Nghiên cứu vai trò của gen a20 và cyld trong điều hòa chức năng tế bào ở bệnh nhân bạch cầu dòng tủy

1 B GIÁO D C VÀ ÀO T O VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM H C VI N KHOA H C VÀ CÔNG NGH NGUY N THANH HUY N NGHIÊN C U VAI TRÒ C A GEN A20 VÀ CYLD TRONG U HÒA CH C N BÀO B NH NHÂN B CH C U DÒNG T Y TÓM T T LU N ÁN TI Hà N i - CÔNG NGH SINH H C c hoàn thành t i: H c vi n Khoa h c Công ngh , Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam Ng i h Ng ng d n khoa h c: ng d n khoa h c 1: PGS.TS Nguy n Xuân C nh ng d n khoa h c 2: PGS.TS Nguy n Th Xuân Ph n bi n 1: GS.TS Tr n Huy Th nh Ph n bi n 2: GS.TS Nguy n Duy B c Ph n bi n 3: PGS.TS ng V n Lu n án s cb ov cH nh giá lu n án ti p H c vi n, h p t i H c vi n Khoa h c Công ngh - Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam vào h gi 23 Có th tìm hi u lu n án t i: n H c vi n Khoa h c Công ngh n Qu c gia Vi t Nam DANH M C CÁC BÀI BÁO Ã XU T B N LIÊN QUAN N LU N ÁN Nguyen Thanh Huyen, Nguyen Thy Ngoc, Nguyen Hoang Giang, Do Thi Trang, Ha Hong Hanh, Vu Duc Binh, Nguyen Van Giang, Nguyen Xuan Canh, Nguyen Thi Xuan (2023) CYLD stimulates macrophages phagocytosis of leukemic cells through STAT1 signaling in acute myeloid leukemia PLoS ONE 18(8):e0283586 Nguyen Huy Hoang, Nguyen Thanh Huyen, Do Thi Trang, Nguyen Xuan Canh, Can Van Mao, Mentor Sopjani, Nguyen Ba Vuong, Nguyen Thi Xuan (2022) Effects of Vinblastine and Vincristine on the function of chronic myeloid leukemic cells through expression of A20 and CYLD Cellular and Molecular Biology 68(10): 47-53 Nguyen Thanh Huyen, Nguyen Hoang Giang, Nguyen Thi Xuan Expression of deubiquitinase genes and inflammatory response in myeloid leukemia Vietnam Journal of Biotechnology 20(3): 401-408 Nguy n Hoàng Giang, Nguy n Thanh Huy n, Nguy n Th Xuân Bi u hi n m t s gen i u hòa mi n d ch b nh b ch c u t y m n T p chí Cơng ngh sinh h c 2021, 19(1): 51-60 M U Tính c p thi t c a lu n án B nh b ch c u dòng t y m t lo i b nh b ch c u ph bi n x y m i l a tu ng g p nh t ng thành B nh b ch c u dòng t y có hai lo i: B nh b ch c u dịng t y c p tính (AML Acute myeloid leukemia) b nh b ch c u dòng t y m n tính (CML Chronic myeloid leukemia) m t n a b nh nhân b ch c u dòng t c phát hi n 60 tu i, v i tu i m c b nh trung bình c a b nh nhân 64 Hi n nay, vi i u tr cho b nh nhân b ch c u dòng t y ch y u c th c hi n b ng bi n pháp hóa tr ghép t bào ng lồi Tuy nhiên t l lui b nh sau hóa tr li u i gian n nh b n u gi m ng th i tác d ng ph c a vi c u tr l i t ng k n i b nh l n tu i D n nhi u nhà khoa h c n c u quan tâm nghiên c u v nguyên nhân gây b nh b ch c u dòng t y Các gen A20, CYLD mã hóa cho protein thu c nhóm DUB (Deubiquitinase) ng vai trị quan tr ng i u hịa q trình t q trình ch t t bào theo ch ng trình (apoptosis) Các protein DUB phân c t liên k t peptide ho c isopeptide gi a protein ubiquitin làm c trình sinh h c bên t bào Protein A20, CYLD tham gia u hịa âm tính ph n ng mi n d ch gi i phóng cytokine viêm qua ng tín hi u STAT Khi A20, CYLD bi u hi n b ng có th liên quan n s hình thành phát tri n c a b nh b ch c u b nh un ch G n y, t l ng i m c b nh b ch c u dòng t y ngày ó vi u tr b nh lý cịn g p nhi u khó kh n, ng th i A20, CYLD ã c xác nh có liên quan n nguy c m c b nh CLL ALL ây lý mà nhi u nhà khoa h c th gi i Vi t Nam g t p trung nghiên c u ình/ t bi n bi u hi n gen A20, CYLD, bi u hi n viêm gen tín hi u liên quan b nh b ch c u dòng t y Vincristine thu c ch ng ung th có b n ch t alkaloid, c tách chi t t D a c n (Catharantus roseus) Vincristine th y trình apoptosis c a m t s t bào ung t Chính v y, v i vi c xác nh c ình gen CYLD, A20 b nh b ch c u dòng t y ti p t c ánh giá vai trò c a gen i v i trình t apoptosis c a t bào ung th áu - K562 c x lý b i vincristine có th m t c ti n m i vi c tìm bi n pháp c ch s phát tri n c a dòng t bào b nh b ch c u dòng t y Bên c nh ó, i th c bào có vai trị quan tr ng ph n ng ch ng viêm, s a ch a mô, cân b ng n i mơi c bi t có kh n c ch s phát tri n kh i u trình apoptosis c a t bào ung th Do v y, tìm vai trị c a gen CYLD ho c A20 v i ch c n a i th c bào c ng nhi m v quan tr ng h ng t i xây d ng bi n pháp h tr u tr b nh un hi u qu T nh ng lý trên, lu n án Nghiên c u vai trò c a gen A20 CYLD u hòa ch c n g t bào b nh nhân b ch c u dòng t y c th c hi n M c tiêu nghiên c u c a lu n án - Xác nh hình, bi u hi n gen A20, CYLD, bi u hi n viêm m t s gen tín hi u liên quan b nh b ch c u dòng t y - Xác nh vai trò c a gen A20, CYLD u hòa ch c n g c a t bào ung th máu i th c bào b nh nhân b ch c u dòng t y Các n i dung nghiên c u c a lu n án: - Xác nh m t s m a hình/ t bi n, bi u hi n gen A20, CYLD; bi u hi n gen tín hi u STAT1, STAT3 n ng IL-6, TNFb nh nhân b ch c u dòng t y - Xác vai trị c A20/CYLD i v i q trình t apoptosis c a t bào K562 ch c n a i th c bào bi t hóa t PBMC c a ng i b nh AML c x lý v i fludarabine NG QUAN 1.1 tính tính (AML) nh b ph n ng thành B g t c bào blast, ch t t d trình t máu bình th b hi uy t x G n ây, dịng có n t nh t cịn i M ù ã có nh ng c nh vi tiên l g tình tr b g ó kh n 1.2 ng ịng tính (CML) s gia t ng c a t bào b ch c u h t ã c bi t hóa Ban rong máu ngo n ng c ng thành (nguyên b ng S làm phát tri S h ) t s ó tyrosine kinase gâ BCR-ABL, t ML ung B 1.3 Gi 1.3.1 Protein A20 A20 pr gen TNFAIP3 A20 n 4.440 b 790 axit amin A2 CML phát nhanh enzyme deubiquitinase A20 CYLD dài ch u hịa âm tính NFc tính t liên k lympho c t n si lympho A20 c protein c 1.3.2 Protein CYLD Protein CYLD enzyme deubiquitinase ã hóa b cylindromatosis (CYLD) CYLD i , có kích th kb mã hóa cho enzyme thioesterase ch 956 amino acid -glycine (Captiêu NF- B CYLD t a u CYLD có vai trị trình apoptosis, t CYLD húc sinh h b 1.4 Tín hi STAT3 tín hi IF i I II n hh ph trùng; q trình hình thành b o 1.5 Vai trị c ristine Vincristine m ch chi (Cantharanthus roseus) có tác d ung th C ch Vincristine xác ch ng th hi d theo chu k c trình u tr vincristine t ng gây phóng cá trung gian cho q trình t ng cách kích n 1.6 T t n hi d a c n m s b h t t bào Trong kinh, IL-6 TNF- TAT, vincristine tác F PBMC t o PBMC bào ci c b n, ngh tin t ào, nh n in vitro u P a t bào mơ hình in vivo V T LI U VÀ P G PHÁP NGHIÊN C U ng nghiên c u ng nghiên c u 92 b c ch AML 50 b nh nhân c ch n án m c b nh CML ng c u tr ) Nhóm i ch ng 80 ng i tình nguy n kh e m nh c b nh c Các t bào b ch c u dòng t y m n K562 c mua t m t t ch c ATCC (American type culture collection B s p gi ng chu n c a M) i th c bào c bi t hóa t t bào PBMC c a ng i kh e b nh nhân m c b nh nhân AML 2.2 S nghiên c u Hình 2.1 S nghiên c u 2.3 pháp nghiên c u Thu th p m u Tách chi t DNA khu ch i gen A20/CYLD Gi i trình t b ng ph áp Sanger xác nh m ình Tách chi t RNA, t ng h p cDNA k thu t Realtime-PCR Nuôi c y, x lý dòng t bào K562 b i incristine Phân l p bi t hóa t bào PBMC s d ng M-CSF B t ho t gen ELISA Western blot m t bào theo dòng ch y (Flow cytometry) Phân tích s li u K T QU NGHIÊN C U 3.2 ánh giá ình gen CYLD, A20 3.2.1 ình gen CYLD b nh b ch c u dịng t y 3.2.1.1 a hình gen CYLD b nh b ch c u dòng t y c p tính Xác nh c nucleotide exon 16 b thay i, ó có SNP (p.Q723H/c.2435 G>C; p.E735K/c.2445 G>A; p.E747K/c.2481 G>A) SNP không ng ngh a n cho amino acid c b thay th b i amino acid m i (Hình 3.1) SNP (p.E723E/c.2411 G>A) SNP ng ngh a Trong s hình này, s phân b ki u gen t i v trí p.E723E, p.Q731H p.E735K tuân nh lu t cân b ng HWE c nhóm b nh, nhóm ch ng toàn b qu n th nghiên c u (p > 0,05); iv i m h t i v trí p.Q731H s khác bi v ki u gen GC gi a b nh nhân AML nhóm ch ng kh e m c phát hi n so sánh v i ki u gen GG (p = 0,0024) Bên c nh ó, t n s allele C c ng cho th y kh n g liên quan n gi m nguy c c b nh AML cao (p = 0,0032) xác nh c li u tác ng c a SNP không ng ngh a gen CYLD làm thay i axit amin n c u trúc ch c n a protein hay khơng nghiên c u ã s d ng công c Polyphen-2 D a k t qu d án có th nh n th y, SNP t i v trí p.Q731H gen CYLD c d án có th nguyên nhân gây b nh (Hình 3.2) Hình 3.2 D án kh n ây b nh c a SNP không p.Q731H gen CYLD b ng Polyphen-2 ng ngh a 3.2.1 a hình gen CYLD b nh CML Xác nh c nucleotide exon 16 b thay i, ó SNP p.Q731H (c.2435 G>C) SNP không ng ngh a n cho amino acid b thay th b i amino acid m i SNP p.V725V (c.2417 T>G) SNP ng ngh a (Hình 3.3) Trong s ình này, s phân b ki u gen t i v trí p.V725V, p.Q731H tu nh lu t cân b ng HWE toàn b qu n th nghiên c u (p > 0,05) (B ng 3.3) i v i m ình t i p.V725V, ki u gen TG gi a b nh nhân CML nhóm ch ng kh e m c phát hi n khơng có s khác bi t ng k so sánh v i ki u gen TT (p > 0,05) t n s allele G không n kh g gi m ngu m c b nh CML Trong iv trí p.Q731H ki u gen GC gi a b nh nhân CML nhóm ch ng kh e m nh c phát hi n có s khác bi g k so sánh v i ki u gen GG (p = 0,0275) Bên c nh ó, t n s allele ho th y kh n quan n kh n m c b nh CML cao (p = 0,0336) D a k t qu d án có th nh n th y, SNP t i v trí p.Q731H gen CYLD c ng cd án có th gây b nh 3.2.2 ình gen A20 b nh b ch c u dòng t y 3.2.2.1 a hình gen A20 b nh AML Xác nh c nucleotide exon (p.L335S/c.1303 T>C; p.K337Q/c.1308 A>C; p.K354N/c.1361 G>T; p.S376T/c.1425 T>A) b thay i u SNP không ng ngh a n cho amino acid c b thay th b i amino acid m i (Hình 3.4) S phân b ki u gen t i v trí p.L335S, p.K337Q, p.K354N p.S376T u nh câ toàn b qu nghiê (p > 0,05) (B 3.5) 10 b nh nhân b ch c u dòng t y (AML CML) t ng cao l n l t kho ng 269 l n so v i nhóm ng i kh e S thay i c ng có ý ngh a th ng kê (p < 0,05) 3.4 M i liên quan gi n g cytokine b hình nucleotide dịng t ,b n c a gen D ki ann-Whitney U, xác nh cm i liên quan gi a ã hình t i v trí p.Q731H gen CYLD v i n ng IL-6 b nh nhân AML (p < 0,05) (B ng 3.11, Hình 3.9), nh khơng tìm c m i liên quan gi a s phân b ki u gen c a ình t i v trí p.Q731H gen CYLD bi u hi n gen CYLD (B 3.9); bi u hi n gen tín hi u STAT1 (B ng 3.10) n ng TNFcác b nh nhân b ch c u dòng t y Hình 3.9 M i liên h ình t í p.G731H gen CYLD n -6 ân AML Bên c nh ó, d a ki m nh Spearman c ng cho th y, khơng tìm th y m i liên h gi a bi u hi n gen A20, CYLD gen tín hi u STAT1 b nh nhân b ch c u dòng t y (AML CML) (B ng 3.12) 3.5 Xác apoptosis c 3.5.1 Xác bào K562 trò A20, CYLD bào K562 trò c a gen A20, CYLD nh i sinh c t Trong nghiên c u này, t bào K562 c x lý b i vincristine khác (60-300 nM) m c n ng bi u hi n mRNA c a gen A20, CYLD u cao n rõ r t so v i nhó i ch ng, c bi t t bào c x lý b i vincristine n ng 300 nM (Hình 3.10) D a vào 11 bi u hu nh quang CFSE thu c t t bào K562 có th nh n th y, s t sinh c a K562 gi m k c x lý b i vincristine 300nM Tuy nhiên, tr ng h p t bào b làm b t ho t A20, CYLD tác d ng c ch c a vincristine i v i s t ng sinh c a t bào khơng cịn n a (Hình 3.11) Nh y, vincristine c ch s sinh t bào thông qua s bi u hi n c a gen A20, CYLD Hình 3.11 nh h ng c a A20, CYLD * (p