Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai sau chăn nuôi lợn trong ngành chăn nuôi của Việt Nam, hằng năm cung cấp khoảng 350 450 nghìn tấn thịt và hơn 2,5 3,5 tỷ quả trứng. Tuy nhiên, chăn nuôi gà ở nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hoá còn nhỏ. Bình quân sản lượng thịt xẻ, trứng chỉ đạt 4,5 5,4 kgnguờinăm và 35 trứng nguời năm. Trong vài thập kỷ qua, mặc dù công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất chăn nuôi gà như tăng trưởng nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn cao, khả năng sản xuất thịt tốt, tỷ lệ thịt ngực cao hơn nhưng sự tăng nhanh về năng suất sản xuất đã đi cùng với việc tăng dịch bệnh, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa và mắc nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết cao. Trong đó có thể kể đến bệnh Gumboro do một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius, do đó làm giảm khả năng miễn dịch của gà. Nhiều báo cáo khoa học đã cho biết gà ở giai đọan từ 1 12 tuần tuổi, nhất là ở giai đọan 3 6 tuần tuổi đều có khả năng mắc bệnh. Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch. Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10 – 50% hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác. Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ. Vì vậy thiệt hại do bệnh Gumboro gây ra là rất đáng kể đối với chăn nuôi gà của các nước lớn trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng. Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus. Khởi phát từ các vấn đề nêu trên, được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi tại Thái Nguyên”
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
Cơ sở khoa học
2.1.1 Tổng quan về bệnh Gumboro
Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà, nhưng chủ yếu là gà từ 3 - 6 tuần tuổi và gà tây (Hitchner, S B, 1970) [18] Bệnh do một loại virus tác động vào túi Fabricius gây suy giảm miễn dịch ở gà, khiến cho gà dễ bị mắc các chứng như viêm da hoại tử, hội chứng thiếu máu - viêm gan thể bao hàm, bệnh do E.coli và khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch kém sau khi sử dụng các loại vắc xin.
Theo Dobos, P (1979) [13], virus Gumboro thuộc họ Birnaviridae Họ này gồm có 3 giống: giống Apubirnavirus gây bệnh hoại tử tuyến tụy cho cá, loài giáp xác; trong đó có IBDV gây bệnh cho gà; giống Entomobirnairus, trong đó có virus Drosophia X gây bệnh cho côn trùng (Mac Donald, R D,
1980) [27] Các virus thuộc họ này đều đặc trưng bởi cấu tạo nhân gồm 2 đoạn ARN sợi đôi vì vậy tên gọi của họ virus là Birnavirus (Bottcher, B và cs, 1997) [10] Trước đây, do hình thái và cấu trúc của virus chưa được nghiên cứu đầy đủ nên IBDV đã từng được xếp vào họ Picornaviridae hoặc
Reoviridae. b Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus Gumboro
Virus Gumboro hay còn gọi là virus gây viêm túi truyền nhiễm(Infectious bursal disease virus - IBDV) Virus Gumboro là một lọai virus dạng trần, không có vỏ bọc bên ngoài, kích thước khoảng 50 – 60 nm có hình khối đa diện, nhiều góc cạnh trông giống như tổ ong xếp đều đặn cạnh nhau,gồm 2 chuỗi RNA quấn chéo nhau, vỏ capsid bao bọc bên ngoài vỏ này chứa thành phần kháng nguyên của virus không có vỏ bọc bên ngoài nên nó đề kháng với việc sát trùng (Delmas, B và cs, 2004) [12].
Theo (Ozel, M và H Gelderblom, 1985) [34] cấu trúc virus đơn giản nhưng hoàn thiện vì thế nó có khả năng chống chịu lại sự tác động bất lợi của môi trường Mặt khác do kích thước nhỏ bé và cấu trúc linh hoạt (hệ gen rất đơn giản), virus thích ứng xâm nhập và truyền lây trong quần thể vật chủ một cách nhanh chóng và dễ dàng thoát khỏi miễn dịch tự nhiên của cơ thể.
Hình 2.1: Hình thái của virus Gumboro
Virus Gumboro có cấu tạo đối xứng, quanh nhân là vỏ capsid (vỏ protein) Lớp vỏ capsid này được hợp thành bởi 32 capsome (đơn vị hình thái) Capsid của virus là lớp vỏ protein đơn lớp Virus không có vỏ bọc ngoài cùng mà thông thường lớp vỏ đó là lipoproterin nên nhạy cảm với formalin không nhạy cảm với ether và chloroform Mỗi capsome được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP).
Về mặt di truyền học cách sắp xếp các nucleotid trong acid ribonucleic của virus Gumboro cuộn lại tạo thành sợi đôi và phân đoạn Đây chính là tính đặc trưng của virus RNA, người ta xếp nó vào họ Birnaviridae là mới nhất trong hệ thống phân loại virus trong động vật và người Lukert, P D và Y M Saif
Hình 2.2: Cấu trúc phân tử virus Gumboro
Dobos, P và cs (1979) [14] virus Gumboro có hệ gen chứa hai sợi RNA, đó là hai phân đoạn phân biệt gọi là phân đoạn A và B.
Phân đoạn A có độ dài 3261 nucleotid chứa hai khung đọc mở thành phần (overlapping open reading frame – ORF) ORF nhỏ sẽ mã hóa cho protein không cấu trúc VP5 không cần thiết cho quá trình sao chép virus invitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Hudson, P.
J và cs, 1986) [19] ORF lớn mã hóa cho một polyprotein 110 kDa, tự xúc tác hình thành ba loại polypeptide: pVP2 (48 kDa), VP3 (32kDa), và VP4 (28 kDa) (Mundt, E., J Beyer, và H Müller, 1995) [31] VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine-lysine VP2 sẽ được tách thêm những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40kDa) VP2 và VP3 là những protein cấu trúc Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống miễn dịch (Kibenge, F S B và V Dhama, 1997) [23].
Theo Boot, H J và S B Pritz-Verschuren (2004) [9] phân đoạn B có độ dài 2827 nucleotid chỉ chứa duy nhất một cấu trúc gen mã hóa cho sự tổng hợp một protein duy nhất gọi là VP1 (VP- viral protein), (VP1: 97kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polymerase - RdRp) Polypeptide này thực hiện dưới dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein tự do và của một protein liên kết genome (còn đươc gọi là VPg) VPg được cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của hai mạch trong genome VP1 có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA-polymerase (xúc tác quá trình tổng hợp RNA) của virus.
Hình 2.3: Hệ gen của virus Gumboro
Theo Pan, J., V N Vakharia, và Y J Tao (2007) [35] virus Gumboro có hai loại protein mang tính kháng nguyên đặc biệt:
+ Một loại protein kích thích cơ thể sinh ra kháng thể kết tủa (precipitating antibody) có tính đặc hiệu nhóm, được kí hiệu là Gs (Group Specific) (thực chất là protein cấu trúc VP3) Loại này khi kết hợp với kháng thể đặc hiệu tạo nên phản ứng kết tủa, vì thế có thể làm phản ứng kết tủa khuyếch tán trong thạch (AGP) dùng để phát hiện cả kháng nguyên và kháng thể.
+ Loại thứ hai có tính kháng nguyên kích thích cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa (Neutralizating antibody) được gọi là kháng nguyên đặc hiệu typ, ký hiệu Ts (Type-Secific) (thực chất của kháng nguyên này là vỏ VP2). Loại kháng nguyên này khi kết hợp với kháng thể đặc hiệu sẽ tạo nên phản ứng trung hòa virus VN Phản ứng này vừa được dùng để định tính vừa được dùng để định lượng kháng thể đặc hiệu trong chẩn đoán và kiểm tra miễn dịch của bệnh Gumboro
Hai loại protein Gs và Ts đan chéo vào nhau tạo nên các lớp vỏ protein bọc lấy nhân virus, trong đó Ts có xu hướng nổi lên trên bề mặt hơn, các lớp protein nối nhau, các gai, móc, các receptor thụ thể nằm ngoài cùng của bề mặt virus hay các epitop liên tục hơn Còn Gs protein thường nằm sâu hơn xen kẽ vào các protein cấu trúc khác, gắn chặt với lớp protein liên kết với acid nucleic của nhân virus, các epitop gián đoạn.
Ts protein là một phức hợp protein kết hợp trong đó có protein quyết định tính gây bệnh của virus Ts kháng nguyên có vai trò lớn trong miễn dịch học và và quyết định tính đặc hiệu theo typ huyết thanh học, có thể giám định, phân biệt virus thuộc các họ, nhóm và typ khác nhau, thậm chí trong cùng một phân typ huyết thanh Gs kháng nguyên trong quá trình tạo nguyên liệu thực hiện quá trình nhân lên và gây bệnh, chúng được sản xuất rất nhiều và giải phóng ra khỏi tế bào Gs protein quyết định tính đặc hiệu trong cùng một huyết thanh học.
Trong quá trình nhân lên của virus, cả hai kháng nguyên Gs và Ts đều được sản xuất như nhau, khi có đáp ứng miễn dịch kháng thể do chúng kích thích sản sinh ra cũng có quan hệ tỷ lệ thuận với nhau Kháng thể kết tủa có sớm hơn kháng thể trung hòa. c Tính chất nuôi cấy
Theo Benton, W J và cs (1967) [8] virus có thể nuôi cấy trên phôi gà
Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Bệnh Gumboro được phát hiện đầu tiên vào năm 1957 tại làng Gumboro thuộc bang Delaware của Mỹ Sau nhiều năm nghiên cứu phân lập mầm bệnh, người ta quyết định lấy tên làng là nơi phát hiện ra mầm bệnh để đặt tên cho bệnh Gumboro Khi mới tìm ra bệnh này, do thấy bệnh tích đều có viêm thận nên người ta lầm tưởng đó là bệnh viêm phế quản truyền nhiễm
(Infectious bronchitis – IB) do virus Gray gây ra vì bệnh tích ở thận tương đối giống nhau.
Winterfeild R.W và Hitchner S.B (1962) [42] đã phân lập được virus
Gray và làm thí nghiệm sàng lọc phân biệt: gây miễn dịch cho gà bằng virus Gray rồi gây nhiễm gà đó bằng virus phân lập từ bệnh phẩm ở ổ dịch làng
Gumboro, phát hiện gà bị bệnh Gumboro và có bệnh tích rất điển hình ở túiFabricius Từ đó các tác giả khẳng định đây là tác nhân gây bệnh mới, gây bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm Cosgrove (1962) [11] đã phân lập được virus này trên phôi trứng 9 - 10 ngày tuổi Ông thấy rằng khi cấy truyền virus vào phôi gà thì tỷ lệ phôi chết không ổn định, khó giữ sống song vẫn khẳng định được đó là virus gây bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm.
Năm 1970 các tác giả thống nhất gọi tên bệnh theo mô tả của Cosgrove: do có bệnh tích đặc trưng ở túi Fabricius nên đã gọi là bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm (Infection bursal disease – IBD), nguyên nhân bệnh do virus (Infection bursal disease virus-IBDV).
Allan và cs (1972) [7] đã phát hiện tác hại gây bệnh của virus làm suy giảm miễn dịch ở gà con, từ đó công cuộc nghiên cứu cấp bách về biện pháp phòng bệnh được các nhà khoa học trong lĩnh vực này đặt lên hàng đầu.
Mc Ferran và cs (1980) [30] đã phát hiện được 2 serotype virus gây bệnh Gumboro Trong số đó serotype I gây bệnh cho gà nhà, serotype II gây bệnh cho gà tây.
Jackwood, D J và S E Sommer-Wagner (1985) [22] qua nghiên cứu thử nghiệm đã thấy rằng gà nhà có thể nhiễm serotype II ở thể mang trùng và ngược lại gà tây có thể nhiễm serotype I, nhưng không có sự miễn dịch chéo cho nhau Tác giả Rosenberger, J K và S S Cloud (2008) [37] cũng cho biết trong một serotype có nhiều biến chủng của virus mà lượng kháng thể thụ động của gà con được truyền từ gà mẹ đã được miễn dịch bằng chủng chuẩn không hoàn toàn ngăn chặn được các biến chủng này Việc sử dụng vắc xin phòng bệnh càng trở nên phức tạp và do sự xuất hiện biến chủng mới của virus có thể liên quan đến trạng thái miễn dịch không đầy đủ của đàn gà.
Kể từ khi phát hiện được bệnh Gumboro, bệnh đã xảy ra trên khắp các châu lục ở hầu hết các nước có chăn nuôi gà công nghiệp.
Bệnh được phát hiện ở Châu Âu, Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và trở thành một vấn đề của toàn thế giới gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi.Năm 1992 cục dịch tễ học quốc tế (OIE) đã công bố tên bệnh, mầm bệnh,triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, các phương pháp chẩn đoán và phòng bệnh
Gumboro Song do mầm bệnh có nhiều biến chủng, tính tương đồng kháng nguyên thấp chỉ 30%, miễn dịch phòng bệnh rất phức tạp, hiệu quả phòng bệnh Gumboro phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, các nhà khoa học vẫn đang đi sâu nghiên cứu nhằm tìm ra giải pháp hữu hiệu hơn nữa hạn chế tác hại của bệnh.
Marquardt và cs (1980) [28] là người đầu tiên mô tả các thử nghiệm ELISA gián tiếp cho kháng thể IBDV Bộ KIT sử dụng để đo nồng độ kháng thể trong huyết thanh IBDV những nồng độ này rất hữu ích để đánh giá mức độ miễn dịch đàn trong đợt dịch, cũng như đánh giá hiệu quả của quá trình tiêm chủng
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Dựa vào triệu chứng, bệnh tích, dịch tễ học, năm 1981 các chuyên gia Hungari và Việt Nam đã xác định có bệnh Gumboro ở phía bắc Việt Nam (Trần Minh Châu và cs, 1984) [1] .Nhiều tác giả cho rằng nguyên nhân dẫn đến có bệnh Gumboro tại Việt Nam là do nhập con giống có mang sẵn mầm bệnh từ nhiều nguồn khác nhau ở nước ngoài vào Một số ý kiến cho rằng bệnh Gumboro xuất hiện ở Việt Nam sớm hơn từ những năm 1978 - 1980, nhưng trong thời gian này chúng ta chưa có kinh nghiệm về bệnh Gumboro mà chỉ quan tâm đến bệnh Newcastle và thấy bệnh gia tăng về cả quy mô dịch tễ lẫn cường độ bệnh Khi kiểm tra đàn gà thấy lượng kháng thể kháng virus Newcastle thấp đã kết luận do vắc xin Newcastle không có hiệu lực hoặc do các trại không thực hiện đúng quy định phòng bệnh Tại trại gà Quân khu V – Đà Nẵng, dịch bệnh Gumboro xảy ra từ 22/9/1981 làm chết 6460 con gà, chiếm tỷ lệ 27% trong toàn dân (Nguyễn Đăng Khải, 1988) [5].
Năm 1982, Viện Thú y Quốc Gia đã quan tâm đến bệnh và chính thức công bố bệnh Gumboro ở Việt Nam (Nguyễn Tiến Dũng và Lê Thanh Hòa,
Năm 1987, bệnh phát triển thành dịch ở nước ta nhất là các tỉnh phía bắc Trong giai đoạn này đã phân lập được một số chủng có độc lực cao (kí hiệu là G-02) và được giám định chính xác (Nguyễn Tiến Dũng, 1989) [3]. Bệnh xảy ra liên tiếp gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi, việc nghiên cứu chẩn đoán bệnh kịp thời có ý nghĩa rất quan trong để ngăn chặn dịch bệnh. Trung tâm chẩn đoán Thú Y Quốc Gia đã nhập kháng nguyên kháng huyết thanh chuẩn giúp cho công tác chẩn đoán bệnh có hiệu quả Bằng phản ứng AGP, trung tâm đã phát hiện được 159 mẫu huyết thanh dương tính trong tổng số 1040 mẫu huyết thanh kiểm tra được, chiếm tỷ lệ 15,28 % và trung tâm chẩn đoán Thú y Quốc Gia đã phân lập được virus Gumboro từ 7 trong
30 mẫu bệnh phẩm chiếm tỷ lệ 23,33 %.
Theo (Lê Văn Năm, 2004) [6] từ năm 1987-1989 cũng bằng kĩ thuật chẩn đoán kết tủa khuyếch tán trong thạch (AGP) với kháng nguyên chuẩn, đã phát hiện tại một số trại gà ở Hà Nội thấy tỷ lệ gà có huyết thanh dương tính
30 – 40 % trong tổng số mẫu kiểm tra khi đàn gà chưa được sử dụng vắc xin.
Có thể nói ở Việt Nam giai đoạn 1986-1990 là thời kì bỏ ngỏ đối với bệnh Gumboro do chưa có vắc xin phòng bệnh, thiếu kinh nghiệm phòng bệnh nên đã gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi gà công nghệp, tỷ lệ gà bị bệnh 80 – 90 %
Theo số liệu thống kê của cục thú y từ năm 1986 đến năm 2004 nhiều tỉnh trong cả nước đều có báo cáo có bệnh Gumboro như: Hà Nội, Hà Tây, Sơn La, Hòa Bình, Nam Định và Vĩnh Phúc Các tỉnh phía Nam thường xảy ra dịch trên địa bàn có quy mô từ 100 - 6000 con ở cả hai khu vực chăn nuôi gia đình và quốc doanh như: Thành phố Hồ Chí Minh, Long An, Bình Thuận, Phan Thiết.
Bệnh Gumboro gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gà ở nước ta.Chính điều đó đã thôi thúc các nhà khoa học trong nước nghiên cứu tìm tòi nhiều giải pháp ngăn chặn dịch bệnh Qua thực tế sản xuất, người chăn nuôi thấy rằng việc dùng vắc xin phòng bệnh Gumboro là thực sự cần thiết Tuy có nhiều tác giả đã nghiên cứu tìm hiểu về bệnh này và có nhiều phương pháp tổng hợp đã được áp dụng trong phòng trống kể cả chương trình vắc xin rộng rãi nhưng bệnh Gumboro vẫn là một trong những bệnh có tỷ lệ nhiễm cao nhất 56,98 % Một trong những nguyên nhân chính là việc vệ sinh tẩy uế không được triệt để, virus Gumboro có sức đề kháng cao với điều kiện tự nhiên, cho nên bệnh tồn tại và lưu hành rộng rãi, cũng như nguồn vắc xin nhập ngoại có nguồn kháng nguyên không hoàn toàn tương ứng với các chủng gây bệnh của Việt Nam bệnh vẫn được quan tâm nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm trong nước.
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Virus cường độc Gumboro phân lập từ gà mắc bệnh tại tỉnh Thái Nguyên
Địa điểm và thời gian tiến hành
Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện Khoa học sự sống
Nội dung nghiên cứu
- Chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh Gumboro
- Xác định điều kiện bảo quản KIT chẩn đoán bệnh Gumboro
- Thử nghiệm KIT chẩn đoán bện Gumboro
Phương pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi
Virus Gumboro phân lập từ tỉnh Thái Nguyên được sử dụng trong nghiên cứu này
3.4.2 Thiết bị và hóa chất
- Đĩa 96 giếng đáy phẳng Costar cho phản ứng ELISA.
- Một số dụng cụ thí nghiệm khác.
- Các chất tạo màu cho phản ứng ELISA
- Kháng thể đặc hiệu loài
- Nước muối sinh lý NaCl 0,9 %
3.4.3.1 Phương pháp hoạt hoá virus Gumboro
Với phôi trứng: nhiệt độ duy trì ở 37 o C, soi và đảo trứng 2 lần/ngày, để một khay nước sạch ở dưới tủ ẩm để cung cấp độ ẩm cho phôi, đánh dấu buồng khí và vị trí của phôi.
Thao tác: Tiến hành pha loãng virus ở nồng độ 10 -1 rồi tiếp truyền vào xoang niệu mô của phôi trứng 9 ngày tuổi Sát trùng quanh trứng bằng cồn
70 o , sau đó dùng dùi tạo một lỗ nhỏ trên đỉnh buồng khí Dùng xi lanh tiêm virus vào xoang niệu của phôi với liều lượng 0,2 ml /quả, sau đó bịt lỗ tiêm bằng sáp nến Sau quá trình tiếp truyền, tiếp tục ấp phôi ở 37 o C Soi và đảo trứng 2 lần/ngày, nếu phôi chết trong vòng 24 giờ thì loại bỏ (nghi bị nhiễm khuẩn, hoặc thao tác tiêm không đúng kỹ thuật) Các phôi chết trong vòng 24
- 96 giờ với biểu biện bệnh tích của bệnh Gumboro là xuất huyết đầu và chân thì trứng được để vào tủ lạnh ở 4 o C qua đêm sau đó mổ thu dịch niệu.
3.4.3.2 Phương pháp tiếp truyền giống virus và thu kháng nguyên
Phôi trứng cũng được lấy từ trại giống gia cầm, và được thao tác giống phần 3.4.3.1 đã nêu Tiếp truyền được thực hiện khi phôi đạt 9 ngày tuổi.
Phương pháp tiếp truyền giống virus như sau: Giống virus được pha loãng ở nồng độ 10 -3 , sau đó tiêm vào xoang niệu cho 20 phôi gà 9 - 10 ngày tuổi với liều 0,1 ml/phôi Tiếp tục ấp ở 37 o C trong 120 giờ.
Những phôi chết trong thời gian 72 giờ với biểu hiện bệnh tích của bệnh Gumboro được thu dịch niệu mô
3.4.3.3 Phương pháp chế kháng nguyên hoà tan
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, kháng nguyên được chế bằng phương pháp đông tan Virus sau khi tiếp truyền được để trong bình Nitơ lỏng
6 giờ, sau đó mang đi đông tan trong bể ổn nhiệt 40 o C trong 2 giờ Lặp lại công việc như vậy 5 lần liên tiếp, xác định hàm lượng protein tổng rồi sau đó cất vào tủ lạnh sâu -20 o C.
3.4.3.4 Phương pháp gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm Để thực hiện thí nghiệm chúng tôi bố trí như sau: 2 lô, mỗi lô 5 con + Lô I : không tiêm virus Gumboro Đối tượng được sử dụng là gà thí nghiệm 21 ngày tuổi chưa được tiêm vắc xin Gumboro, trước khi thí nghiệm kiểm tra kháng thể kháng Gumboro phải có phản ứng AGP âm tính.
+ Lô II : gà thí nghiệm 21 ngày tuổi chưa được tiêm vắc xin Gumboro, trước khi thí nghiệm kiểm tra kháng thể kháng Gumboro phải có phản ứng AGP âm tính Sử dụng virus Gumboro để gây đáp ứng miễn dịch trên gà tiêm với liều lượng 0,2 ml /con Sau 15 ngày tiêm nhắc lại lần 2 Định kỳ tiến hành thu máu tách huyết thanh cả 2 lô thí nghiệm một tuần một lần.
3.4.3.5 Phương pháp chắt huyết thanh thu kháng thể.
Máu được lấy ở tĩnh mạch cánh hoặc ở máu tim (nếu gà còn bé) Mỗi lần lấy khoảng 1ml máu rồi bơm nhẹ nhàng vào các effendorf, sau đó để nghiêng ống khoảng 45 o cho đến khi máu đông, để vào ngăn mát tủ lạnh 30 phút, sau đó bỏ ra để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút để thu huyết thanh Huyết thanh thu được đánh dấu mẫu rồi cất vào tủ lạnh bảo quản trong điều kiện lạnh sâu -20 o C.
3.4.3.6 Phản ứng ELISA gián tiếp để kiểm tra hiệu giá kháng thể
Cơ chế kết hợp kháng nguyên kháng thể: Khi đem trộn kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu tương ứng thì chúng có thể tác dụng với nhau Sự kết hợp đó nhiều khi có thể nhìn thấy bằng mắt thường dưới hình thức lên bông, kết tủa ngưng Hoặc có thể dựa trên một số phản ứng riêng biệt trong miễn dịch.
Sự kết hợp này mang tính đặc hiệu : Một kháng nguyên chỉ kết hợp được với một kháng thể đặc hiệu và ngược lại.
Ngoài ra nó còn mang tính khả hồi: Phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể bị tách rời ra bởi nhiệt độ hay toan hoá môi trường Vì thế người ta có thể tách kháng nguyên và kháng thể rời nhau ra ngay sau khi hình thành phức hợp.
Có nhiều loại phản ứng ELISA: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh và ELISA Sandwich Các phản ứng này được tiến hành theo các trình tự khác nhau, được ứng dụng trong việc chuẩn đoán các bệnh khác nhau nhưng nguyên lý chung của chúng là phản ứng kết hợp kháng nguyên, kháng thể với sự có mặt của một enzyme (thường sử dụng là enzyme peroxidase) có ý nghĩa như một chất chỉ thị Phản ứng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phản ứng sử dụng kháng nguyên chuẩn đã biết để xác định kháng thể Thường dùng để chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm Ngoài ra còn được sử dụng để xác định sự biến thiên của hàm lượng kháng thể.
+ Đĩa ELISA: Đĩa bằng chất liệu nhựa polypropylene có 96 giếng, có khả năng hấp thụ kháng nguyên tốt – Costar.
+ Kháng nguyên chuẩn, huyết thanh gà (thỏ), conjugate (chất gắn kết) có gắn enzyme peroxydase, subtrate (chất tạo màu cho phản ứng thường là TMBZ (3,3’,5,5’ Tetramethybenzodine)), PBS, PBS - Tween, sữa tách bơ (casein).
+ Kháng nguyên (pha loãng ở nồng độ thích hợp) được gắn trực tiếp vào đĩa ELISA (dựng pipet nhỏ 200àl mỗi giếng Thụng thường khỏng nguyên được ủ qua đêm ở nhiệt độ 4 o C qua đêm hoặc 37 o C trong 2 giờ Sau khi kháng nguyên được ủ trong đĩa, đổ bỏ dung dịch có trong đĩa phản ứng. Rồi dùng dung dịch PBS có chứa Tween 20 (Phosphate Buffer Saline) rửa đĩa
3 lần, và đập khô (sau mỗi lần rửa phải đập khô).
+ Tiến hàng Block đĩa: Các khoảng trống trong đĩa được phủ bằng dung dịch PBS – sữa tỏch bơ 5 %, dựng pipet nhỏ 200àl mỗi giếng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc lắc ở 37 o C trong 1 giờ sau đó hắt bỏ dung dịch sữa trong các giếng Rửa sạch đĩa 3 lần với PBS – Tween 0,05 % và đập khô đĩa.
+ Kháng thể (là huyết thanh thỏ hoặc gà) pha loãng ở nồng độ thích hợp bằng PBS - sữa tỏch bơ 0,05 %, nhỏ 100àl mỗi giếng Khỏng thể ủ trong đĩa ở nhiệt độ 37 o C trong điều kiện lắc 30 phút Sau khi ủ, hắt bỏ dung dịch trong các giếng, rửa đĩa 5 lần với PBS – Tween và đập khô Chú ý lần rửa thứ nhất không để tràn giếng.
+ Conjugate thường pha bằng PBS với độ pha loãng là 10000 hoặc
5000 lần, nhỏ 100 àl vào mỗi giếng và ủ ở 37 o C trong 30 phỳt Sau đú lại hắt bỏ dung dịch trong các giếng và rửa đĩa 6 lần với PBS – Tween 0,05 % và đập khô.
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được, được xử lý bằng phương pháp toán học thông dụng và phần mềm Excell 2010.
