích chẩn đốn kháng ngun nang F1 vi khuẩn Y.pestis 25 I.6.1 Phương pháp miễn dịch 25 I.6.2 Phương pháp sinh học phân tử 30 I.7 Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng 31 I.7.1 Định nghĩa IgY 31 I.7.2 Sự hình thành kháng thể IgY gà 31 I.7.3 Cấu trúc kháng thể IgY 32 I.8 Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột chủng BALB/c 33 I.8.1 Khái niệm, ứng dụng kháng thể đơn dòng 33 I.8.2 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng .34 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .37 II.1 Vật liệu nghiên cứu 37 II.1.1 Động vật thí nghiệm 37 II.1.2 Hóa chất vật tư tiêu hao 37 II.1.3 Thiết bị 37 II.2 Phương pháp nghiên cứu 38 II.2.1 Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 38 II.2.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 chuột BALB/c chủng 42 II.2.3 Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát nhanh F1 .45 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .47 III.1 Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà 47 III.1.1 Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein) làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA 47 III.1.2 Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 49 III.2 Tạo dịng tế bào lai có khả sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 chuột BALB/c chủng 53 III.2.1 Gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c chủng 53 III.2.2 Kết tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 .55 II.3 Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát nhanh F1 57 III.3.1 Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm 57 III.3.2 Ảnh hưởng loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY 58 III.3.3 Tối ưu hóa điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng 60 III.3.4 Tối ưu hóa điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm 61 III Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử 64 III.4.1 Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 64 III.4.2 Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 65 III.4.3 Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 65 III.4.4 Xác định độ nhạy que thử với chế phẩm thương mại G20 .66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .68 DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Tình hình dịch hạch giới từ năm 1954 – 2001 Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch Việt Nam từ năm 1976-2002 Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch Việt Nam so với giới, 1954-2001 Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch Hình 1.6: Hình ảnh Y pestis bắt màu đậm đầu nhuộm Wayson Hình 1.7: Mơ hình lắp ráp thành phần kit ICT(I) đánh giá kết (II) Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lịng đỏ trứng Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG IgY Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dịng Hình 2.1: Gây miễn dịch chuột với kháng nguyên F1 Hình 3.1: Phổ điện di phân đoạn rửa giải trình tinh kháng nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1 Hình 3.2: Xác định độ pha lỗng kháng thể kháng IgY gắn HRP Hình 3.3: Xác định độ pha lỗng kháng thể IgY kháng F1 Hình 3.4: Ảnh hưởng thời gian thu trứng lên hiệu giá chế phẩm IgY Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể chế phẩm IgY từ trứng thu thời điểm 30, 35 ngày sau gây miễn dịch lần Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết chuột trước gây miễn dịch sau gây miễn dịch độ pha lỗng khác Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dịng có lực F1 Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm Hình 3.10: Ảnh hưởng màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY Hình 3.11: Ảnh hưởng nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng Hình 3.12:Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng Hình 3.13:Ảnh hưởng nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Hình 3.14: Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Hình 3.15: Xác định độ nhạy que thử phát F1 sử dụng chế phẩm IgY Hình 3.16: Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Hình 3.17: Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Hình 3.18: Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Hình 3.19: Xác định độ nhạy que thử phát F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp Bảng 3.1: Nồng độ protein phân đoạn rửa giải tinh cột sắc ký lực NI-NTA Bảng 3.2: Giá trị OD 450 nm mẫu huyết chuột trước sau gây miễn dịch Bảng 3.3: Kết lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IgY Yolk Immunoglobulin ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay BSA Bovine Serum Albumin SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis HTSKMD Hệ thống sắc ký miễn dịch kDa Kilo Dalton KLPT Khối lượng phân tử MBP Maltose binding protein LB Luria – Bertani ICA Immunochromatographic assay NC Nitrocellulose TL Test line CL Control line ICT immunochromatographic test 10 LỜI MỞ ĐẦU Dịch hạch bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm Yersinia pestis gây Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh bọ chét Bệnh biết từ thời xa xưa gây vụ đại dịch lớn vào kỉ XI, XIV XIX với hàng trăm triệu người tử vong Tuy phát từ lâu ổ dịch tồn hoạt động nhiều khu vực trái đất Tuy dịch hạch kiểm soát công tác điều tra giám sát dịch tễ học phải tiến hành thường xuyên Bởi bệnh dịch hạch xuất gặp điều kiện thuận lợi gây ảnh hưởng to lớn đến sống người Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis coi tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học Trong bối cảnh phức tạp nay, giới, khủng bố vũ khí sinh học lực thù địch tìm cách lợi dụng phát triển Trong đó, vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y pestis) đối tượng nguy hiểm So với loại vũ khí thơng thường, vũ khí sinh học khó phát hiện, lại gây chết người hàng loạt diện rộng; gây thiệt hại nặng nề kinh tế gây ô nhiễm môi trường cách trầm trọng Các phương pháp phân tích kháng nguyên F1 đặc hiệu cho Y Pestis phương pháp miễn dịch phổ biến ELISA sắc ký miễn dịch kẹp đôi (Splettstoesser đồng tác giả, 2004) Que thử phát nhanh kháng nguyên F1 tạo phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đơi có quy trình phân tích đơn giản, khơng cần trang thiết bị thích hợp với phép phân tích trường; đáp ứng nhu cầu củacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm vụ vùng rừng núi hẻo lánh Nhiệm vụ Phịng Sinh học/Viện Hóa học – Mơi trường quân nghiên cứu, chế tạo trạng thiết bị để thực nhiệm vụ trinh sát, phát nhanh tác nhân sinh học Do việc nghiên cứu sản xuất test phát nhanh kháng nguyên nang F1 vi khuẩn Y.pestis môi trường phương 55 giảm tượng dương tính giả mẫu huyết âm tính phản ứng ELISA, mẫu huyết phải pha loãng độ pha lỗng định Trong thí nghiệm này, mẫu huyết trước sau gây miễn dịch pha loãng theo số độ pha loãng 1:50 Quan sát hình cho thấy giá trị OD450 mẫu huyết chuột trước gây miễn dịch giảm dần theo độ pha loãng Từ độ pha loãng 1:6400 giá trị OD450 mẫu huyết trước gây miễn dịch khơng giảm nữa, đồng thời có khác biệt rõ ràng mẫu trước sau gây miễn dịch So sánh giá trị OD450 huyết chuột trước gây miễn dịch sau tuần gây miễn dịch lần cho thấy chuột có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên F1 III.2.2 Kết tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 Để tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể kháng kháng nguyên F1, tiến hành lai tế bào Myeloma Sp2/0 với tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên Sau tiến hành dung hợp, tế bào nuôi cấy môi trường chọn lọc HAT HT Toàn giếng tế bào kiểm tra kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 đánh dấu giếng có tế bào lai Hình 3.7 Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dịng có lực F1 Trong nghiên cứu này, đợt thí nghiệm khác tiến hành để sản xuất tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng Mỗi đợt thí nghiệm, sau lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên, tế bào nuôi cấy đĩa ni cấy tế bào 96 giếng Kết q trình tạo tế bào lai trình bày bảng 3.3 56 Bảng 3.3: Kết lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho B chuột BALB/c gây miễn dịch với kháng nguyên F1 Số lượng tế bào dùng để lai nuôi cấy Lần lai Số đĩa Tế bào Tế bào Myeoloma lympho B tế bào dùng (đĩa 96 giếng) Tỷ lệ % số Tổng số Tổng số giếng có tế giếng giếng có bào ni cấy tế bào lai/giếng tế bào lai nuôi cấy tế bào 1,6 x 107 1,6 x 108 768 0 1,6 x 107 1,6 x 108 384 240 62,5 Kết Bảng 3.3 cho thấy, lần lai không xuất tế bào lai sau 10 ngày theo dõi Dung nạp lần thứ 2, chúng tơi thực đĩa ni cấy, có 240 giếng xuất tế bào lai, tỷ lệ lai thành cơng 62,5% Các giếng có tế bào lai tiếp tục nuôi cấy, dịch nuôi cấy sử dụng trình chọn lọc để thu tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng mong muốn Tuy nhiên tỷ lệ giếng có tế bào lai chưa cao, chúng tơi chuẩn bị cho lần lai để thu thêm tế bào lai Để đánh giá 240 dòng tế bào lại tạo sau lần lai thứ 2, tiến hành đổi đệm 240 mẫu dịch ni dịng tế bào lai đệm phosphat pH 7,4, sau in phun lên que thử với nồng độ kháng thể IgG µg/µl Tiến hành chạy que thử với nồng độ F1 100 ng/ml 3µl cộng hợp phát 3YP8 Kết sàng lọc trình bày Hình 3.8 cho thấy tất 240 dòng tế bào lai kể cho kết âm tính với F1 Thử nghiệm ELISA cho kết tương tự Như nghiên cứu chúng tơi chưa tạo dịng tế bào lai mong muốn có lực với F1 57 Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dịng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 II.3 Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát nhanh F1 III.3.1 Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm Từ kết ELISA, lựa chọn mẫu IgY (ứng với trứng thu ngày thứ 15, 20; 25; 30; 35; 45 sau gây niễm dịch với F1) cho hiệu giá kháng thể cao, để in thử lên màng Que thử phát nhanh F1 phát triển dựa kỹ thuật sắc ký miễn dịch kẹp đơi Kháng thể đơn dịng kháng chuột thương mại 3YP8 58 cộng hợp với hạt nano vàng làm kháng thể phát Kháng thể đa dòng IgY làm kháng thể bắt cặp Dùng µl cộng hợp/que thử, lượng kháng nguyên F1 tham gia phản ứng có nồng độ 100 ng/ml Kết trình bày Hình 3.9 Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm 1: Mẫu trứng ngày thứ 15 2: Mẫu trứng ngày thứ 20 3: Mẫu trứng ngày thứ 25 4: Mẫu trứng ngày thứ 30 5: Mẫu trứng ngày thứ 35 6: Mẫu trứng ngày thứ 45 1’: Mẫu trứng ngày thứ 15 2’: Mẫu trứng ngày thứ 20 3’: Mẫu trứng ngày thứ 25 4’: Mẫu trứng ngày thứ 30 5’: Mẫu trứng ngày thứ 35 6’: Mẫu trứng ngày thứ 45 Kết cho thấy, mẫu âm tính khơng cho tín hiệu vị trí vạch thử nghiệm, chế phẩm IgY thu ngày thứ 30 ngày thứ 35 sau gây miễn dịch cho tín hiệu vạch thử nghiệm mẫu dương tính Kết hoàn toàn trùng khớp với kết phản ứng ELISA Như lần khẳng định IgY ngày 30 ngày thứ 35 cho hiệu giá kháng thể cao Tuy nhiên IgY ngày 35 cho cường độ tín hiệu mạnh chế phẩm IgY ngày 30 sử dụng chế phẩm IgY ngày thứ 35 cho thí nghiệm III.3.2 Ảnh hưởng loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY Màng để cố định IgY màng nitrocellulose có ảnh hưởng lớn tới độ nhạy que thử Màng nhanh cho độ nhạy thấp, màng chậm cho độ nhạy cao 59 thời gian phân tách dài Protein cố định với màng nitrocellulose nhờ lực tĩnh điện, liên kết hydro liên kết kỵ nước Mơ hình thường chấp nhận cho liên kết protein với nitrocellulose protein ban đầu tương tác với bề mặt màng lực hút tĩnh điện Sau đó, cố định lâu dài thực việc kết hợp liên kết kỵ nước liên kết hydro Mặt khác dịch chuyển protein màng phụ thuộc vào kích thước lỗ màng Do thí nghiệm này, chúng tơi khảo sát loại màng có kích thước lỗ khác để in kháng thể IgY Que thử phản ứng với F1 nồng độ 50 ng/ml Kết trình bày Hình 3.10 Hình 3.10: Ảnh hưởng màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY 1: Màng Uni Sart CN 140 4: Màng CNPC-SS12 (12µm) 2: 200 CNPH-N-SS, 40 nm 5: Màng CNPC-SS12 (10µm) 3: Màng CNPC-SS12 (15µm) 6: Màng Uni Sart CN 95 Kết Hình 3.10 cho thấy,ở lô màng khảo sát mẫu âm tính khơng cho tín hiệu Trong mẫu dương tính màng Uni Sart CN 140; màng CNPC-SS12 (15µm) màng Uni Sart CN 95 mẫu xuất tín hiệu vạch thử nghiệm Ở màng Uni Sart CN 140 màng Uni Sart CN 95 tín hiệu hiển thị mờ khơng tập trung tín hiệu màng Uni Sart CN 95 Đối với màng CNPC-SS12 (12µm) màng CNPC-SS12 (10µm) khơng cho tín hiệu, ngồi cịn có tượng bi vàng bị dồn lại màng Như loại màng ảnh hưởng 60 lớn tới kết que thử Từ kết lựa chọn màng Uni Sart CN 95 cho thử nghiệm III.3.3 Tối ưu hóa điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng III.3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng Kháng thể gắn vạch kiểm chứng sử dụng toàn luận văn kháng thể đa dịng kháng IgG từ chuột có số hiệu M5899 Nồng độ M5899 khảo sát nồng độ 0,5; 1; µg/µl Kết trình bày Hình 3.11 Hình 3.11: Ảnh hưởng nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng 1, 2, tương ứng nồng độ M5899 0,5; µg/µl Kết sau lần thử nghiệm cho thấy tín hiệu vạch kiểm chứng nồng độ M5899 thử nghiệm mạnh gần Tuy nhiên nồng độ 0,5 µg/µl cho kết đẹp độ mảnh đường in cường độ tín hiệu Do để giảm chi phí chúng tơi lựa chọn nồng độ kháng thể in lên màng 0,5µg/µl III.3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín in vạch kiểm chứng Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 trước trình cố định màng nitrocellulose với nồng độ 5%; 10% 15% nhằm tạo độ sắc nét cho đường in 61 Kết thí nghiệm Hình 3.12 cho thấy, nồng độ isopropanol thử nghiệm cho kết tương tự, băng rõ nét, nên lựa chọn nồng độ isopropanol 10% nhằm tránh gây hoạt tính kháng thể Hình 3.12: Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng 1, 2, tương ứng với nồng độ isopropanol 5%, 10% 15% III.3.4 Tối ưu hóa điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm Que thử phát kháng nguyên F1 sử dụng IgY dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch kẹp đơi Trong kháng thể đa dịng IgY kháng thể bắt cặp gắn vạch thử nghiệm, vạch kiểm chứng gắn với kháng thể đa dòng M5899 Kháng thể đơn dòng 3YP8 (kháng thể kháng F1) kháng thể phát Kháng thể 3YP8 cộng hợp với bi vàng kết hợp với kháng nguyên nang F1 có mẫu tạo nên phức hợp (3YP8-Au-F1) Phức hợp di chuyển màng đến vùng vạch thử nghiệm bị IgY bắt giữ theo kiểu kẹp đơi tạo tín hiệu vạch thử nghiệm Phần dư kháng thể phát tiếp tục di chuyển đến vạch kiểm chứng bị bắt kháng thể đa dịng M5899 để tạo tín hiệu vạch kiểm chứng Kết mẫu có kháng nguyên F1 tạo nên vạch màu vị trí vạch kiểm chứng vạch thử nghiệm Nếu mẫu khơng có kháng ngun F1 cho vạch màu vị trí kiểm chứng III.3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ IgY tới cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Kháng thể IgY cố định lên vạch thử nghiệmvới nồng độ 4; 7; 10 µg/µl với liều lượng µl/cm Que thử chạy thử nghiệm với mẫu âm tính mẫu dương tính với nồng độ F1 50 ng/ml, đệm chạy pH 7,5 62 Hình 3.13: Ảnh hưởng nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 1, 2, 3: Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl F1: ng/ml 1’, 2’, 3’:Nồng độ IgY 4,7,10 µg/µl F1: 50 ng/ml Kết Hình 3.13 cho thấy với nồng độ IgY µg/µl in vạch thử nghiệm cho tín hiệu rõ ràng, độ rộng vạch thử nghiệm thu hẹp so với lượng in và10 µg/µl, thời gian màu vạch thử nghiệm 15 phút Do vậy, lựa chọn lượng IgY in vạch thử nghiệm 4µg/µl với liều lượng in phun µl/cm cho thí nghiệm III.3.4.2 Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Kháng thể IgY khảo sát đệm in phun có pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0 6,5.Vạch thử nghiệm que thử cố định với nồng độ IgY µg/µl với liều lượng µl/cm Kết Hình 3.14 cho thấy que thử in IgY pH 8,5 cho tín hiệu tốt Hình 3.14: Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệutrên vạch thử nghiệm 1, 2, 3, 4, 5: pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0; 6,5, F1: ng/ml 1’,2’,3’,4’,5’: pH 8,5; 8,0; 7,5; 7,0; 6,5 F1: 50 ng/ml 63 III.3.4.3 Xác định độ nhạy que thử IgY Qua thực nghiệm lựa chọn điều kiện in que thử sau: Vạch thử nghiệm in IgY ngày thứ 35 sau gây miễn dịch lần 1, nồng độ kháng thể in lên màng µg/µl, IgY đổi đệm Borat pH 8,5 Trên vạch kiểm chứng sử dụng M5899 đổi đệm phosphat pH 7,0 nồng độ kháng thể in phun µg/µl, bổ sung isopropanol 10% vạch thử nghiệm vạch kiểm chứng, loại kháng thể in phun màng Uni Star CN95, thời gian cho tín hiệu vạch thử nghiệm 15 phút Nồng độ kháng nguyên F1 tham gia phản ứng chúng tơi pha lỗng nồng độ 100; 50; 20; 10; ng/ml Lượng kháng thể đơn dòng kháng F1 3YP8 cộng hợp hạt nano-vàng µl/que thử Kết trình bày Hình 3.15 Hình 3.15: Xác định độ nhạy que thửphát F1 sử dụng chế phẩm IgY 1: Nồng độ F1 ng/ml 4: Nồng độ F1 20 ng/ml 2: Nồng độ F1 100 ng/ml 5: Nồng độ F1 10 ng/ml Nồng độ F1 50 ng/ml 6: Nồng độ F1 ng/ml Như với nồng độ 100; 50 ng/ml kháng nguyên F1 vạch thử nghiệm cho tín hiệu rõ ràng, nồng độ 20, 10 ng/ml tín hiệu vạch thử nghiệm thấp nhìn thấy mắt thường qt ảnh khơng nhìn thấy Có thể tạm kết luận ban đầu độ nhạy que thử nằm khoảng 10-20 ng/ml 64 III.4 Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử Kháng thể đơn dòng IgG chuột chúng tơi tiếp tục nghiên cứu, tối ưu qui trình gây đáp ứng miễn dịch tạo dịng tế bào B, có lực cao với kháng nguyên F1, làm nguyên liệu cho q trình lai tạo dịng tế bào lai có khả sinh kháng thể kháng F1 Để so sánh với que thử IgY, sử dụng kháng thể đơn dòng thương mại G20 in vạch thử nghiệm kháng thể M5899 in lên vạch kiểm chứng III.4.1 Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Với kết thử nghiệm trên, không tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng vạch kiểm chứng mà sử dụng kết nghiên cứu trước thu nhận với que thử IgY Đồng thời tiếp tục khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến G20 in vạch thử nghiệm Sự ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm khảo sát hai nồng độ µg/µl Kết thể Hình 3.16 Hình 3.16 : Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 1: Nồng độ G20 µg/µl, F1: ng/ml 1’: Nồng độ G20 µg/µl, F1: 10 ng/ml 2: Nồng độ G20 µg/µl, F1: ng/ml 2’: Nồng độ G20 µg/µl, F1: 10 ng/ml Kết Hình 3.16 cho thấy với nồng độ G20 1µg/µl cho tín hiệu vạch thử nghiệm đậm sắc nét, độ rộng vạch thử nghiệm thu hẹp so với lượng in µg/µl Như chúng tơi lựa chọn nồng độ G20 gắn màng µg/µl 65 III.4.2 Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Kháng thể đơn dịng thương mại G20 đổi đệm pH 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 cột amicon 10kDa cố định màng Kết Hình 3.17 cho thấy, pH 8,5 vạch in không sắc nét, kích thước vạch in lớn Tuy nhiên, với G20 đệm pH 7,0 cho tín hiệu vạch đậm Vì vậy, lựa chọn pH in G20 7,0 Hình 3.17: Ảnh hưởng pH đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 1: G20 đệm pH 7,0 2: G20 đệm pH 7,5 3: G20 đệm pH 8,0 4: G20 đệm pH 8,5 III.4.3 Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm Isopropanol bổ sung vào kháng thể G20 trước trình cố định màng nitrocellulose với nồng độ 5%; 10% 15% Kết thử nghiệm que thử Hình 3.18 cho thấy, nồng độ Isopropanol cho tín hiệu tượng tự nhau, để tránh biến tính kháng thể G20 chúng tơi lựa chọn nồng độ Isopropanol 10% Hình 3.18: Ảnh hưởng nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm 66 1: isopropanol 5%, F1: 10 ng/ml 2: isopropanol 10%, F1: 10 ng/ml 3: isopropanol 15%, F1: 10 ng/ml III.4.4 Xác định độ nhạy que thử với chế phẩm thương mại G20 Qua kết khảo sát tiến hành tạo que thử chế phẩm thương mại G20 vạch thử nghiệm M5899 vạch kiểm chứng với lượng kháng thể kháng F1 3YP8 cộng hợp với hạt nano vàng 3µl bi/que thử, lượng kháng nguyên F1 tham gia phản ứng pha loãng nồng độ 10; 2; 1; 0,5 ng/ml, thời gian cho tín hiệu vạch thử nghiệm 15 phút Kết trình bày Hình 3.19 Kết cho thấy nồng độ kháng nguyên F1 10; ng/ml cho tín hiệu vạch thử nghiệm rõ ràng, nồng độ ng/ml tín hiệu cho mờ nhạt nồng độ 0,5 ng/ml cho tín hiệu mờ khó quan sát mắt thường Như kết luận độ nhạy que thử phát F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp nằm khoảng 0,5-1ng/ml Hình 3.19: Xác định độ nhạy que thử phát F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp 1: Âm tính; 2, 3, 4, 5: Nồng độ F1 10;2;1 0,5 ng/ml 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN  Sau trình nghiên cứu, sản xuất chế phẩm IgY, có lượng 88,5 mg, hiệu giá kháng thể đạt 27.000 trứng thu ngày thứ 35 sau gây miễn dịch lần  Bước đầu xây dựng qui trình gây đáp ứng miễn dịch tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1, nhiên dòng tế bào lai thu chưa có khả sinh kháng thể mong muốn  Tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát nhanh F1 chế phẩm IgY (ngày thu trứng thứ 35) cố định vạch thử nghiệm với điều kiện tối ưu sau: + Màng in que thử màng Uni Sart CN95 + Vạch kiểm chứng in kháng thể M5899 với nồng độ kháng thể 0,5 µg/µl, đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol 10% + Vạch thử nghiệm in phun chế phẩm IgY với nồng độ kháng thể µg/µl, đệm borat pH 8,5; nồng độ isopropanol 10% + Độ nhạy que thử phát F1 tinh khiết sử dụng IgY khoảng 1020 ng/ml; thời gian thử nghiệm 15 phút  Tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát nhanh F1 chế phẩm thương mại G20 cố định vạch thử nghiệm với điều kiện tối ưu sau: + Màng in que thử màng Uni Sart CN95 + Vạch kiểm chứng in kháng thể M5899 với nồng độ kháng thể 0,5 µg/µl, đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol 10% + Vạch thử nghiệm in phun chế phẩm G20 với nồng độ kháng thể 1µg/µl, đệm phosphat pH 7,0; nồng độ isopropanol 10% + Độ nhạy que thử phát F1 tinh khiết sử dụng G20 khoảng 0,51 ng/ml; thời gian thử nghiệm 15 phút KIẾN NGHỊ  Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch tạo dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng có lực cao với kháng nguyên F1  Xác định độ đặc hiệu que thử  Xây dựng qui trình chuẩn bị mẫu 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Tuấn Đạt, Phạm Văn Hậu (2003), “Bệnh dịch hạch - dịch tễ học, giám sát phòng chống”, NXB Y Học GS.TS Lê Huy Chính (2006), “Giáo trình Vi sinh vật y học” NXB YHọc Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn (4/2015), “Nghiên cứu trình tự số gen độc lực Yersinia pestis phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định Yersinia pestis gây bệnh Việt Nam”, Tạp chí y – dược học quân Nguyễn Thị Loan (2010), Bước đầu nghiên cứu sản xuất IgG kháng dịch hạch, luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Đà Lạt Sha J, Endsley JJ, Kirtley ML, Foltz SM, Huante MB, Erova TE, Kozlova EV, Popov VL, Yeager LA, Zudina IV, Motin VL, Peterson JW, DeBord KL, Chopra AK (2011), Characterization of an F1 deletion mutant of Yersinia pestis CO92, pathogenic role of F1 antigen in bubonic and pneumonic plague, and evaluation of sensitivity and specificity of F1 antigen capture-based dipsticks, J Clin Microbiol 49(5):1708-15 Williams J.E., Gentry M.K., Broden C.A., Tyndal G.L., Altieri P.L., Berman S., Robinson D.M ,A (1988) Monoclonal antibody for the specific dianogsis of plague Bull WHO, 66, pp 77 – 82 Galyov, E E., O Y Smirnov, A V Karlishev, K I Volkovoy, A I Denesyuk,I V Nazimov, K S Rubtsov, V M Abramov, S M Dalvadyanz, and V P.Zav’yalov (1990), Nucleotide sequence of the Yersinia pestis gene encoding F1 antigen and the primary structure of the protein, FEBS Lett 277:230–232 Janssen W.A., Surgalla M.J (1969), Plague bacillus survival within host phagocytes Sciense, 163, pp 95, 952 Chanteau S, Nato F, Migliani R (2003), Interest in rapid immunochromathography tests for surveillance of characteristic diseases epidemic in developing countries: the example of plague in Madagascar, Med Trop 63: 574–576 10 Erova TE, Rosenzweig JA, Sha J, Suarez G, Sierra JC, Kirtley ML, van Lier CJ, Telepnev MV, Motin VL, Chopra AK (2013), Evaluation of protective potential of Yersinia pestis outer membrane protein antigens as possible candidates 69 for a new-generation recombinant plague vaccine, Clin Vaccine Immunol 20(2):227-38 11 WHO (2014), "Hepatitis B", Fact sheet N0 204, Updated June 2014 12 Roseanu, A., Jecu, L., Badea, M., Evans, R.W (2010) Mycotoxins: An overview on their quantification methods Rom.J.Biochem 47-1 79-86 13 Brendan, O.F (2009) Evolution in Lateral Flow–Based Immunoassay Systems - Lateral Flow Immunoassay (book) 14 Beesley ED, Brubaker RR, Janssen WA, Surgalla MJ (1967) Pesticins Expression of coagulase and mechanism of fibrinolysis J Bacteriol 94: 19–26 15 Singer JM and Plotz CM (1956) The latex fixation test I Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis Am J Med 21:888 16 Von Lode P (2005) Point-of-care immunotesting: approaching the analytical performance of central laboratory methods Clin Biochem 38(7):591-606 Review 17 Posthuma-Trumpie, G.A., Korf, J., Amerongen, Aart van (2009) Lateral flow immunoassay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats A literature survey Anal Bioanal Chem 393:569–582 18.Schade, R (1996) Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects ALTEX 13 19 Polson, A., Coetzer, T., Kruger, J., vonMaltzahn, E & vanderMerwe, K.J Immunol Invest.14, 323 (1985) 20.http://www.baoxaydung.com.vn/news/vn/suc-khoe/benh-dich-hach-trenthe-gioi-va-viet-nam.html 21 Splettstoesser WD, Rahalison L, Grunow R, Neubauer H, Chanteau S Evaluation of a standardized F1 capsular antigen capture ELISA test kit for the rapid diagnosis of plague FEMS Immunol Med Microbiol 2004 Jun 1;41(2):149-55