Độc tố aflatoxin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Đề tài: ĐỘC TỐ AFLATOXIN Thành viên nhóm: Nguyễn Xuân Đông (08126041) Trương Thị Thu Hà (08126054) Báo Thị Xuân Hương (09126282) Võ Thị Mỹ Lợi (08126117) Huỳnh Thị Nhân (08126144) Nguyễn Thị Thu Trang (08126231) Tp Hồ Chí Minh, ngày 25/09/2010 Lời mở đầu Aflatoxin nhóm chất độc mạnh hình thành tự nhiên Chúng bao gồm họ độc tố sinh từ nấm Aspergillus flavus Aspergillus paraticu Do khí hậu nóng ẩm phù hợp cho điều kiện phát triển mà loại nấm tìm thấy nhiều khắp nơi Việt Nam Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho thể Trong nhiều loại aflatoxin tự nhiên aflatoxin B1 coi chất độc nguy hiểm Mặt dù diện aspergillus flavus lúc gắn liền với việc tồn aflatoxin với hàm lượng gây độc, thể nguy lớn việc nhiễm aflatoxin Do việc kiểm sốt dư lượng aflatoxin cần thiết quan trọng Nội dung: I Giới thiệu aflatoxin Nguồn gốc Đặc điểm cấu tạo hóa học Tác hại Chỉ tiêu gây độc II Phương pháp kiểm nghiệm Aflatoxin III Biện pháp phòng chống Aflatoxin I Giới thiệu aflatoxin vi nấm sản sinh aflatoxin 1.Nguồn gốc: Aflatoxin độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên số lồi Aspergillus Trong đó, đáng ý Aspergillus flavus (A.flavus) Aspergillus parasiticus(A.parasiticus) thường có hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ,gừng) loại khác hạt dẻ, dừa…, loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin ngũ cốc (ngơ, kê, lúa miến, gạo, lúa mì) Aflatoxin xuất sữa động vật cho ăn thức ăn nhiễm aflatoxin Phân biệt: Chủng Màu quần thể Hình dáng Đặc điểm riêng Độc tố A.flavus Vàng xám xanh đến màu oliu xanh Phẳng mượt đến xù xì, kích thước thay đổi Rộng, hình cầu B1 B2 A.parasiticus Màu vàng xanh đậm A.flavus Hơi xù xì, thay đổi chút kích thước Rộng, hình cầu, phổ biến A.flavus B1, B2, G1 G2 Quần thể A.flavus Quần thể A.parasiticus Đặc điểm cấu tạo hóa học: Có 16 loại Aflatoxin, có loại Aflatoxin chính: Aflatoxin B1: Aflatoxin G1: Aflatoxin B2: Aflatoxin G2: Đặc điểm: Tinh thể trắng, bền với nhiệt, khó bị phân hủy bền với men tiêu hóa, khơng bền ánh sáng mặt trời tia tử ngoại Tác hại: Độc tố gây tổn thương gan, thận, mật, làm giảm khả tiết sữa, đẻ trứng sức đề kháng gia súc, gia cầm Aflatoxin tích lũy mơ, chủ yếu mơ gan, gây nhiễm độc cho người ăn thịt loại gia cầm, gia súc này, tạo nên dây chuyền sinh học mầm bệnh Sự nguy hiểm Aflatoxin B1 chỗ có khả gây hại với liều lượng nhỏ, kg thức ăn cần nhiễm miligam đủ làm hỏng gan  Độc tính động vật thí nghiệm Nhiễm độc aflatoxin gây loạt triệu chứng cấp tính mãn tính Nhiễm độc cấp tính biểu chết động vật thí nghiệm với triệu chứng thường gặp hoại tử nhu mô gan, chảy máu gan viêm cầu thận cấp Nhiễm độc mãn tính thường biểu ăn ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu hoại tử nhu mơ Loại mãn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với kiểu gây ung thư, gây quái thai gây đột biến  Độc tính aflatoxin người Bệnh nhiễm aflatoxin cấp tính với biểu chủ yếu suy chức gan cấp, xơ gan hoại tử nhu mô gan Theo tổ chức bệnh Ung thư Quốc tế, aflatoxin xếp vào danh sách tác nhân gây ung thư cho người Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả tác động lên tế bào gan aflatoxin qua giai đoạn: - Tác động qua lại với AND ức chế polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND ARN - Ngừng tổng hợp AND - Giảm tổng hợp AND ức chế tổng hợp ARN truyền tin - Biến đổi hình thái nhân tế bào - Giảm tổng hợp protein Hậu q trình tác động sinh hóa lên tế bào gan gây ung thư biểu mô tế bào gan Aflatoxin đồng phơi nhiễm với virus viêm gan B (HBV) làm tăng nguy ung thư lên 60 lần Chỉ tiêu gây độc:  Quy định Hoa Kỳ: FDA đưa mức khuyến cáo hàm lượng aflatoxin thực phẩm thức ăn chăn nuôi nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng sức khoẻ động vật Các giới hạn tối đa:  y Tiêu chí Hàm lượng, ppb Đối với ngơ loại hạt dùng cho vật nuôi (kể gia cầm) chưa trưởng thành vật nuôi cho sữa dùng cho mục đích khác khơng cơng bố; thức ăn chăn nuôi ngoại trừ ngô bột từ hạt bong 20 Đối với ngô loại hạt dùng cho giống vật ni (bị, lợn) gia cầm trưởng thành 100 Đối với ngô loại hạt dùng cho lợn thịt từ 100 pound trở lên 200 Đối với ngơ loại hạt dùng cho bị giai đoạn cuối (ví dụ vỗ béo) bột hạt bơng dùng cho bị, lợn gia cầm 300 Qu định Việt Nam: Các giới hạn tối đa (ML) theo quy định Bộ Y tế Việt Nam sau: Tiêu chí ML (microgam/kg) Đối với Aflatoxin B1 thực phẩm nói chung Đối với Aflatoxin B1, B2, G1, G2 thực phẩm nói chung 15 Đối với Aflatoxin M1 sữa sản phẩm sữa 0,5 II Kỹ thuật kiểm nghiệm Aflatoxin: Để phát định lượng aflatxin, có loại phương pháp: - Phương pháp sinh học: + Dựa vào tác dụng sinh học aflatoxin số loài sinh vật (vịt con, gà con, chuột nhắt, chuột bạch, phôi gà, khỉ, chó, ấu trùng giáp xác, tế bào nấm, vi khuẩn Bacillus megaterium…) - Phương pháp lý - hóa: + Dựa vào tác dụng lý hóa aflatoxin Thường dùng kỹ thuật sắc ký để phát định lượng như: sắc ký mỏng, sắc ký cột nhỏ, sắc ký khí hay sắc ký lỏng cao áp - Phương pháp miễn dịch học: + Dựa vào kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt Sau đó, ta sử dụng kiểm tra thêm chất định màu Cường độ màu sắc định có độc tố hay khơng Trang bị tương tự "ELISA test" (có thể thực phép thử miễn dịch liên kết enzym) hay phương pháp miễn dịch học phóng xạ (RIA: Radio - Immuno Assay) Bảng đánh giá phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin: Phương pháp Khả ứng dụng Độ tin cậy Giới hạn phát Giá thiết bị Khả tự động hóa Sinh học Hạn chế Thấp Cao Thấp Không Sắc ký cột nhỏ Hạn chế Trung bình Trung bình Thấp Khơng Sắc ký mỏng Rộng cao Thấp Thấp Không Sắc ký lỏng cao áp Rộng cao Thấp Cao Bộ phận Sắc ký khí Hạn chế Cao Thấp Cao Bộ phận ELISA Hạn chế Chưa biết Thấp Thấp Có RIA Hạn chế Chưa biết Thấp Cao Có Định lượng aflatoxin phương pháp sắc ký (SK) mỏng Ưu nhược điểm: - Cô đặc cột với nồng độ thấp, loại bỏ tạp chất ảnh hưởng - Thời gian tiến hành nhanh - Độ nhạy cao, thiết bị đơn giản hóa chất - Phụ thuộc vào người phân tích Nguyên lý: - Aflatoxin chiết tách từ mẫu thử Chloroform Dịch chiết lọc phần dịch lọc làm qua cột silicagen Làm bay dung dịch rửa giải hoà cặn với Chloroform hỗn hợp benzen – axetonitril Sau chấm phần xác định mẫu thử lên mỏng,chạy sắc ký so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn đèn tử ngoại có bước sóng 365nm Lượng aflatoxin xác định mắt hay máy đo mật độ huỳnh quang Thiết bị hóa chất a Thiết bị: - Máy nghiền mẫu, máy lắc, máy cất quay chân khơng - Đèn tử ngoại bước sóng 365 nm - Quang phổ kế UV-VIS, máy đo mật độ huỳnh quang - Các trang bị sắc ký lớp mỏng - Cột sắc ký - Micropipet Hamilton:20 m l, 50 m l - Dụng cụ thủy tinh cần thiết - Bản mỏng kích thước 20 x 20 cm tráng sẵn lớp mỏng Silicagel 60-G -… b Hóa chất: - Hóa chất phải tinh khiết + Acetonitril, Methanol, Benzen, Axit Sunfuric 50%,… + Dung dịch:chloroform/acetone: 9/1 ; Benzen/aceton nitril: 98/2… + Dung dịch Aflatoxin chuẩn + Các hóa chất cần thiết khác 4.Quy trình thực hiện: - Chiết suất mẫu - Làm mẫu cột sắc ký - Sắc ký lớp mỏng chiều - Thử nghiệm khẳng định có mặt aflatoxin  Chuẩn bị cột Silicagel: - Cho bơng vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan Đổ Chloroform đến 2/3 cột, sau vừa cho 10 g silicagel vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí Mở khố cho Chloroform chảy xuống từ từ Khi tốc độ lắng silicagel chậm lại, rút hết Chloroform để lại lớp 5cm phía lớp silicagel Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau rút bớt Chloroform đến gần sát lớp natri sunfat khan - Cột silicagel thu phải mịn, khơng có bọt khí ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan  Tiến hành: - Cân 50g mẫu nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 50ml Chloroform, đậy nút chặt Lắc 30 phút máy lắc lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 0ml dịch lọc đầu, sau lấy 50ml dịch lọc (tương đương 10g mẫu thử) Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Bucher có chứa lớp celite 545 dày 5mm giấy lọc lọc hút chân không - Trộn 50ml dịch lọc với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký chuẩn bị Loại bỏ dung dịch chảy Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng – 12ml /phút - Dung dịch rửa giải aflatoxin 150ml hỗn hợp metanol – chloroform (3 : 97) Lấy toàn dịch chảy từ bắt đầu cho dung dịch rửa giải hết Lưu lượng dòng chảy Làm bay dung dịch rửa máy cất quay chân không nhiệt độ thấp 50o C khoảng – ml Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu chloroform làm bay đến khô nồi cách thuỷ nhiệt độ thấp 50o C, tốt luồng khí nitơ nhẹ cặn lại ống nghiệm mẫu phân tích Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng Định lượng Aflatoxin: - Hoà cặn thu 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) lấy dịch để chấm lên sắc ký - Với mỏng tráng sẵn trước chấm sắc ký phải cạo lớp silicagel hai cạnh bên sắc ký với chiều rộng 0,5cm Sau cách cạnh đáy cm, dùng mao quản hay micropipet chấm vết dung dịch chuẩn dung dịch mẫu thử theo thứ tự từ trái sang phải sau: + chấm mẫu: 2, 5, 10l + nội chuẩn: 10l mẫu 10l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) + chấm chuẩn: 10, 5, 2l chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) - Khai triển sắc ký chỗ tối với hệ dung môi chloroform – axeton (9: 1) Sau tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy sắc ký để bay dung mơi nhiệt độ phịng, tránh ánh sáng Đọc kết quả: - Soi đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm Nếu mẫu thử có aflatoxin xuất vết giá trị Rf với vết aflatoxin chuẩn - Phun dung dịch axit sunfuric 50% lên sắc ký, huỳnh quang vết aflatoxin chuyển sang màu vàng tia tử ngoại có bước sóng 365nm - Bước sóng kích thích 365nm bước sóng phát xạ 443 nm Định lượng aflatoxin chấm dịch chiết cách so sánh mật độ huỳnh quang vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang vết dung dịch chuẩn, chọn thể tích X l mẫu có độ phát sáng S l chuẩn  Tính tốn nồng độ Alatoxin B1 có mẫu : S Y V X W Trong S : thể tích Aflatoxin chuẩn có độ sáng X l mẫu Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5g/ml 0,5ppm) V : thể tích hồ cặn (200 l) X : Thể tích mẫu có độ sáng S l chuẩn W : số gam mẫu qua cột (1g) Chú ý: - Độ nhạy: ppm - Hệ số thu hồi: 90% - Sai số trung bình: 10% Chú ý an toàn tiếp xúc với Aflatoxin : - Đeo găng tay làm thí nghiệm - Các vết Aflatoxin phải dược lau nước javen 10% - Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa tiếp xúc với Aflatoxin phải dược ngâm nước javen 10% tối thiểu 30 phút trước rửa III.Biện pháp phòng chống độc tố aflatoxin Aflatoxin độc tố bền vừng với nhiệt Vì biện pháp đun sơi thường khơng có tác dụng độc tố Ðể đề phòng ngộ độc, biện pháp tốt bảo quản tốt loại LTTP, chủ yếu thực phẩm thực vật - Với lương thực gạo, ngơ, mì: u cầu bảo quản giữ khơ, thống mát để không bị nhiễm mốc - Với thực phẩm thực vật khô lạc, vừng, cà phê thực phẩm dễ hút ẩm dễ mốc Muốn bảo quản tốt cần phơi khô, giữ nguyên vỏ đựng dụng cụ kín Nếu để lâu, phải đem phơi khô lại Yêu cầu độ ẩm hạt 15% - Với nước chấm xì dầu, tương: theo kết gần đây, độ nhiễm Aflatoxin nước chấm đáng lo ngại Vì việc kiểm tra vệ sinh xí nghiệp sản xuất nước chấm cửa hàng mua bán cần thiết phải tiến hành thường xuyên Nội dung kiểm tra cần làm là: + Kiểm tra vệ sinh mơi trường (chủ yếu khơng khí) + Kiểm tra vệ sinh nước chấm - Ngoài tiêu vệ sinh qui định cho mẫu nước chấm mẫu khơng khí, cịn phải ý phát có mặt chủng nấm sinh độc tố Aspergillus flavus, parasiticus