Luận văn thạc sĩ sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme manganese peroxidase có khả năng phân hủy độc tố aflatoxin b1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHẠM NHƢ QUỲNH SÀNG LỌC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME MANGANESE PEROXIDASE CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, 2022 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  PHẠM NHƢ QUỲNH SÀNG LỌC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME MANGANESE PEROXIDASE CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Khá Thái Nguyên, 2022 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu hướng dẫn thầy giáo: TS Trịnh Đình Khá Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cá nhân tập thể ghi nhận lời cảm ơn Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2022 Học viên Phạm Nhƣ Quỳnh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, Phịng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Trân trọng cảm ơn TS Trịnh Đình Khá dành nhiều thời gian bảo cho kiến thức kinh nghiệm quý báu, giúp tơi hồn thiện đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn cán bộ, giảng viên trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên trường Đại học Thủy lợi tổ chức cá nhân, đoàn thể, em sinh viên giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu, khảo sát, thu thập liệu liên quan đến đề tài Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Giáo dục Đào tạo ―Nghiên cứu tạo enzyme manganese peroxidase tái tổ hợp có hoạt tính phân hủy độc tố nấm mốc aflatoxin B1‖ Mã số: B2020-TNA-14 Trong q trình thực đề tài, tơi ln nghiêm túc cố gắng hết mình, nhiên chắn khơng thể tránh khỏi thiếu sót Kính mong nhận ý kiến đóng góp nhà Khoa học, Chuyên gia, Thầy, Cô giáo đồng nghiệp để đề tài hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng 11 năm 2022 Tác giả luận văn Phạm Nhƣ Quỳnh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme Manganese peroxidase .4 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu trúc tính chất 1.1.3 Cơ chế xúc tác 1.1.4 Enzyme MnP oxy hóa có chứa hợp chất phenolic hợp chất nonphenolic 1.2 Vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase 1.2.1 Nấm .7 1.2.2 Vi khuẩn 1.2.3 Xạ khuẩn .10 1.3 Aflatoxin phƣơng pháp khử độc tố Aflatoxin 11 1.3.1 Độc tố Aflatoxin 11 1.3.2 Khử độc tố phương pháp phi sinh học 19 1.3.3 Khử độc tố phương pháp sinh học .23 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu .27 2.1.1 Mẫu vật Chủng vi sinh vật .27 2.1.2 Thiết bị 27 2.2 Hóa chất 28 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .28 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu đất 28 v 2.3.2 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật 28 2.3.3 Phương pháp sàng lọc chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase .29 2.3.4 Tuyển chọn số chủng vi sinh vật sinh enzyme Manganese peroxidase lớn 30 2.3.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật 31 2.3.6 Khảo sát số yếu tổ ảnh hướng đến sinh tổng hợp enzyme MnP chủng nấm Pl3 31 2.3.7 Khảo sát khả phân hủy độc tố Aflatoxin enzyme Manganese peroxidase .32 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Phân lập, sƣu tập nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật 34 3.1.1 Phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất .34 3.1.2 Các chủng vi sinh vật phân lập từ số mẫu thực phẩm .36 3.1.3 Sưu tập số chủng nấm 37 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp MnP 39 3.2.1 Định tính hoạt tính MnP .39 3.2.2 Định lượng hoạt độ MnP ngoại bào 41 3.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp enzyme MnP chủng nấm Pl3 42 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 42 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ Glucose 42 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 44 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ pH 46 3.4 Khả phân hủy độc tố Aflatoxin enzyme MnP từ chủng Pl3 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 Kết luận .49 Kiến nghị .49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB1 aflatoxin B1 CTAB Đệm cetyltrimethyl ammonium bromide EtBr Ethidium bromide LB Luria Bertani MnP Manganese peroxidase PDA Potato Dextrose Agar vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tính chất lý – hóa chủ yếu aflatoxin .16 Bảng 1.2: Giới hạn aflatoxin số nước theo tiêu chuẩn FDA 18 Bảng 1.3: Quy định độc tố aflatoxin B1 aflatoxin tổng số Việt Nam 19 Bảng 1.4: Hàm lượng Afllatoxin sau xử lý Metylamin xử lý nhiệt đơn giản 22 Bảng 2.1: Thiết bị sử dụng trình nghiên cứu 27 Bảng 3.1: Kết phân lập chủng vi sinh vật từ 03 mẫu đất 35 Bảng 3.2: Một số đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật từ mẫu thực phẩm 36 Bảng 3.3: Một số đặc điểm hình thái 08 chủng nấm sưu tập 38 Bảng 3.4: Kích thước vịng hoạt tính MnP chủng vi sinh vật mơi trường chọn lọc .41 Bảng 3.5: Hoạt độ enzyme MnP 41 Bảng 3.6: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 thời gian nuôi cấy 42 Bảng 3.7: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ Glucose 43 Bảng 3.8: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ NH4NO3 45 Bảng 3.9: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ pH 47 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử vị trí hoạt động MnP Hình 1.2: Chu trình xúc tác MnP Hình 1.3: Nấm Aspergillus flavus nấm Aspergillus parasiticus 12 Hình 1.4: Cấu trúc loại Aflatoxin 14 Hình 1.5: Đường cong hấp thụ UV aflatoxin B1, G1 G1 15 Hình 1.6: Chuyển hóa Aflatoxin B1 thành hydroxi-dihydro-aflatoxin B1 aflatoxin Ro 25 Hình 3.1: Hình ảnh chủng vi sinh vật phân lập môi trường LB 34 Hình 3.2: Hình ảnh 05 chủng vi sinh vật phân lập 03 mẫu đất khu vực thành phố Thái Nguyên 35 Hình 3.3: Khuẩn lạc 03 chủng vi sinh vật phân lập Nem chua (NC), Nato (NT), Tương (T-3) 36 Hình 3.4: Hình thái số chủng nấm sưu tập 37 Hình 3.5: Hình thái hệ sợi số chủng nấm 39 Hình 3.6: Sàng lọc chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme Manganese peroxidase mơi trường chọn lọc có bổ sung guaiacol 40 Hình 3.7: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ Glucose .43 Hình 3.8: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ NH4NO3 44 Hình 3.9: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ pH 46 Hình 3.10: Hình ảnh chạy TLC mẫu thử phân hủy aflatoxin B1 47 ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Kích thước vịng hoạt tính MnP nồng độ Glucose (cm) .43 Biểu đồ 3.2: Kích thước vịng hoạt tính MnP nồng độ NH4NO3 (cm) 45 Biểu đồ 3.3: Kích thước vịng hoạt tính MnP nồng độ pH (cm) .46 42 Kết nghiên cứu phù hợp với phát Nguyễn Đức Huy cộng (2017) hoạt tính manganese peroxidase cao chủng nấm Fusarium sp môi trường rơm rạ dăm gỗ 1,76 U/mL vào ngày 1,91 U/mL vào ngày 12 [27] Hoạt tính tối đa MnP tinh khiết đạt 64 chủng nấm Phanerochaete chrysosporium 0,5 U/mL 500 U/L, sau bắt đầu giảm [30] Như vậy, chủng Pl3 có tiềm sản xuất enzyme MnP lựa chọn nghiên cứu 3.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp enzyme MnP chủng nấm Pl3 3.3.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Tiến hành khảo sát khoảng thời gian kéo dài từ đến 15 ngày Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 thời gian nuôi cấy Thời gian (ngày) Hoạt tính MnP (U/ml) 12 15 0,653 ± 0,05 1,228 ± 0,04 1,593 ± 0,04 1,351 ± 0,07 1,156 ± 0,04 Kết cho thấy chủng nấm bắt đầu sinh tổng hợp MnP sau ngày nuôi cấy (0,653 U/ml) đạt cực đại sau ngày (1,593 U/ml) Do đó, ngày thời gian chọn cho khảo sát 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ Glucose Trong sinh trưởng vi sinh vật, glucose nguồn carbon thường chọn để bổ sung vào mơi trường ni cấy Do đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose lên sinh tổng hợp MnP chủng nấm với nồng độ kéo dài từ 1%, 2%, 3%, 4% đến 5% 43 1% 4% 3% 2% 5% Hình 3.7: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ Glucose Kích thước vịng hoạt tính MnP (cm) (1%; 2%; 3%; 4%; 5%) 2,44 2,42 2,40 2,38 2,36 2,34 2,32 2,30 2,28 2,26 2,42 2,38 2,37 2,37 2,32 Nồng độ Glucose (%) Biểu đồ 3.1: Kích thƣớc vịng hoạt tính MnP nồng độ Glucose (cm) Kết hình 3.7 biểu đồ 3.1 cho thấy, nồng độ Glucose ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme MnP Nồng độ Glucose có hoạt tính MnP mạnh 3% với vịng chuyển hóa chất đạt 2,42 cm sau 72h thử Nồng độ Glucose giảm (dưới 2%) tăng (trên 4%) vòng chuyển hóa chất giảm Bảng 3.7: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ Glucose Nồng độ (%) Hoạt tính MnP (U/ml) 1,277 ± 0,05 1,598 ± 0,07 1,693 ± 0,04 1,252 ± 0,05 1,052 ± 0,06 44 Enzyme thu nhận sau ngày ni cấy phân tích hoạt tính MnP Kết thể hình 3.7, biểu đồ 3.1 bảng 3.7 Kết bảng 3.7 cho thấy nồng độ glucose 3% cho hoạt tính MnP cao đạt giá trị 1,693 U/ml Khi nồng độ Glucose giảm (nhỏ 2%) hoạt tính MnP giảm, nồng độ 1% hoạt tính MnP giảm 24,57%, nồng độ 2% nồng độ giảm 0,05% so với nồng độ 3% Khi nồng độ glucose tăng (lớn 4%) hoạt tính MnP giảm, nồng độ 4%, hoạt tính MnP giảm 26,04%, 5% giảm 37,86% so với nồng độ 3% Theo kết khảo sát này, nồng độ glucose thích hợp cho sinh tổng hợp MnP chủng Pl3 2-3% 3.3.3 Ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 Theo nghiên cứu trước, nguồn nitrogen có khả làm tăng khả sinh tổng hợp hệ enzyme lignin chủng nấm đảm [7], [8] Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ NH4NO3 (0,1; 0,5; 1; 2; g/L) môi trường nuôi cấy Mẫu thu sau ngày nuôi để phân tích hoạt tính MnP Ảnh hưởng NH4NO3 lên trình sinh tổng hợp MnP thể Hình 3.8; Biểu đồ 3.2; Bảng 3.8) g/l 0,5 g/l 0,1 g/l g/l Hình 3.8: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ NH4NO3 (0,1 g/l; 0,5 g/l; g/l; g/l; g/l) g/l Kích thước vịng hoạt tính MnP (cm) 45 2,38 2,40 2,35 2,32 2,30 2,28 2,27 2,25 2,20 2,18 2,15 2,10 2,05 0,1 0,5 Nồng độ NH4NO3 (g/l) Biểu đồ 3.2: Kích thƣớc vịng hoạt tính MnP nồng độ NH4NO3 (cm) Kết hình 3.8 biểu đồ 3.2 cho thấy, nồng độ NH4NO3 có xu hướng tăng dần từ 0,1 g/l đến g/l với vịng chuyển hóa chất lớn thấp 2,18 cm, cao đạt 2,38 cm sau 72h thử Bảng 3.8: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ NH4NO3 Nồng độ (g/l) 0,1 0,5 Hoạt tính MnP (U/ml) 0,890 ± 0,04 1,320 ± 0,07 1,148 ± 0,03 1,033 ± 0,05 1,983 ± 0,04 Kết từ bảng 3.8 cho thấy xu hướng tăng lên hoạt tính MnP nồng độ NH4NO3 tăng từ 0,1 đến 5g/L, hoạt tính đạt giá trị cao nồng độ NH4NO3 5g/L 1,983 U/mL (tăng 24% so với mẫu đối chứng) Như vậy, nồng độ NH4NO3 tốt cho sinh tổng hợp MnP chủng Pl3 nghiên cứu g/L 46 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ pH Tiến hành khảo sát nồng độ pH môi trường nuôi cấy Mẫu thu sau ngày nuôi để phân tích hoạt tính MnP Kết biểu hình 3.9; biểu đồ 3.3; bảng 3.9 pH9 pH7 pH5 pH8 pH6 Kích thước vịng hoạt tính MnP (cm) Hình 3.9: Vịng hoạt tính MnP chủng Pl3 nồng độ pH 2,5 2,6 2,43 2,33 2,08 1,97 1,5 0,5 pH pH pH Nồng độ pH pH pH Biểu đồ 3.3: Kích thƣớc vịng hoạt tính MnP nồng độ pH (cm) Kết hình 3.9 biểu đồ 3.3 cho thấy, nồng độ Ph ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzyeme MnP chủng Pl3 Nồng độ pH có hoạt tính mạnh nhất, với vịng chuyển hóa chất 2,6cm Khi pH mơi trường ni cấy thấp (dưới pH 6) hoạt tính MnP giảm Tương tự, pH mơi trường ni cấy tăng (trên pH 8) hoạt tính MnP giảm 47 Bảng 3.9: Hoạt độ enzyme MnP chủng Pl3 nồng độ pH Nồng độ Hoạt tính MnP (U/ml) 0,098 ± 0,04 1,152 ± 0,04 2,035 ± 0,04 1,125 ± 0,04 0,600 ± 0,04 Kết từ bảng 3.9 cho thấy hoạt tính MnP nồng độ pH cao đạt giá trị 2,035 U/mL (tăng 27% so với mẫu đối chứng) Khi nồng độ pH giảm (dưới pH 6) tăng (trên pH 8), hoạt tính emzyme MnP có xu hướng giảm, pH giảm 43%, pH giảm 95,18%, pH giảm 44,71%, pH giảm 70% so với hoạt tính enzyme pH 3.4 Khả phân hủy độc tố Aflatoxin enzyme MnP từ chủng Pl3 Để khảo sát khả phân hủy độc tố aflatoxin B1 enzyme MnP chủng Pl3, dịch enzyme thô sau 10 ngày nuôi cấy thu hồi nhờ ly tâm lọc qua màng lọc vi khuẩn Dịch enzyme ủ với aflatoxin B1 theo phương pháp mô tả Sau 72h ủ, enzyme bất hoạt aflatoxin B1 tách chiết phát kỹ thuật TLC Kết cho thấy vệt băng aflatoxin B1 sắc ký mẫu thí nghiệm (TN) có xử lý ủ với enzyme MnP mờ so với mẫu kiểm tra (KT) TLC Điều chứng tỏ aflatoxin B1 mẫu thí nghiệm bị enzyme MnP từ chủng Pl3 phân hủy KT TN Hình 3.10: Hình ảnh chạy TLC mẫu thử phân hủy aflatoxin B1 KT: Mẫu chứng enzyme không hoạt động; TN: mẫu thử enzyme MnP hoạt động 48 Một số nghiên cứu chứng minh khả phân hủy chủng nấm sò trắng có khả phân hủy độc tố AFB1 Khả giải độc MnP aflatoxin B1 cho thấy sau 24 giờ, mức độ AFB1 giảm xuống 67% với có mặt enzyme 1,5 U.mL-1 khả giải độc tối đa (90%) đạt sau 48 nồng độ enzyme 1,5 U.mL-1 [8] Kết phù hợp với phát Ramy Sayed Yehia, khả giải độc cao (90%) chủng Pleurotus ostreatus quan sát thấy sau 48 ủ hoạt tính enzym 1,5 U.mL-1 [66] 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút kết luận sau: Đã phân lập chủng vi khuẩn sưu tập chủng nấm Xác định số đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập chủng nấm sưu tập Đã xác định 06 chủng nấm 04 chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme MnP Chủng Pl3 có khả sinh tổng hợp MnP mạnh số chủng vi sinh vật phân lập sưu tập, với giá rị 1,597 U/ml Đã khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme MnP chủng nấm Pl3 Đã khảo sát xác định enzyme MnP chủng Pl3 có hoạt tính phân hủy độc tố aflatoxin B1 Kiến nghị Tinh enzyme MnP chủng Pl3 nhân dịng, biểu gene mã hóa MnP chủng Pl3 để chủ động sản xuất enzyme Tối ưu hóa sản xuất enzyme MnP quy mơ hệ lên men L lớn nhằm tăng khả sản xuất enzyme tái tổ hợp 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Minh Quang, Lê Hoài Diễm Phương, Lương Bảo Uyên (2017) Nghiên cứu tăng khả sinh tổng hợp manganese peroxidase (MnP) nấm Phanerochaete chrysosporium bước đầu ứng dụng để phân hủy glyphosate VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 33(2S) Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Sinh enzim ngoại bào peroxidaza, laccaza phân hủy hợp chất vòng thơm chủng xạ khuẩn xkbh1 Vietnam Journal of Science and Technology, 50(3), 285 Nguyễn Vũ Mai Linh, Trần Thị Hương cộng (2021) Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn ưa nhiệt có khả phân hủy lignin từ mẫu mùn thu nhận Nhà máy giấy Bãi Bằng Tạp trí cơng thương Phạm Thị Ngọc Lan (2012), Thực tập Vi sinh vật, NXB Đại học Huế Bộ Y tế (2010) QCVN số 8-1:2011/BYT Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia vệ sinh an toàn thực phẩm biên soạn, Cục An tồn vệ sinh thực phẩm trình duyệt ban hành theo Thông tư số 02 /2011/TT-BYT ngày 13 tháng 01 năm 2010 Bộ trưởng Bộ Y tế Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007) Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng Penicillium sp DTQ-HK1 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5, tr 355-362 Tài liệu tiếng nƣớc Abdel-Hamid AM, Solbiati JO, Cann IK (2013) Insights into lignin degradation and its potential industrial applications Advances in Applied Microbiology, 82: Elsevier; p 1-28 A Ginterová, M Polster & O Janotková (1980) The relationship betwen Pleurotus ostreatus and Aspergillus flavus and the production of aflatoxin Folia Microbiologica, 25, 332–336 51 Baborová P, Möder M, Baldrian P, Cajthamlová K, Cajthaml T (2006) Purification of a new manganese peroxidase of the white-rot fungus Irpex lacteus, and degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by the enzyme Research in Microbiology, 157(3), 53-248 10 Bao W, Fukushima Y, Jensen Jr KA, Moen MA, Hammel KE (1994) Oxidative degradation of non-phenolic lignin during lipid peroxidation by fungal manganese peroxidase FEBS letters, 354(3), 297-300 11 Bagley, E.B (1979) Decontamination of com containing aflatoxin by treatment with ammonia Journal of the American Oil Chemists' Society 56 (9), 808-811 12 Blount, W.P (1961) Turkey ―X‖ Disease J Br Turkey, 9, 55–58 13 Carmona-Ribeiro AM, Prieto T, Nantes IL (2015) Nanostructures for peroxidases Frontiers in Molecular Biosciences, 2, 50 14 Chen, R., Ma, F., Li, P.W., Zhang, W., Ding, X.X., Zhang, Q., Li, M., Wang, Y.R., Xu, B.C (2014) Effect of ozone on aflatoxins detoxification and nutritional quality of peanuts Food Chem, 146, 284-268 15 C W Hesseltine, O L Shotwell, J J Ellis, R D Stubblefield (1966) Aflatoxin formation by Aspergillus flavus ASM Journals, 30(4) 16 De Alencar, E.R., Faroni, L.R.D.A., Soares, N., de, F.F., da Silva, W.A., da Silva Carvalho, M.C (2012) Efficacy of ozone as a fungicidal and detoxifying agenet of aflatoxins in peanuts J Sci Food Agric, 92 (4), 899-905 2186 - 2190 17 Diao, E Hou, H., Chen, B., Shan, C., Dong, H (2013) Ozonolysis efficiency and safety evaluation of aflatoxin B in peanuts Food Chem Toxicol, 55, 519-525 18 Dourado VZ, Godoy I (2004) Recondicionamento muscular na DPOC: principais intervenỗừes e novas tendências Revista brasileira de medicina esporte, 10(4), 4331 19 Dunford H, Stillman J (1976) On the function and mechanism of action of peroxidases Coordination chemistry reviews, 19(3), 187-251 20 Ghanem, I, Orfi, M, Shamma, M (2008) Effect of gamma radiation on the inactivation of aflatoxin B1 in food and fed crops Braz J Microbiol 39 (4), 787-791 52 21 Glenn JK, Gold MH (1985) Purification and characterization of an extracellular Mn (II)-dependent peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete, Phanerochaete chrysosporium Archives of biochemistry and biophysics, 242(2), 41329 22 Grgic I, Podgornik H, Berovic M, Perdih A (2001) Improvements in the determination of Manganese peroxidase activity Biotechnol Lett, 23:1039–1042 23 Hammel KE, Jensen KA, Mozuch MD, Landucci LL, Tien M, Pease EA (1993) Ligninolysis by a purified lignin peroxidase Journal of Biological Chemistry, 268(17), 81-12274 24 Hatakka A (1994) Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi: production and role from in lignin degradation FEMS microbiology reviews, 13(2-3), 35-125 25 Hatakka A, Lundell T, Hofrichter M, Maijala P (2003.) Manganese peroxidase and its role in the degradation of wood lignin ACS Publications 26 Hofrichter M (2002) Lignin conversion by manganese peroxidase (MnP) Enzyme and Microbial technology, 30(4), 66-454 27 Huy ND, Tien NTT, Huyen LT, Quang HT, Tung TQ, Luong NN, et al (2017) Screning and Production of Manganese Peroxidase from Fusarium sp on Residue Materials Mycobiology, 45(1), 6-52 28 International Agenecy for Research on Cancer Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum, 2002, 82: 1–556 29 Janusz G, Kucharzyk KH, Pawlik A, Staszczak M, Paszczynski AJ (2013) Fungal laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase: gene expression and regulation Enzyme and Microbial technology, 52(1), 1-12 30 Kapich A, Prior B, Botha A, Galkin S, Lundell T, Hatakka A (2004) Effect of lignocellulose-containing substrates on production of ligninolytic peroxidases in submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium ME-446 Enzyme and Microbial technology, 34(2), 95-187 53 31 Kapich AN, Steffen KT, Hofrichter M, Hatakka A (2005) Involvement of lipid peroxidation in the degradation of a non-phenolic lignin model compound by manganese peroxidase of the litter-decomposing fungus Stropharia coronilla Biochemical and biophysical research communications, 330(2), 7-371 32 Kumar A, Chandra R (2020) Ligninolytic enzymes and its mechanisms for degradation of lignocellulosic waste in environment Heliyon, 6(2), 3170 33 Kuwahara M, Glenn JK, Morgan MA, Gold MH (1984) Separation and characterization of two extracelluar H2O2‐ dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium FEBS letters,169(2), 50-247 34 Lancaster, M.C.; Jenkins, F.P.; Philp, J.M (1961) Toxicity Associated with Certain Samples of Groundnuts Nature, 192, 1095–1096 35 Le, J., Her, J.Y, Le, K.G (2015) Reduction of aflatoxins (B1, B2, G1, and G2) in soybean-based model systems Food Chem 189, 45-51 36 Li L, Li XZ, Tang WZ, Zhao J, Qu YB (2008) Screning of a fungus capable of powerful and selective delignification on wheat straw Letters in applied microbiology, 47(5), 20-415 37 Loosmore, R.M.; Harding, J.D.J (1961) A Toxic Factor in Brazilian Groundnut Causing Liver Damage in Pigs Vet Rec, 73, 1362–1364 38 Loosmore, R.M.; Markson, L.M (1961) Poisoning of Cattle by Brazilian Groundnut Meal Vet Rec, 73, 813–814 39 Lopez MJ, del Carmen Vargas-García M, Suárez-Estrella F, Nichols NN, Dien BS, Moreno J (2007) Lignocellulose-degrading enzymes produced by the ascomycete Coniochaeta ligniaria and related species: application for a lignocellulosic substrate treatment Enzyme and Microbial Technology, 40(4), 794800 40 Mai M Labib , M K Amin , A M Alzohairy , M M A Elashtokhy , O Samir & S E Hassanein (2020) Inhibition analysis of aflatoxin by in silico targeting the thioesterase domain of polyketide synthase enzyme in Aspergillus ssp Journal of biomolecular Structure & Dynamics, 40(13):1-13 54 41 Manavalan T, Manavalan A, Hese K (2015) Characterization of lignocellulolytic enzymes from white-rot fungi Current microbiology, 70(4), 98-485 42 Oliveira PLd, Duarte MCT, Ponezi AN, Durrant LR (2009) Purification and Partial characterization of manganese peroxidase from Bacillus pumilus and Paenibacillus sp Brazilian Journal of Microbiology, 40(4), 26-818 43 Ostry, V.; Malir, F.; Toman, J.; Grosse, Y (2017) Mycotoxins as Human Carcinogenes—The IARC Monographs Classification Mycotoxin Res, 33, 65–73 44 Pant D, Adholeya A (2007) Enhanced production of ligninolytic enzymes and decolorization of molasses distillery wastewater by fungi under solid state fermentation Biodegradation, 18(5), 59-647 45 Reddy GVB, Sridhar M, Gold MH (2003) Cleavage of nonphenolic β‐ diarylpropane lignin model dimers by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium: Evidence for a hydrogene abstraction mechanism European journal of biochemistry, 270(2), 92-284 46 Rushing, B.R., Selim, M.l (2016) Effect of dietary acids on the formation of aflatoxin B2a as a means to detoxify aflatoxin B1 Food Addit Contam, Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 33 (9), 1456-1467 47 Schoental, R Liver (1961) Changes and Primary Liver Tumours in Rats given Toxic Guinea Pig Diet (M.R.C Diet 18) Br J Cancer, 15, 812–815 48 ShekharM, Singh N, Dutta R, Kumar S, Mahajan V (2017) Comparative study of qualitative and quantitative methods to determine toxicity level of Aspergillus flavus isolates in maize PLoS ONE 12(12): e0189760 49 Shin K-S, Kim YH, Lim J-S (2005) Purification and characterization of manganese peroxidase of the white-rot fungus Irpex lacteus The Journal of Microbiology, 43(6), 9-503 50 Singh D, Zeng J, Chen S (2011) Increasing manganese peroxidase productivity of Phanerochaete chrysosporium by optimizing carbon sources and supplementing small molecules Letters in applied microbiology, 53(1), 3-120 55 51 Steffen KT, Hofrichter M, Hatakka A (2002) Purification and characterization of manganese peroxidases from the litter-decomposing basidiomycetes Agrocybe praecox and Stropharia coronilla Enzyme and Microbial Technology, 30(4), 5-550 52 Sundaramoorthy M, Kishi K, Gold MH, Poulos TL (1997) Crystal structures of substrate binding site mutants of manganese peroxidase Journal of Biological Chemistry, 272(28), 80-17574 53 Sutherland GR, Zapanta LS, Tien M, Aust SD (1997) Role of calcium in maintaining the heme environment of manganese peroxidase Biochemistry, 36(12), 62-3654 54 Ten Have R, Teunissen PJ (2001) Oxidative mechanisms involved in lignin degradation by white-rot fungi Chemical reviews, 101(11), 414-3397 55 Wariishi H, Akileswaran L, Gold MH (1988) Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium: spectral characterization of the oxidized states and the catalytic cycle Biochemistry, 27(14), 70-5365 56 Wariishi H, Valli K, Gold MH (1989) Oxidative cleavage of a phenolic diarylpropane lignin model dimer by manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium Biochemistry, 28(14), 23-6017 57 Wong DW (2009) Structure and action mechanism of ligninolytic enzymes Applied biochemistry and biotechnology, 157(2), 174-209 58 Xu C., Singh D., Dorgan K.M., Zhang X., Chen S (2015), Screning of ligninolytic fungi for biological pretreatment of lignocellulosic biomass Can J Microbiol, 61(10), pp 745-752 59 Yamanaka R, Soares CF, Matheus DR, Machado KM (2008) Lignolytic enzymes produced by Trametes villosa CCB176 under different culture conditions Brazilian Journal of Microbiology, 39(1), 78-84 60 Yamazaki I, Yokota K (1965) Conversion of ferrous peroxidase into compound III in the presence of NADH Biochemical and biophysical research Communications, 19(2), 54-249 61 Yehia RS (2014) Aflatoxin detoxification by manganese peroxidase purified from Pleurotus ostreatus Brazilian Journal of Microbiology, 45(1), 34-127 56 62 Yuan, Z Y & Jiang, T J (2003) Horseradish peroxidase, in: J R Whitaker, A Voragen, D W S Wong (Eds.) Handbook of Food Enzymology, Marcel Dekker Inc., New York, pp 403–411