BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRUONG DAI HOC SU PHAM THANH PHO HO CHI MINH KHOA HOA HOC
* (0x
KHOA LUAN TOT NGHIEP CU NHAN KHOA HOC
Chuyên ngành : Hĩa hữu cơ
CHIÉT TÁCH, PHÁN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC
MỘT SĨ TAXOID CHÍNH TỪ CÀNH, LÁ THƠNG ĐỎ (TAXUS WALLICHLANA ZUCC.) ĐƯỢC TRỊNG TẠI
LAM DONG
Người hướng dẫn khoa hoc: TS Tran Cơng Luận
Trang 22Q] AD
Khĩa luận tốt nghiệp
= LOI CAM ƠN œ4
Cho phép em bày tỏ lỏng biết ơn sâu sắc đến thây TS Trần Cong Luan đã tạo
mọi điêu kiện thuận lợi cũng như tận tình chỉ bảo, gĩp ý cho em trong suốt quả trình
thực hiện khỏa luận tốt nghiệp này
Với tình cảm chân thành, em xin bày tĩ lịng biết ơn đến cơ Th§ Dương Thị
Mộng Ngọc đã giúp đỡ động viên và chỉ dạy em những điều bê ích khơng chỉ những
kiển thức chuyên mơn mà cịn cá những trải nghiệm cuộc sơng
Em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các thây cơ khoa hĩa của trường Dại
học Sư phạm thành phơ Hồ Chí Minh đã vun đắp kiến thức, kinh nghiệm quỷ báu cho em trong suốt bổn năm đại học
Cảm ơn anh Bùi Thế Vinh đã nhiệt tình hỗ trợ, chỉ bảo cho em những kinh
nghiệm, giúp em tìm những tải liệu liên quan để em cĩ thể hồn thành tốt bải khĩa
luận nảy Cám ơn chị Lâm Bích Thảo, anh Lê Minh Triết đã tạo điều kiện thuận lợi
động viên em trong suốt thời gian thực hiện khĩa luận nảy
Cám ơn H2 cùng các bạn sinh viên lớp hĩa 4C đã luơn ở bên an ủi và giúp đỡ
tơi vượt qua những khĩ khăn trong bốn năm đại học và trong khoảng thời gian thực
hiện đẻ tải nay
Cuỗi củng con xin gởi tình yêu thương đến những người quan trọng nhất đời
con Con xin cám ơn bố mẹ đã cùng con đi suốt quãng đường dải Cảm ơn bỗ mẹ và hai thăng nhĩc đã làm diễm tựa cho con vững bước trên con đường mã con đã chọn
Xin chân thành cảm ơn! Tác giả
Trang 3Khỏa luận tốt nghiệp
MỤC LỤC
LỚI CẢM ƠN — assis xố: k (biàGg40161ai46)16G144554151801025624301454:4/643303đ
ĐANH MỤC CÁC TỪ VIỆT TẤT , 6525223921 533 25 32223215623755232exervvee 4 DJ MỠ ĐẦU GácctoccoibbcctiecactiGsoitititaailGtagtidGiladibttiaiunyastdibaovs 5 ESSE US IS A veeodavdiieeiadeoietci4404eyicc264sn092ax46 7 DAH: MUG SO DO BAING BIE UI iss cecosspiortcii teosddsvinpdbnciovicanedapbeniedess badouserddideebeetbddbee 8 CHIUIOING 1S TONG: UIA sis cascontirccccsicecsacins esareuactantarasiniaatasenncatanssnetacctestmasniaiennce 9
N0 56600 00NÌPnaiiii3544Ý 9
2: Dee diem sinh hoot 1), (31, (41s (13); [US iaisiciscsccn ancien ụ
SN Dễ ca keendeiseeoesceeastokesskdoaG14G0634546008014G205071G00/00 0 0ng0a30es0g6 10 £.› ` ' ncrecareporonnayoepasceanennvecneonera rsrreeeseserosiieonrpesnevsbeere Usp seysecerreaveree ress iSO II Š Các cơng trình nghiên cứu về lồi Taxws wailiehiana -:.-‹-:©<:s5:55s< 12
itdtiiaaẢ 12
$2 TYGR@ NƯỚC các c22c2 000/22 000151266G66666010/661446662G015x504264À46ss0300ags4 25
@8m# 9Ø `, à-=———=eseeee 27 1, NGUYÊN HN G6066 00000002400 606G2Adá00104 aii 27 3: Điệu kiêu đệ NIÊN ca nuet020 2622600446 60460as6 27 In Ơn 27
1/0: TH ĐỊ n6 0t ea aS akg Sacks Neate ates 27
1 TN nợ B0 DRIIIÊN CƯ gà gay khakkandbayeeeoiooenkeiaeockoceiicoccaeyioee 28
BN RE NN EL 5g 0/02 01v 00 36060) 0 eat 28
12 Lào phần đổ sotccGicisccg(0102140166004200À1:993/016604020.0y24 0xx 28 3.3 Sắc kỉ cột điaion HP-20 0n 1020112122121 xe TH ng 28 3:4: Sie ki cOt-silica gel pha thud 4s 26060 100220162 0002010 026 A000 2615ao6/855: à68i4g3 28
Trang 4Khoa ludn tỏi nghiệp
Đ< TẾ Đi Tố 6xx.ố.ằốẳỏ"ốểẳ_n ẻằnnn 32
3, Kết quả lãc phân đoạn 5s 525 1131515151855 511121 1 13 1111231711 rry 32
Trang 5Khĩa luận tốt nghiệp DANH MUC CAC TU VIET TAT s: Singlet d: Doublet dd: Doublet of doublet i: Triplet, mai ba q: Quartet, mai bốn m: Multiplet, mii da J: Hang s6 ghép spin
NMR: Nuclear Magnetic Resonance, céng huéng tir hat nhân DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 11SQC; Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
Trang 6Khỏa luận tối nghiện
LOI MO DAU
Theo thơng kế của tổ chức y tế thể giới WHO trong năm 2004, thể giới cĩ
khoảng 7.4 triệu người chết vì căn bệnh ung thư (chiêm 13% tổng số người tử vong)
và con số nảy cĩ thê tăng lên I2 triệu trong năm 2030 [21] Trong khi đĩ các nhà khoa học đã phát hiện tác dụng chữa bệnh của một số hợp chất cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên,
mot trong số đĩ là hợp chất Paclitacxel (cĩ tên thương mại là taxol) được phân lập lan
dau tién tir vo cua loai Taxus brevifolia Nutt (Thong dé Thai Binh Duong) vào năm 1971 boi Wani va Wall cùng cộng sự [23] Hiện nay, hai được phẩm được sử dụng
nhiều và hiệu quả nhất trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư phơi là:
Paclitaxel (Taxol”, cơng ty Bristol Myers Squibb-Mỹ) và Docetaxel (Taxotere”, cơng
ty Sanofi-Aventis-Pháp) Do cĩ giá trị kinh tế cao, Thơng đỏ bị lạm dụng khai thác, đặc biệt là ở vùng Himalaya và Trung Quốc, nguồn được liệu thiên nhiên này trở nên
khan hiếm, bị đe đọa tuyệt chủng [23] Mỹ và một số nước Châu Âu đã thành cơng trong việc sản xuất taxol nhưng lại chiết từ vỏ cây Cơng nghệ nảy sẽ làm cây nhanh lão hĩa và gây cạn kiệt nguồn cung cấp Theo thơng kê, cứ 10.000 kg vỏ cây Thơng đỏ
Taxus brevifolia thi sé phân lập được | kg taxol, tức là phải đồn hơn sáu cây Thơng đỏ mới cung cấp đủ nhu cầu cho một bệnh nhân [24] Từ nhu cẩu thực tế ngảy càng tăng
ma nguon nguyên liệu ngày cảng cạn kiệt, các nhả nghiên cửu phải tìm những nguồn
nguyên liệu thay thé, hoặc nuơi cấy mơ, hoặc bán tổng hợp taxol từ những tiền chất cĩ
nhiều trong các lồi cây 7axus Và theo hướng bản tổng hợp, người ta đã tìm ra một số
phương pháp bán tổng hợp taxol từ những tiên chất taxoid được tìm thấy trong cảnh vả
lá Thơng đĩ như hợp chất 10-Deacetyl baccatin IH (10-DAB) [24] và baccatin 1H [25| Chính vì vậy, taxoid được xem lả thành phân quan trọng trong các lồi Thơng đỏ mà ở đĩ cành, lá tạo thành nguồn nguyên liệu chủ động và kinh tế trong việc sản xuất được
liệu chữa trị ung thư
Ơ Việt Nam tơn tại 2 lồi Thơng đỏ là Thơng do la ngan Taxus chinensis (Pilg.)
Rebd & miễn Bắc và Thơng đỏ lá dải Taxus wallichiana Zucc ở Lâm Đơng [26] Các
Trang 7Khĩa luân tốt nghiệp
lồi Thơng đỏ lá ngăn khi xem xét về hàm lượng các hợp chất chính trong lá (10-
[)eacctyl baccatin IlI-tiên chất cho bán tổng hợp taxol) {34| Vì vay, loai Taxus wallichana can được nghiên cứu sâu nhăm nâng cao tiêm năng cung cấp nguồn
nguyên liệu để sản xuất thuốc trị bệnh ung thư ở Việt Nam Trong giới hạn của khỏa
luận, chủng tơi “Chiết tách, phân lập và xác định cầu trúc một số taxoid chính từ
cành, lá Thơng đỏ (Tavxus waflichiana Zucc.) được trồng tại Lâm Đồng" để gĩp
Trang 8Khĩa luận tốt nghiệp
DANH MỤC HÌNH ẢNH
H0 1.1214 và quá TRƠNG 0u 4agceooicoiiocciiotaciuse G0405 yEn3esxsaeie 10 Hinh 3.1: SKLM các nhân đoạn sau khi qua cột đdiaion - - <3 Seo 33
Hinh 3.2: SKLM các hợp chất đã được cơ lập so với cao CH;Cl; - 35 Bet Sake Pn DI Di Cá TT senaeareneerosraoanoseaesecceiraovglsggfcorbsar 36
Hinh 3:4: Phố IR bợp chất TOs) 6246664 0á Gác0543440140(01Äÿ244,Ậ006001,u: 37 KiiDb3/52 NT socooscvscioc6iascaxcsabsibiioiait403100G0930/008250081 G468 38
Trang 9Khĩa luận tốt nghiệp
DANH MỤC SƠ ĐỎ, BẢNG BIÊU
Sơ đỗ
Sơ đơ 3.1: Sơ đồ điều chế cao MeOH s St vs 211081111011100211., x0 32
Sơ đỏ 3.2: Sơ đơ điêu chế các phân đoạn s- cà tt stvrrvrrrsrrrrrersrrersrrreee 33
Sơ đơ 3.3 : Quả trình cơ lập các hợp chất T(H1,), T;(H12 ;) T;(IHIạ ;) và T(HHà) 34
Bảng biểu
Bang 1.1 : Các hợp chất được cơ lập từ lồi 7axws wallichiana - -:555c- 20 Bang 2.1: Kết quả kiểm tra các phân đoạn CỘT L S555 52c<xv<sseve 29 Bảng 2.2:Kết quả kiểm tra các phân đoạn của CỘT 2 - 2:25 ccccvrscrscrcees 30 Bảng 2.3: Kết quả kiêm tra các phân đoạn của CỘT 3 -.-22-222555czcccccccvs 3]
Bang 3.1: PhO UV ctia hợp chất T(II;) 2-52 6 2S 3E 3SECZ12E211722312223122 36
Bảng 3.3: Dữ liệu phỏ NMR của hợp chất T(111;) 5c 2vcsccscrrcsves 38
Trang 11Khoa luận tốt nghiệp Chương !' Tơng quan
CHUONG 1: TONG QUAN
1 Phân loại [1], [2], [11], [12], [14]
lén khoa hoc: Taxus wallichiana Zucc
Thong do la dai (Taxus wallichiana Zucc.), ho Thanh Ting (Taxaceae),
Vị trí cây Thơng đỏ trong hệ thơng phân loại thực vật:
- Giot (kingdom): Plantae Neganh (division); Pinophyta - Lp (class): Pinopsida
B6 (order): Pinales Ho (family): Taxaceae
- Loai (species): Taxus baccata L (Théng d6 chau Au), Taxus brevifolia
Nutt (Thong do Thai Binh Duong), Taxus canadensis (Théng do Canada), 7axus
celebrica, Taxus chinensis (Théng d6 Trung Quéc), Taxus cuspidata Zuce (Thong do
Nhat), Taxus floridana (Théng dé Florida), Taxus globosa (Thing dé Mexico), Taxus hunnewelli, Taxus jortunei, Taxus sumatrana (Théng d6 Sumatra), Taxus wallichiana
Zucc (Thơng do Himalaya)
2 Đặc điểm sinh hoc[1], [3], [4], [13], [15]
Thơng đỏ lá đài là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kich thude trung binh
hoặc nho, chậm lớn (cây sinh trưởng cả trăm năm chỉ cĩ đường kính khơng quá 3S
cm),
Chiều cao: 20-30 m; đường kinh ngang ngye: 1-1,5 m
Trang 12Khĩa luận tốt nghiệp Chương I: Tổng quan
Hình 1.1: Lá và quả Thơng đỏ
Cành: Xịe rộng, cành non mau lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4 năm, mọc phân tán tùy theo điều kiện mơi trường
Vỏ cây: Phía ngồi màu nâu đĩ nhạt, hơi dày, bĩc tách thành từng mảng hay
từng tắm nhỏ, thịt màu nâu đỏ
Lá: Dài 1,5-2,7 cm và rộng 2 mm, dạng dải mác, thăng, đơi khi hình lưỡi liêm, mềm, xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuơn thành đính nhọn, gốc lá mọc
xuống, mép lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí xanh
nhạt hơn ở hai bên gân giữa Lá của các chổi chính cĩ thể mọc dựng lên hơn là xếp
dãy
Nĩn: Phân tính khác gốc Nĩn cái đơn độc, cĩ một hạt và được bao quanh nhưng khơng bao kín bằng lớp áo hạt màu đỏ, chín trong l năm Nĩn đực tạo thành hàng ở nách lá, nhỏ, hình trứng, dài 6 mm và rộng 3 mm, nhưng khơng cĩ cuống hoặc
cuống rất nhỏ
Hạt: Hình trimg, dai 7 mm và rộng Š mm, màu đen khi chín 3 Phân bố
Thang 7/2006, tổ chức IUCN đã tìm thấy lồi Thơng đĩ lá đài tai Afghanistan,
Bhutan, tay nam Trung Quoc (Sichuan, Xizang, Yunnan), An Bé (Arunachal Pradesh,
Assam, Himachal Pradesh, Jammu-Kashmir, Manipur, Sikkim, Uttar Pradesh), phia
Trang 13
Khỏa luận tốt nghiệp Chương !: Tổng quan
bắc Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Philippin, Việt Nam
Ơ Việt Nam, lồi này được tỉm thấy ở một số vùng nủi cao thuộc các tỉnh Lào Cai
(Hồng liên Sơn), Khánh Hịa, Lâm Đơng (Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng Lạc
[Đương ) Hà Giang (Thái An-Quán Ba), độ cao phản hỗ 1400-1600 m hoặc hơn
Sự phân bổ của Thơng đỏ khả đa dạng trong khu vực Lâm Đơng nhưng số lượng cá thẻ ở mỗi nơi lại iL Số lượng cả thể nhiều nhất tại khu vực Núi Voi (100
cây), tại đây cây khơng bị che phú va phát triển tương đối tốt Ở những nơi bị che phủ
như I.án Tranh thì số lượng cá thể it (1 cây) Cĩ nơi cây lại giả cỗi, chăng hạn như khu vực Cơng Trời số lượng cá thẻ là 20 cây nhưng lại già cỗi, gần như khơng phát triển
nữa
4 Sinh thái
Phạm vi độ cao: 2000-3500 m so với mặt biến
Dạng rừng: Rừng nhiệt đới thưởng xanh
Cây càng lớn địi hỏi ánh sáng cảng cao Trong tẳng tu thế sinh thái, nơi nào cĩ
khoảng trống, lượng ánh sáng nhiều thi cây phát triển mạnh và ngược lại
Khí hậu: Nhiệt đới giĩ mùa, nhiệt độ trung bình năm 20-25°C, độ ẩm đất 30- 40%, độ ẩm khơng khí 85-90%, Thơng đỏ phân bố ở vùng khí hậu nhiệt đới núi thấp
vả trung bình cĩ 2 mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa kéo dài tử tháng 4 đến tháng 10,
lượng mưa trung binh 1600-1800 mm (Tài liệu của Đải khí tượng-thủy văn Lâm Đồng,
1980)
[hơ nhưỡng: Thích hợp với đất cỏ thành phân cơ giới nhẹ, thốt nước, phát
triển trên đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ trên đắt bazan, độ pH dat dao động
Š,I-Š,6,
Ihảm thực vật Ở Lâm Đơng, Thơng đỏ thường phân bố rải rác hẳn giao với
Trang 14Khỏa luận tốt nghiệp Chương |: Tổng quan
cic loai Dinh tung (Cephalotaxus mannii), Kim giao nam (Nageia wallichiana), Thơng tre la dai (Pedocarpus neriifolius), Thong nang (Dacrycarpus imbricatus), Du
sam (Keteleeria evelyniana) và một số loải thuộc Fagaceae, Ericaceae,
Euphorbiaceae
Hat phát tân khơng xa (với bán kinh 6-8 m so với từ tâm cây); nảy mam và phát triển nơi cĩ độ âm cao, cường độ ánh sáng trung bình Tỷ lệ nảy mắm trong tự nhiên
rất tháp so với số lượng hạt cây mang hàng năm
[ái sinh tự nhiên: Ít gặp, cây mâm vả cây non chịu bĩng tốt,
Trang 16Khỏa luân tốt nghiệp Chương !: Tơng quan (10) | “iy Ry hà 8; (11) - (12) Ễ % TRỤ _ , H a” a & oS (11) R) = Rp = Ry = Ry = Rg = Rị = Ốc, Rạ = H (12) Ry = Rg = OH, Ry = Rj = Ry = Rs = Ry = OAc Ry o fz R, (13) - (15) ° Ry
(13) Rug = Rag = Rs = OH, Ry H, Ry = OAc (14) Ryg = Ry = Rag “Rs = OH, Ry = OAc (15) Rig = Ry = Rag = Rs = OH, R> = H “ NH nể bu (16) - (1) Steere
(16) Rig = Ry - OH, Ry = OBz (17) Rig = OH, Ry» OAc R; = OBz
(18) Rig » O-xylosyl, Ry = OH, Ry = OBz
(19) Rig = O-xylosyl, Rp ~ OAc, Ry = OBz
Trang 18
Khĩa luận tốt nghiệp Chương !: Tỏng quan (25 AecOlle: “ (26) - (30) * « *% Ry
(26) R,; = Rg = OH, Ry © Ry @ OAc, Ry = OBz, Ry = H
Trang 22Khĩa luận tốt nghiệp Chương l: Tơng quan
HạC
HO
(57)
Tên và nguơn tài liệu của các hợp chất được cơ lập tir loai Taxus wallichiana
Bảng 1.1 : Các hợp chất được cơ lập từ lồi Taxus wallichiana _ Hợp chất Tên hợp chất Tài liệu tham khảo | = Toxoid 7 | Chattopadhyay etal, | l Taxusin (1996a, 1997) 2 2-Decacetyl-Š-decinnamoyltaxinine J Zhang ct al (1995c) = , Chattopadhyay Sharma 3 2-Deacetoxydecinnamoyltaxinine J (1995) Chattopadhyay va Sharma (1995), Zhang et _ al, (1995c) va 4 2a-Deacetoxytaxinine J Chattopadhyay, Saha, Kulshrestha, Sharma, Kumar (1996b)
1-Hydroxy-2-deacetyltaxinine J Zhang et al (1995c) 6 2°-Desacetoxyaustrospicatin Barboni et al (1994a)
Trang 24Khỏa luận tốt nghiệp ————————————-r r— x=.=—x.—x=Ỷ=Ek=Ỷ=E=-rkr-=sxcr=rkr=r——x=E=yFT——F—_—_—_. ._K EE———————————— Chương Ï: Tổng quan (1997) và Wang (1997)
22 ¬ 10-Deacetylcephalomannine McLaughlin et al (1981)
i, / Appendino et al (1992a),
23 14ƒ-Hydroxy- !0-deacetylbaccatin IH Bombardelli và Gabetta (1998) b= 2-Debenzoyl-14-B-benzoyloxy-10- 24 Appendino et al (1993e¢) deacetylbaccatin LH Chattopadhyay cl al 25 Baccatin IV ron (1996b) - 11(15—+1)abeotaxane 7 laze — Vander Velde et al 26 Brevifoliol (1994) 7 Chattopadhyay et al 27 13-Acetylbrevifoliol area (1996b)
_ 28 10-Debenzoyl-2-a-acctoxybrevifoliol Barboni et al, (1995b)
Appendino et al (1993a) 29 7-Deacetoxy-10-debenzoylbrevifoliol : va Barboni ct al (1993) Appendino et al (1993a) 30 10-Debenzoylbrevifoliol ị và Barboni et al (1993) [ - Vander Velde et al 3l Taxchinin A (1994) va Chattopadhyay et al (1996b)
32 Taxchinin H Barboni et al (1995b)
3 Taxacustin Zhang etal (1995c) -
Trang 25Khĩa luận tốt nghiệp Chương !: Tổng quan Chattopadhyay, Saha, 37 7.9.13-Deacety] abeobaccatin IV Kulshrestha, Sharma, va Roy (1997) 10,15-Epoxy-11(15—+ 1 jabeo-10- 38 nee ; Appendino et al (1993e) deacetylbaccatin III TS Non-taxoid isoprenoid Zhang et al (1995¢c) va 39 fi-Sitosterol Shrestha ct al.(1997) 40) Daucosterol " Zhang ct al (I995c) SỐ Lignan Chattopadhyay et al 4} Secoisolariciresinol (1997)
42 Hydroxymatairesinol Miller et al (1982)
_—— 43 Isoliovil Miller et al (1982)
[———— Chattopadhyay ct al
44 Isolariciresinol
(1997)
45 a-Conidendrin Miller et al (1982)
46 B-Conidendrin Miller et al (1982)
Chattopadhyay et al
47 Taxiresinol :
(1997) Flavonoid
Parveen, Taufeeq, Khan
Trang 26Khĩa luận tốt nghiệp Chương l: Tổng quan Qiu et al (1989) va Das 52 Amentoflavone et al (1994a) Hop chất khác nh số -4-(4'-Hydroxyphenyl)-2R-butanol|( va | aaa giai i88 y rhododendrol/betuligenol
a Deglycosylicariside B, Appendino ct al.(1993b)
55 Dehydrovomifoliol Appendino ct al.(1993b)
_ 56 Vomifoliol Appendino et al.(1993b)
Trang 27Ktỏa luận tốt nghiệp Chương l: Tổng quan
5.2 Trong nước
Năm 2005, Nguyễn Hữu Tồn Phan và cộng sự đã cơ lập được 4 hợp chất
tasoid chính tử lá và vỏ thân của cây Thơng đỏ lá dai thu hái tại Lâm Dơng bao gồm ; 10 deacetylbaccatin II] (10-DAB) (15), 19-hydroxybaccatin III (14), paclitaxel
(1axol) (17) với hiéu suat lan lugt 1a 0,05-0,1%, 0,02-0,04% và 0,005-0.01% trong lá
va 0.006% trong vo than, 7-xyloside-10-deacetyl taxol C (20) với hiệu suất là 0.1-
0,.5% trong vo than [28] [20]
Trong năm 2008, tử lá Thơng đỏ được thu hái tại tỉnh Lâm Đồng, nhĩm tác giả trên đã đã khảo sát các quá trinh chiết tỉnh đâu dưới tác dụng của sĩng siêu âm vả vi
sĩng Thành phân tỉnh dầu được xác định băng sắc kỷ khi và sắc ký khí kết hợp khối
phơ Irong đĩ các cầu tử bay hơi đặc trưng cho tỉnh dẫu của các lồi Thơng đỏ như
(Z)-3-hexen-l-ol và I-octen-3-ol cĩ hiệu suất cao nhất (35,98%; 5,60%) khi sử dụng
phương pháp chiết băng vi sĩng trong điều kiện khơng cĩ nước [Š]
Cũng trong năm này, Nguyễn Hữu Tồn Phan và cộng sự đã phân lập được taxol (17) và cephalomannin (21) Cả hai hợp chất trên cĩ hoạt tính gây độc tế bảo trên các dịng ung thư gan Hep-G2 rất mạnh với giá trị IC50 (ug/ml) lần lượt là 0,072 và
0.065 [6]
Năm 2008, tại trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM, Tiến sĩ Trần Cơng Luận
cùng cộng sự đã xác định được các đặc điểm vì học của lá và cảnh Thơng đỏ, các
thành phần hĩa học chính như: Alkaloid, saponin, taxoid và xác định cấu trúc của 10- DAB, tiền chất của taxol bằng cách áp dụng các phương pháp phân tích vi học, thành
phản hĩa thực vật bằng các phản ứng hĩa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, chiết tách
bảng kỹ thuật lĩng-lỏng lỏng-rắn và xác định cầu trúc của 10-1)AB băng các kỹ thuật
phỏ.| 27 |
Cũng tại đây, Nguyễn Ngọc Song Trâm củng cộng sự đã xây dựng thành cơng
quy trình định lượng 10-DAB va taxol trong la Théng do (Taxus wallichiana Zucc.,)
Trang 28Khĩa luận tỏi nghiệp Chương !: Tơng quan
dụng định lượng 10-DAB và taxol trong mẫu, từ đĩ cĩ thẻ so sánh, đánh giá sự khác biệt vẻ hàm lượng 2 taxoid chỉnh yêu nảy trong các nguơn nguyên liệu khác nhau |9|
Năm 2008, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết củng cộng sự đã khảo sát mơi quan hệ di truyền và hảm lượng 10-DAB của một số cây Thong do (Taxus wallichiana Zuce.) tai Lâm Đơng Với đổi tượng nghiên cứu là 7 mẫu Thơng đỏ Lâm Đồng (Taxi
wallichiana Zucc.) và | mau Théng do lay ở Hịa Bình (Taxus chinensis (Pilg.) Rebd.)
Định lượng 10-DAB bang phương pháp sắc ký lớp mỏng ghép quang phơ Phân tích
đầu hiệu di truyền 8 mẫu bằng kỹ thuật RAPD vả thiết lập mỗi quan hệ đi truyền bằng NTSYS Nhĩm nghiên cửu đã đưa ra kết quả là tỉ lệ phần trăm hàm lượng 10-DAB
trong các mẫu biến đổi, cao nhất là mẫu NV4 (0,205 %), thấp nhất là mẫu NV3 (0,029
%) Sự tương đồng giữa các mẫu thơng được khảo sát năm trong khoảng từ 0.41 đến 0,73 Với 10 mơi được sử dụng, thi hai mỗi OPF-14 và OPP-8 cho kết quả với băng
Trang 29CHƯƠNG 2
Trang 30Khỏa (uận tốt nghiện Chương 2- Thực nghiệm
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
l Nguyên liệu
Nguyên liệu sử dụng để nghiên cứu là lá và cảnh của cây Thơng do (Taxus wallichiana Zucc.) được trồng ở Lâm Đơng do trung tâm trồng và chế biến cây thuốc
Đá Lạt cũng cấp Sau khi thu hải, mẫu được phơi khơ và xay thành bột 2 Điều kiện thực nghiệm
2.1 Hĩa chất
- Methanol (Merck, Trung Quéc) Dichloromethane (Trung Quéc)
- Petroleum ether (Trung Quéc)
Acetone (Trung Quéc ) - Chloroform (Trung Quéc)
‘ Sulfuric acid (Trung Quéc) - Nước cắt hai lần
- Ethanol
- Silica gel G 0,06-0,02mm (Merck)
- Nhua Diaion HP-20 (Missubishi)
2.2 Trang thiết bị
- [ủ sây KC-65, tủ sây chân khơng VWRS/P
Can phan tich Meltler Toledo AB- 204
- Dén soi UV-VIS DESAGA SARTEDT GRUPPE,
- May co quav BUCHI R-114
Máy ảnh kĩ thuật số
May siêu âm EIma LC 60H (Duc)
liên cách thủy Memmert (Đức)
3 Cột sắc kí kich thước : 6 em x 60 cm, 3 cm x 60 cm, 2 cm x 40 cm
Trang 31
Khỏa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm
- linh phun thuộc thử
- Binh triển khai sắc ki
- Tu say,
: Máy sắc kí điều chế C-18 Star-chrom (Mỹ)
Bản nhơm tráng sẵn, loại silicagel 60 Fy54 (Merck) - Máy đo điểm chay: STUART SMP3
- Máy đo [R: Shimadzu FTIR-8201 PC
- May do UV: HeAios y Thermo Spectronic (UNICAM-UK)
- May ghi phd cong huéng tir hat nhan: AVANCE 500 BRUKER [500 MHz ('H)
va 125 MHz (°C), do trong CDCI3 & MeOD voi tetramcethy! silan (TMS) lam chat chuẩn nội
3 Phương pháp nghiên cứu 3.1, Chiết suất
Bột nguyên liệu (25 kg) được làm ẩm (18 I) và ngâm 24 gid (60 1), chiết ngắm
kiệt bằng MeOH (tỉ lệ 1:6), thu được 150 I dịch chiết Cơ giảm áp dịch chiết đến dạng
cao sệt (khoảng 10 1) thu duge cao MeOH thé (8 kg)
3.2 Lắc phân đoạn
Dùng | kg cao MeOH thơ hịa với | | nước rồi lắc với đichloromethane (khoảng
12 1), sau khi cơ giảm áp dịch dichloromethane ta thu được 200 g cao CH;Cl; (độ ẩm
7,2%)
3.3 Sắc kí cột diaion HP-20
Nạp 12 g cao CH;C]; vào cột diaion, rửa giải lần lượt với các dung mơi ; Nước
(1 1) MeOH 20% (2.5 l) MeOH 60% (8 1) MeOH 80% (3 1), MeOH 100% (3 1)
3.4 Sắc kí cột silica gel pha thuan
Trang 32Khĩa luận tốt nghiệp Chương 2: Thực nghiệm
cĩ độ phản cực tâng đản (100% PL: -+ 9:] -+ 8:2 —+ 7:3 —+ 5:5 —> 1009 acetone), dua
trên SKLM hiện mảu băng dung dịch H;SO; 10%%/1tOH thu được 3 phân đoạn (II, Cơ giảm áp dịch ở phan doan McOH 60% thu duge 2,5 g cao,
a)
3) va mot chat két tinh TCH) (ghỉ khối lượng lun nha)
Sứ dụng cột sắc kí với các thơng số sau (CỘT 1): Chat hap phu: Silica gel 60 Fos, (100 g) Quy cách cột: 3 cm x 60 em : Chiêu cao cột silica gel: 40 em - Tốc độ địng: 40 gioUphút : Thé tich mdi phan doan; 40 mi, Téng sé phan doan: 92
Đề kiểm tra thảnh phân tách của các phân đoạn hứng trong quá trình chiết tách, chúng tơi dùng SKLM, khai triển với hệ dung mơi: CHCI;:MeOH (9:1) Thuốc thử
phát hiện là H;SO; 10% /EtOH, phun say 110°C trong 5 phút
Bảng 2.1: Kết quả kiếm tra các phân đoạn CỘT 1
SKC silica gel phan doan 60% (2,Š g}) với hệ dung mỗi giả! lì PE:acctone
Hệ dung mơi Phân đoạn Phân
Trang 33Khỏa luận tốt nghiện Chương 2: Thực nghiệm
Sau khi qua cot silica gel phan doan MeOH 60% của cây Thơng đỏ tách được
một chất sạch T(III) và tách thành những phân đoạn tập hợp qua đĩ cũng loại được
một lượng lớn tạp màu Đề phân lập được đơn chất, phải tiếp tục tách vá tỉnh chế các phân đoạn tiếp theo
b) Tiếp tục tiền hảnh SKC silica gel phan doan II, (0,5 g) voi hé dung mdi
CHC];:MeOH cỏ độ phân cực tăng din (100% CHCl; — CHCI;:MeOH 100:5), các doan giống nhau trên SKLM được gom chung thu được ba phân đoạn lH1; ¡ HH;;, 1H
co
Sử dụng cột sắc kí với các thơng số sau: - Chat hap phy: Silica gel 60 Fs (60 g), - Quy cách cột: 2 em x 40 cm - Chiêu cao cột silica gel: 30 em - Tốc độ dịng: 25 gioUphút - Thẻ tích mỗi phân đoạn: 15 mi - Tổng số phân đoạn : 67 Bảng 2.2: Kết quả kiểm tra các phân đoạn của CỘT 2 Phân Hệ dung mơi Phân : đoạn mg | Thành phẩn tách | Ghi chú CHC];:MeOH - đoạn tập hợp CHC]; 100% - IH; 1-10 0.2 g Tạp + màu 100:5 WN 10-25 | 20mg 2 vết ———— , 100:5 | IHl› ; 40-67 | 025g 2 vết + tạp
Phân đoạn IIl; ; cĩ hai vét chính tiếp tục tiền hanh SKC silica gel pha dao voi
hệ dung mơi MeOl I:] |; (40:60)
Sử dụng cột sắc kí pha đảo trên máy MPL.C điều chế Thơng sơ cột sắc kí:
- Tốc độ dịng: 5ml/phủt
Trang 34
Khoa ludn tot nghiệp Chương 2- Thực nghiệm
[hẻ tích mỗi phân đoạn: 30 mI
- Tơng số phân đoạn: 12,
- Hệ dung mỗi: MeOH:H;© (tỉ lệ 40:60)
- Dau do: UV 250 nm
Sau khi qua cột sắc ki pha đảo trên máy MPLC điều chế, chúng tơi cơ lập được
hai chất tỉnh sạch kí hiệu lả T¡(H1ạ.;) (3 mg), T;(I11;.;) (10 mg)
c) SKC silica gel phan doan III, (0,8 ø) với hệ dung mơi CHCI;:MeOH cĩ độ phân cực tăng dân (100% CHC];—+ CHC];:MeOH 95:5), thu được kết tính trắng, kí hiệu T(111;) (80 mg)
Sử dụng cột sắc kỉ với các thơng số sau: - Chất hắp phụ: Silica gel 60 F254 (60 g) - Quy cach cot: 2 cm x 40 cm
- Chiểu cao cột silica gel: 30 cm Téc dO dong: 25 giot/phit Thể tích mỗi phân đoạn: 20 ml Tổng số phân đoạn: 49 Bảng 2.3: Kết quả kiểm tra các phân đoạn của CỘT 3 Phân
Hệ dung mơi Phân : `
Trang 35CHƯƠNG 3
Trang 36Khĩa luận tot nghiép Chương 3: Kết quả và tháo luận
CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
1 Kết quả quá trình chiết
Thực hiện phương pháp chiết ngắm kiệt cho 25 kg bột nguyên liệu Thơng đỏ
bằng MeOï1 (1:6) chủng tơi thu được khoảng 150 l dich chiết Sau khi cơ giảm áp, thu
được 8 kẹ cao MeOll thơ
Sơ đơ 3.1: Sơ đỏ điều chế cao MeOH | Bột nguyên liệu 25 kg _ | | Chiết ngắm kiệt với MeOH tỉ lệ 1:6 Dịch chiết MeOH 150 I Cơ chân khơng, thu hơi MeOH
Cao chiét MeOH
(dang sirol0,4 1) 8 kg cao thé
2 Kết quả lắc phân đoạn
Sau khi hỏa | l nước vào l kg cao MeOH thơ, lắc phân đoạn với khoảng 12 | CH¿ạCh, cê giảm úp dịch dịch trích ta thu được 200 g cao CH;C]; (độ âm 7,2%)
3 Kết quả sắc kí cột điaion HP-20
Nap 12 g cao CH)Cl) vào cột rồi rửa giải lắn lượt bằng các dụng mdi nude (1 1),
Trang 37Khĩa luận tốt nghiệp Chương 3: Kết quả và thảo luận
Sơ đề 3.2: Sơ đơ điều chế các phân đoạn
Cao chiết MeOH
(dang siro 1,3 1) Ikg cao thơ Hịa với I | nước, lắc với CH;C]; (24 l) Cao CHCl (450 g, 46 Am 7,2%) Sắc kí cột Diaion HP-20 | t| | fl Pd Pd Pd Pd Pd
H,O MeOH 20% McOH 60% MeOH 80% MeOH 100%
Trang 38Khĩa luận tơi nghiệp Chương 3: Kết quả và thảo luận
Sau khi qua cột điaion ta đã loại được một lượng lớn tạp và trong phân đoạn MeOl1 60% các vét hiện lên rat rd gon Do do phan doan MeOH 60% được tiép tuc
cho qua các cột silica gel để cơ lập taxoid
4 Kết quả cơ lập các taxoid
[.ấy 2.5 ø cao của phân đoạn MeOll 60% đẻ thực hiện sắc kí cột hắp phụ trên
silica gel pha thưởng vả pha đảo với nhiều hệ dung mơi giải li cd dé phan cực khác
nhau, chủng tơi đã cõ lập được bốn hợp chất, ki hiệu: chất T(H1;) (30 mg), T;(HH;¿) (3 mg), E;(IHạ ;} ( mg) và T(1H1:) (180 mg)
Quả trình cơ lập các hợp chất T(IH,), TH;¿), Tạ(IH;;) và T(1H1y) được trình bày trong sơ đỏ 3.3
Sơ đỗ 3.3 : Quá trình cơ lập các hợp chất T(HH)), TH; ;), Tạ(H; ;) và T(H1;)
Trang 39
Khĩa luận tốt nghiệp Chương 3: Kết quả và thảo luận Phan doan McOH 60% (2,52) SKC silica gel PE:aceton Ill, (0,8 g) TH,) (30 mg) SKC silica gel CHChL:MeOH (180 mg) SKC silica gel pha dao MeOH:H,0 (4:6) TC.) TAU.) (3 mg) (10 mg) Dưới đây là hình sắc kí thế hiện các hợp chất đã được cơ lập so với cao CH;Cl;:
Coo TIL) 6 [†, 1: Trim Coo TIL) W%, 1, Tt tim
am, Gh ah ) ah.)
Hình 3.2: SKLM các hợp chất đã được cơ lập so với cao CH;C];
Trang 40
Khĩa luận tốt nghiệp Chương 3: Kết quả và thảo luận
5 Biện giải cầu trúc các taxoid thu được
5.1 Hợp chất T(H;)
Hợp chất T(IIL:) được cơ lập dưới dạng tỉnh thẻ hình kim màu trăng, tan trong hệ dung mơi CHCI;:HyO, SKLM với hệ dung mơi CHCI;:H;O (9:1) cho vét tron, hap