Xác định sự hiện diện của gene sea seb và sự đề kháng methicilin vancomycin của một số chủng staphylococcus aureus phân lập từ mẫu thực phẩm đường phố

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THUÝ PHƯƠNG NHƯ XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA GENE sea, seb VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG METHICILLIN, VANCOMYCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG Staphylococcus aureus PHÂN LẬP TỪ MẪU THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THUÝ PHƯƠNG NHƯ XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA GENE sea, seb VÀ SỰ ĐỀ KHÁNG METHICILLIN, VANCOMYCIN CỦA MỘT SỐ CHỦNG Staphylococcus aureus PHÂN LẬP TỪ MẪU THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH SƯ PHẠM SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS Trần Thị Minh Định THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2022 i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Thạc sĩ Trần Thị Minh Định hết lòng hướng dẫn, quan tâm sâu sát em suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Minh Thư K43 Khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP HCM chị Nguyễn Ngọc Yến Nhi – nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh hết lịng hỗ trợ em thực số thí nghiệm Em xin cảm ơn Trường Đại học Sư phạm Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí cho em thực thí nghiệm khóa luận thông qua đề tài cấp sở mã số CS.2021.19.40 Em xin chân thành cảm ơn Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ em thực thí nghiệm sinh học phân tử khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên thực đề tài phịng thí nghiệm Sinh hóa – Vi sinh bạn khóa 44, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh ln đồng hành chia sẻ suốt thời gian em thực đề tài Em xin bày tỏ lịng biết ơn đến Q Thầy Cơ Khoa Sinh học - Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh tạo tảng kiến thức tận tình dạy dỗ em suốt năm học qua Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, người thân ln chỗ dựa tinh thần vững cho Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 05 năm 2022 SINH VIÊN Lê Thuý Phương Như ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Thời gian địa điểm nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Staphylococcus 1.2 Vi khuẩn S aureus 1.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hố .4 1.2.2 Điều kiện tăng trưởng phân bố .5 1.2.3 Khả gây bệnh 1.3 Độc tố ruột enterotoxin S aureus 1.4 Tình hình ngộ độc S aureus 1.5 Tình hình nghiên cứu xác định diện gene sea, seb đề kháng kháng methicillin, vancomycin S aureus 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2 Thiết bị dụng cụ 17 2.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 18 2.4 Các hoá chất sử dụng đề tài 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 22 iii Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Kết phân lập vi khuẩn S aureus 29 3.2 Xác định chủng S aureus 31 3.3 Kết định lượng vi khuẩn S aureus thực phẩm 35 3.4 Kết thực phản ứng PCR để xác định có mặt gene sea seb S aureus 37 3.5 Xác định chủng S aureus kháng methicillin 40 3.5.1 Xác định chủng S aureus có kiểu hình kháng methicillin 40 3.5.2 Xác định chủng S aureus có kiểu gene mecA 42 3.6 Kết khảo sát đề kháng vancomycin 43 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú giải SEs Staphylococcal enterotoxins – độc tố ruột S aureus SEA Staphylococcal enterotoxins A SEB Staphylococcal enterotoxins B sea Gene sinh độc tố ruột A seb Gene sinh độc tố ruột B CPS coagulase-positive staphylococci – Tụ cầu dương tính coagulase CNS coagulase-negative staphylococci - Tụ cầu âm tính coagulse MSA Manitol Salt Agar BP Baird-Parker egc enterotoxin gene cluster - Cụm gene sinh độc tố ruột NST nhiễm sắc thể PAI pathogenicity island – vùng tiểu đảo sinh bệnh MRSA methicillin-resistant S aureus - S aureus đề kháng methicillin VRSA vancomycin-resistant S aureus - S aureus đề kháng vancomycin VISA vancomycin-intermediate S aureus - S aureus nhạy cảm trung gian với vancomycin MHA Mueller-Hinton Agar CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CFU Colony forming unit R resistant - đề kháng S susceptible - nhạy cảm v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Những lồi thuộc chi Staphylococcus dương tính với coagulase Bảng 2.1 Các mẫu bánh mì thịt sử dụng đề tài 17 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 17 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi sử dụng đề tài 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 3.1 Số khuẩn lạc có đặc điểm đặc trưng S aureus 29 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả sinh acid từ mannitol hoạt tính coagulase chủng S aureus giả định 32 Bảng 3.3 Kết định lượng S aureus từ mẫu thực phẩm đường phố 35 Bảng 3.4 Kết đề kháng oxacillin chủng S aureus 40 Bảng 3.5 Kết đề kháng vancomycin S aureus 44 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào S aureus Gram dương kính hiển vi (100X) Hình 1.2 Tổng quan ngộ độc thực phẩm tụ cầu 10 Hình 2.1 Thang DNA ladder 200 bp (HT Biotech) 18 Hình 2.2 Quy trình thực thí nghiệm 23 Hình 2.3 Chu trình nhiệt sử dụng phản ứng PCR 27 Hình 3.1 Khuẩn lạc phân lập từ mẫu bánh mì thịt mơi trường BP 30 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc S aureus giả định nuôi cấy 48 môi trường BP 30 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc S aureus giả định môi trường MSA sau 24 nuôi cấy 33 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc S aureus giả định mơi trường MSA sau 48 nuôi cấy 33 Hình 3.5 Kết thử coagulase 34 Hình 3.6 Kết thử coagulase 34 Hình 3.7 Phân lập vi khuẩn từ bánh mì thịt nồng độ 10-2 36 Hình 3.8 Phân lập vi khuẩn từ bánh mì thịt nồng độ 10-2 36 Hình 3.9 Điện di sản phẩm PCR phát gene sea gel agarose 2% 37 Hình 3.10 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR gene seb 38 Hình 3.11 Kết khảo sát đề kháng oxacillin 41 Hình 3.12 Kết khảo sát đề kháng oxacillin 41 Hình 3.13 Điện di sản phẩm PCR phát gene mecA gel agarose 2% 42 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Trong loại thức ăn đường phố sử dụng hàng ngày bánh mì thịt loại thức ăn thông dụng nhiều người lựa chọn ngon miệng, giá thành thấp cịn cung cấp cho thể protein dễ tiêu hố chất dinh dưỡng góp phần đáng kể đến cân phần bữa ăn [1] Tuy nhiên, bánh mì thịt thường bày bán đường phố nên điều kiện chế biến, bảo quản bày bán không đảm bảo vệ sinh không kiểm soát nên tiềm ẩn nguy nhiễm vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm Trong số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, tụ cầu vàng S aureus nguyên nhân [2] Khi tụ cầu sinh trưởng thức ăn, chúng sinh độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxin, SE) chúng gây triệu chứng buồn nôn, nôn mửa dội, đau bụng tiêu chảy người tiêu thụ thức ăn nhiễm độc tố ruột tụ cầu [3] Độc tố ruột tụ cầu vàng loại độc tố mạnh, có tính ổn định cao, chịu nhiệt kháng với hầu hết enzyme phân huỷ protein (pepsin trypsin) pH thấp chúng giữ hoạt tính đường tiêu hoá sau ăn vào bụng [4] Một số độc tố ruột thường gặp S aureus staphylococcus enterotoxin A (SEA) staphylococcus enterotoxin B (SEB) [5] Hơn nữa, xuất chủng vi khuẩn S aureus có khả đa kháng kháng sinh làm cho diện S aureus thức ăn đáng quan tâm chúng mang gene kháng kháng sinh lan truyền cho loại vi khuẩn gây bệnh khác [6] Đặc biệt chủng S aureus kháng methicillin (MRSA) mang gene mecA mã hoá cho protein gắn penicillin (penicillin-biding protein) có cấu trúc thay đổi, ức chế hiệu loạt thuốc kháng sinh [7] Hiện nay, kháng sinh điều trị tiêu chuẩn cho MRSA vancomycin Tuy nhiên, nhiều quốc gia phát gia tăng chủng MRSA kháng (VRSA – vancomycin-resistant S aureus) nhạy cảm trung gian (VISA – vancomycin-intermediate S aureus) với vancomycin [8] [9] Từ lý trên, đề tài: “Xác định diện gene sea, seb đề kháng methicillin, vancomycin số chủng Staphylococcus aureus phân lập từ mẫu thực phẩm đường phố” thực 2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập S aureus từ bánh mì thịt, xác định diện gene sea seb số chủng phân lập Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn S aureus phân lập từ số thực phẩm đường phố khu vực quận thành phố Hồ Chí Minh Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập chủng vi khuẩn S aureus từ bánh mì thịt hàng quán vỉa hè khu vực quận thành phố Hồ Chí Minh - Thử nghiệm khả tạo acid từ mannitol - Thử hoạt tính coagulase để xác định vi khuẩn S aureus - Định lượng chủng vi khuẩn S aureus có mẫu thực phẩm - Phát gene sinh độc tố enterotoxin A (sea) enterotoxin B (seb) - Khảo sát đề kháng methicillin chủng S aureus - Xác định có mặt gene mecA Phạm vi nghiên cứu Đề tài tiến hành phân lập, định lượng phát gene sea seb số chủng S aureus có mặt mẫu bánh mì thịt bày bán đường Nguyễn Biểu Phường 2; đường Trần Bình Trọng, Lê Hồng Phong An Dương Vương Phường 4, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 11 tháng 12 năm 2021 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian: tháng (11/2021 – 03/2022) - Địa điểm: + Các thí nghiệm vi sinh thực phịng thí nghiệm Sinh hóa – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh + Các thí nghiệm sinh học phân tử thực Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 37 cho thấy 136 mẫu nhiễm S aureus, chiếm 15,7% Nguyễn Thị Giang cộng khảo sát kiểm tra 85 mẫu thực phẩm nguyên liệu sống, 166 mẫu thực phẩm chế biến thuộc nhóm trứng, thịt, cá, 122 mẫu từ bàn tay 122 người chế biến thực phẩm, 82 mẫu dụng cụ chứa đựng chế biến thực phẩm số trường tiểu học bán trú địa bàn Hà Nội Kết cho thấy 68 mẫu nhiễm S aureus chiếm 18,9% [55] Kết định lượng của nghiên cứu cao kết định lượng 3.4 Kết thực phản ứng PCR để xác định có mặt gene sea seb S aureus Để phát có mặt gene sea seb; 16 chủng S aureus tiến hành phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gene sea seb với cặp mồi bảng 2.2 Sau đó, sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% Kết trình bày hình 3.9 hình 3.10 Hình 3.9 Điện di sản phẩm PCR phát gene sea gel agarose 2% M: thang DNA HT200 (HTBiotech), giếng 1: chủng 4(-2)I3, giếng 2: 4(-2)I9, giếng 3: 4(-2)II29, giếng 4: 4(-3)II1, giếng 5: 7(-2)I15, giếng 6: 7(-2)I16, giếng 7: 7(-2)II11, giếng 8: 7(-2)II16, giếng 9: 8(-2)II3, giếng 10: 8(-2)II6, giếng 11: 8(-2)III5, giếng 12: 8(-2)III6, giếng 13: 8(-2)III7, giếng 14: 8(-2)III9, giếng 15: 8(-2)III10, giếng 16: 8(-2)III11 (-): đối chứng âm 38 Hình 3.10 Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR gene seb M: thang DNA HT200 (HTBiotech), giếng 1: chủng 4(-2)I3, giếng 2: 4(-2)I9, giếng 3: 4(-2)II29, giếng 4: 4(-3)II1, giếng 5: 7(-2)I15, giếng 6: 7(-2)I16, giếng 7: 7(-2)II11, giếng 8: 7(-2)II16, giếng 9: 8(-2)II3, giếng 10: 8(-2)II6, giếng 11: 8(-2)III5, giếng 12: 8(-2)III6, giếng 13: 8(-2)III7, giếng 14: 8(-2)III9, giếng 15: 8(-2)III10 giếng 16: 8(-2)III11 (-): đối chứng âm Theo lí thuyết, chủng S aureus mang gene sea, gel agarose xuất vạch tương ứng 544 bp chủng S aureus mang gene seb, gel agarose xuất vạch tương ứng 404 bp [50] Tuy nhiên, điện di hình 3.9 hình 3.10 cho thấy tất 16 chủng S aureus không xuất vạch DNA mục tiêu Báo cáo trước Kroning cộng sử dụng cặp mồi để phát chủng dương tính với gene sea gene seb mẫu bánh kẹo làm thủ công [56] Điều chứng tỏ 16 chủng không mang gene sea, seb khơng có nguy tiết độc tố ruột SEA SEB Cho dù khơng sinh độc tố thực phẩm nhiễm S aureus phản ánh tình trạng vệ sinh Như vậy, thấy 16 chủng S aureus mà phân lập bánh mì thịt khu vực quận 5, thành phố Hồ Chí Minh khơng mang gene sea gene seb Trong nghiên cứu Wang cộng năm 2017 Trung Quốc phát có 103/1150 chủng vi khuẩn S aureus mang gene sea chiếm 9% 120/1150 chủng vi khuẩn S aureus mang gene seb chiếm 10,4% Kết nghiên cứu khác Trung Quốc cho thấy tổng 1150 chủng S aureus phân lập từ 2700 mẫu thực phẩm bán lẻ có 341/1150 chủng mang gen sinh độc tố, chiếm tỷ lệ 29,7% [27] 39 Ở Iran, nghiên cứu khả tạo độc tố chủng S aureus thực phẩm có nguồn gốc động vật gồm sữa tươi, sản phẩm từ sữa loại thịt sống cho thấy 1050 mẫu kiểm tra có 98 chủng S aureus 63 chủng có gene sinh độc tố ruột cổ điển (sea, seb, sec, sed see) chiếm tỷ lệ 64,3% gene sea phổ biến chiếm 25,5% [28] Năm 2018, tổng số 90 mẫu thịt riêng lẻ thu thập từ cửa hàng bán lẻ thịt nhà hàng Zanjan, Iran tiến hành điều tra tần suất sinh độc tố ruột S aureus gen se Tổng số 31 (34,4%) mẫu thịt dương tính với diện S aureus Khả sinh độc tố ruột xác định 18 (20,0%) số 90 mẫu thịt kỹ thuật ELISA Gene se phổ biến sea (38,7%), see (22,6%), sec (16,1%) seb (12,9%) Các gene se khơng tìm thấy chủng phân lập từ mẫu thịt nấu chín [29] Nghiên cứu chúng tơi tương tự, không phát gene sea seb chủng vi khuẩn S aureus phân lập từ mẫu thịt nấu chín Năm 2020, nghiên cứu Samosa Falafel, Iran tiến hành nhằm xác định tỷ lệ nhiễm S aureus phân lập từ ăn vặt phổ biến Kết cho thấy 56 (46,67%) mẫu bị nhiễm S aureus, 45 mẫu phân lập (80,35%) đặc trưng S aureus gây độc tố ruột Tỷ lệ xuất cao thuộc gene sea 20 chủng phân lập (35,71%) dương tính với gene [30] Tương tự tỷ lệ phát gene sea seb nghiên cứu Đài Loan cao nghiên cứu chúng tôi, dùng mồi PCR đặc hiệu để phát gene se 147 chủng S aureus phân lập từ trường hợp ngộ độc thực phẩm cho thấy 109 (74,1%) dương tính với nhiều gene se Trong số đó, loại độc tố ruột chủ yếu sea (28,6%), seb (20,4%) Gần đây, số nghiên cứu khác Việt Nam cho thấy có 19/72 chủng S aureus (26,8%) có khả sinh độc tố sea, seb chiếm 42% [38] Năm 2017, nghiên cứu khác tiến hành 68 chủng phân lập từ đối tượng mẫu từ bàn tay người chế biến, dụng cụ chứa đựng, chế biến thực phẩm, thực phẩm sống, chín thu từ 36 trường tiểu học bán trú 12 quận nội thành Hà Nội Kết cho thấy tỉ lệ S aureus mang gene độc tố sea, seb, sec 20,6% [39] Tỷ lệ S aureus mang gene sea seb báo cáo từ vùng khác giới ước tính 40 11,5 – 35,71% 12,9 – 20,4% nước châu Á [27], [28], [29], [30], [31], [32]; chiếm 5,4- 56,29% [36] 6,25% - 37,77% châu Phi [34], [40] 3.5 Xác định chủng S aureus kháng methicillin Việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh dẫn đến xuất chủng đa kháng thuộc, đặc biệt MRSA Những chủng vi khuẩn dễ dàng lây nhiễm thơng qua đường ăn uống dẫn đến việc điều trị sau gặp tổn hại tình trạng kháng methicillin [57] Do đó, việc xác định chủng kháng methicillin (MRSA) cần thiết MRSA xác định thơng qua kiểu hình kháng oxacillin kiểu gene mecA Do đó, nhằm tiếp tục tìm hiểu nguy gây hại chủng S aureus phát đề tài, 16 chủng S aureus tiếp tục khảo sát đề kháng methicillin thông qua phương pháp kháng sinh đồ theo Kirby-Bauer với kháng sinh oxacillin xác định kiểu gene mecA phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 3.5.1 Xác định chủng S aureus có kiểu hình kháng methicillin Theo tài liệu CLSI năm 2019, kiểu hình kháng methicillin xác định cách khảo sát đề kháng với khoanh giấy chứa cefoxitin 30µg Kết kháng sinh đồ trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết đề kháng oxacillin chủng S aureus Đường kính Stt Chủng 4(-2)I3 25 ± 0,6 S 4(-2)I9 21,0 ± 0,0 R 4(-2)II29 24,0 ± 0,0 S 4(-3)II1 11,0 ± 0,0 R 7(-2)I15 26,3 ± 0,6 S 7(-2)I16 28 ± 0,0 S 7(-2)II11 29,3 ± 0,6 S 7(-2)II16 27,0 ± 0,0 S vịng vơ khuẩn (mm) Kết 41 Đường kính Stt Chủng 8(-2)II3 35,0 ± 0,0 S 10 8(-2)II6 40,0 ± 0,0 S 11 8(-2)III5 35,3 ± 0,6 S 12 8(-2)III6 33,7 ± 0,6 S 13 8(-2)III7 32,7 ± 0,6 S 14 8(-2)III9 30,3 ± 1,2 S 15 8(-2)III10 30,0 ± 0,0 S 16 8(-2)III11 33,7 ± 0,6 S vịng vơ khuẩn (mm) Kết Nhạy cảm (S, susceptible): đường kính vịng vô khuẩn ≥ 22 mm, Đề kháng (R, resistant): đường kính vịng vơ khuẩn ≤ 21 mm Hình 3.11 Kết khảo sát đề Hình 3.12 Kết khảo sát đề kháng oxacillin kháng oxacillin Chủng 4(-2)I9 đề kháng với oxacillin Chủng 4(-3)II1 đề kháng với oxacillin Kết bảng 3.8 cho thấy 14/16 chủng S aureus nhạy cảm với oxacillin, chiếm tỉ lệ 87,5% , 2/16 chủng S aureus đề kháng với oxacillin, chiếm tỉ lệ 12,5% Cả chủng đề kháng với oxacillin phân lập từ mẫu (Hình 3.11 Hình 42 3.12) Theo tài liệu CLSI 2019, chủng xác định có kiểu hình MRSA Như vậy, số mẫu bánh mì thịt khảo sát đề tài, có mẫu nhiễm MRSA chiếm tỉ lệ 20,00%, mẫu không nhiễm MRSA chiếm tỉ lệ 80,00% Kết có tỷ lệ chủng kháng oxacillin thấp nghiên cứu năm 2020 thực 49 mẫu sữa dê Brazil cho thấy tất mẫu bị nhiễm S aureus Các chủng đề kháng với loại kháng sinh chiếm tỉ lệ 89,79% Tỉ lệ chủng đề kháng với oxacillin 75,51% Các chủng MRSA chiếm tỉ lệ 4,08% [41] 3.5.2 Xác định chủng S aureus có kiểu gene mecA Sự kháng methicillin S aureus mang gene mecA làm thay đổi cấu trúc Penicillin binding protein (PBP) thành PBP2a không lực với methicillin Sự diện PBP2a làm cho chủng MRSA kháng toàn họ kháng sinh ß-lactam [58] Do đó, chủng 4(-2)I9 4(-3)II1 có kiểu hình MRSA thực thêm phản ứng PCR phát gen mecA với cặp mồi bảng 2.2 Kết trình bày hình 3.13 Hình 3.13 Điện di sản phẩm PCR phát gene mecA gel agarose 2% M: thang DNA HT200 (HTBiotech), giếng 1, 2: chủng 4(-2)I9; giếng 3, 4: chủng 4(-3)II1 (-): đối chứng âm Theo lí thuyết chủng S aureus có mang gene mecA gel agarose xuất vạch DNA có kích thước 509 bp [51] Kết điện di sản phẩm PCR 43 gel agarose Hình 3.13 cho thấy giếng xuất sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 509 bp theo Ladder 200 bp, cho vạch mờ vạch đậm khơng bị đứt gãy phù hợp với kích thước lí thuyết Điều cho thấy cặp mồi MECAF/MECAR sử dụng để khuếch đại gen mecA nhân thành công đoạn gene có kích thước tương đương với kích thước gen mecA (509 bp theo lí thuyết) Vậy chủng 4(-2)I9 4(-3)II1 mang mecA Kết khẳng định chủng 4(-2)I9 4(-3)II1 chủng MRSA Các chủng MRSA đề kháng với -lactam chúng mang gene mecA, gene nằm DNA gene vi khuẩn yếu tố di truyền vận động, dễ dàng lan truyền sang vi khuẩn khác [58] Vào năm 2017, Wang cộng báo cáo 7,9% thực phẩm bán lẻ dương tính với mecA Trong chủng S aureus mang gene mecA nghiên cứu chiếm 12,5%, cao 4,6% Một nghiên cứu khác thực từ tháng 12 năm 2014 – tháng năm 2015 thành phố Mekelle, Ethiophia mẫu sữa tươi, yogurt thịt Số mẫu nhiễm S aureus chiếm 39,1% Trong số chủng phân lập, 12/36 chủng mang gene mecA chiếm 37,5% [42] Kết nghiên cứu cao nghiên cứu 25% số chủng mang gene mecA Kết nghiên cứu Wang cộng năm 2017 Trung Quốc cho thấy 44/1150 chủng vi khuẩn S aureus mang gene mecA chiếm 3,8% Như số liệu mà thu tỷ lệ số chủng vi khuẩn S aureus mang gene mecA thu bánh mì thịt cao 8,7% Tuy nhiên, với điều kiện chế biến người kinh doanh thức ăn đường phố không đảm bảo vệ sinh nay, khả nhiễm chéo vi khuẩn từ da niêm mạc người sang thức ăn qua đường chế biến công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người vào thực phẩm điều dễ dàng xảy 3.6 Kết khảo sát đề kháng vancomycin Kháng sinh điều trị tiêu chuẩn cho MRSA vancomycin Tuy nhiên, nhiều quốc gia phát gia tăng chủng MRSA kháng (VRSA – vancomycin-resistant S aureus) nhạy cảm trung gian (VISA – vancomycin-intermediate S aureus) với vancomycin [8] [9] Do đó, đề tài tiếp tục 44 khảo sát đề kháng vancomycin chủng phân lập Kết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết đề kháng vancomycin S aureus Stt Chủng Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Kết 4(-2)I3 16,0 ± 0,0 S 4(-2)I9 16,0 ± 0,0 S 4(-2)II29 18,0 ± 0,0 S 4(-3)II1 15,0 ± 0,0 S 7(-2)I15 16,3 ± 0,6 S 7(-2)I16 18,3 ± 0,6 S 7(-2)II11 15,3 ± 0,6 S 7(-2)II16 15,7 ± 0,6 S 8(-2)II3 40,0 ± 0,0 S 10 8(-2)II6 20,0 ± 0,0 S 11 8(-2)III5 19,0 ± 0,0 S 12 8(-2)III6 30,3 ± 1,2 S 13 8(-2)III7 18,0 ± 0,0 S 14 8(-2)III9 19,0 ± 0,0 S 15 8(-2)III10 18,0 ± 0,0 S 16 8(-2)III11 19,0 ± 0,0 S Nhạy cảm (S, susceptible): đường kính vịng vơ khuẩn ≥ 15 mm, Trung gian (I, intermediate) đề kháng (R, resistant): đường kính vịng vơ khuẩn < 15 mm Kết bảng 3.5 cho thấy 16/16 chủng S aureus nhạy cảm với kháng sinh vancomycin Một nghiên cứu thực từ tháng 12 năm 2014 – tháng năm 2015 thành phố Mekelle, Ethiophia mẫu sữa tươi, yogurt thịt Số mẫu nhiễm S aureus chiếm 39,1% Trong đó, 32 chủng kiểm tra đề kháng kháng sinh, 45 kết cho thấy chúng đề kháng với vancomycin chiếm 59,4%[42] Trong chủng S aureus nghiên cứu nhạy cảm với vancomycin 46 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đề tài phân lập S aureus từ mẫu bánh mì thịt, kết cho thấy có 3/5 mẫu nhiễm S aureus, 2/5 mẫu không nhiễm S aureus - Tổng cộng 16 chủng khẳng định S aureus nhờ đặc điểm đặc trưng môi trường BP, khả sinh acid từ mannitol phản ứng coagulase (+) - Mẫu bánh mì thịt 4, 7, nhiễm S aureus mật độ 3x102, 4x102, 8x102 CFU/g thực phẩm - Cả 16 chủng S aureus không mang gene sea gene seb - chủng xác định MRSA thơng qua kiểu hình kháng methicillin kiểu gene mecA - Tất 16 chủng S aureus nhạy cảm với vancomycin 4.2 Kiến nghị - Sử dụng chủng S aureus công bố mang gene sea seb để làm đối chứng dương cho phản ứng PCR phát gene sea seb 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Salem, N Shawky, and L Abo-Hussein, ‘Microbiological Profile of Some Meat Products in Menofia Markets’, Benha Veterinary Medical Journal, vol 34, no 2, pp 1–7, Jun 2018, doi: 10.21608/bvmj.2018.28963 [2] J Kadariya, T C Smith, and D Thapaliya, ‘Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health’, BioMed Research International, vol 2014, pp 1–9, 2014, doi: 10.1155/2014/827965 [3] Å Rosengren, M Lindblad, and R Lindqvist, ‘The effect of undissociated lactic acid on Staphylococcus aureus growth and enterotoxin A production’, International Journal of Food Microbiology, vol 162, no 2, pp 159–166, Mar 2013, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.01.006 [4] C Hernández-Cortez, I Palma-Martínez, L UrielGonzalez-Avila, A GuerreroMandujano, and R C S and G Castro-Escarpulli, Food Poisoning Caused by Bacteria (Food Toxins) IntechOpen, 2017 doi: 10.5772/intechopen.69953 [5] Phạm Duy Tường, Dinh Duong Va An Toan Thuc Pham Nxb Giáo dục, 2012 [6] Lê Huy Chính, Vi Sinh Vật Y Học NXB Y Học, 2013 [7] Y Katayama, T Ito, and K Hiramatsu, ‘A New Class of Genetic Element, Staphylococcus Cassette Chromosome mec, Encodes Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus’, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol 44, no 6, pp 1549–1555, Jun 2000, doi: 10.1128/AAC.44.6.1549-1555.2000 [8] V K Moses, V Kandi, and S K D Rao, ‘Minimum Inhibitory Concentrations of Vancomycin and Daptomycin Against Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus Isolated from Various Clinical Specimens: A Study from South India’, Cureus, vol 12, no 1, Jan 2020, doi: 10.7759/cureus.6749 [9] Shrivastava, ‘World health organization releases global priority list of antibioticresistant bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics’ [10] S Even et al., ‘Low occurrence of safety hazards in coagulase negative staphylococci isolated from fermented foodstuffs’, Int J Food Microbiol, vol 139, no 1–2, pp 87–95, Apr 2010, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010.02.019 [11] J.-A Hennekinne, M.-L De Buyser, and S Dragacci, ‘Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation’, FEMS Microbiology Reviews, vol 36, no 4, pp 815–836, Jul 2012, doi: 10.1111/j.1574-6976.2011.00311.x [12] M K Sandel and J L McKillip, ‘Virulence and recovery of Staphylococcus aureus relevant to the food industry using improvements on traditional approaches’, Food Control, vol 15, no 1, pp 5–10, Jan 2004, doi: 10.1016/S0956-7135(02)00150-0 [13] D El-Hadedy and S Abu El-Nour, ‘Identification of Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from Egyptian food by conventional and molecular 48 methods’, Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, vol 10, no 1, pp 129–135, Jun 2012, doi: 10.1016/j.jgeb.2012.01.004 [14] Nguyễn Đỗ Phúc, ‘Nghiên cứu xác định độc tố ruột (enterotoxin) staphylococcus aureus gây ngộ độc thực phẩm’, Accessed: May 10, 2022 [Online] Available: https://123docz.net/document/3026393-nghien-cuu-xacdinh-doc-to-ruot-enterotoxin-cua-staphylococcus-aureus-gay-ngo-doc-thucpham.htm [15] M Á Argudín, M C Mendoza, and M R Rodicio, ‘Food Poisoning and Staphylococcus aureus Enterotoxins’, Toxins (Basel), vol 2, no 7, pp 1751– 1773, Jul 2010, doi: 10.3390/toxins2071751 [16] S Y C Tong, J S Davis, E Eichenberger, T L Holland, and V G Fowler, ‘ Staphylococcus aureus Infections: Epidemiology, Pathophysiology, Clinical Manifestations, and Management’, Clinical Microbiology Reviews, vol 28, no 3, pp 603–661, Jul 2015, doi: 10.1128/CMR.00134-14 [17] P S Mead et al., ‘Food-related illness and death in the United States’, Emerg Infect Dis, vol 5, no 5, pp 607–625, Oct 1999, doi: 10.3201/eid0505.990502 [18] N Sundararaj, N K Kalagatur, V Mudili, K Krishna, and M Antonysamy, ‘Isolation and identification of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolates from Indian food samples: evaluation of in-house developed aptamer linked sandwich ELISA (ALISA) method’, J Food Sci Technol, vol 56, no 2, pp 1016–1026, Feb 2019, doi: 10.1007/s13197-019-03568-1 [19] E Scallan et al., ‘Foodborne Illness Acquired in the United States—Major Pathogens - Volume 17, Number 1—January 2011 - Emerging Infectious Diseases journal - CDC’, Emerging Infectious Diseases journal - CDC, 2011, doi: 10.3201/eid1701.p11101 [20] H J Jørgensen, T Mørk, H R Høgåsen, and L M Rørvik, ‘Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in bulk milk in Norway’, J Appl Microbiol, vol 99, no 1, pp 158–166, 2005, doi: 10.1111/j.1365-2672.2005.02569.x [21] W A Tham, L J Hajdu, and M L Danielsson-Tham, ‘Bacteriological quality of on-farm manufactured goat cheese’, Epidemiol Infect, vol 104, no 1, pp 87– 100, Feb 1990, doi: 10.1017/s095026880005456x [22] Đào Ngọc Yến, ‘Thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm quán ăn thị xã Dĩ An, tỉnh Bình Dương, năm 2013’, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(6), 2014 [23] Phạm Thanh Tuyền Nguyễn Đỗ Phúc, ‘Tỉ lệ nhiễm vi sinh vật bàn tay người trực tiếp chế biến điều kiện vệ sinh sở quán ăn uống địa bàn Phường 2, Thành phố Tây Ninh năm 2015’, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 20(5), 344-351, p 8, 2016 [24] Nguyễn Đỗ Phúc, ‘Đánh giá nguy ngộ độc thực phẩm độc tố ruột Staphylococcus aureus số sản phẩm thực phẩm’, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 12(4), 272-277, p 7, 2008 [25] D Kanungpean, S Takai, and T Kakuda, ‘Contamination and Antimicrobial Susceptibility Testing of Staphylococcus aureus Isolated from Pork in Fresh 49 Markets, Nongchok District, Thailand’, Veterinary Medicine International, vol 2021, p e6646846, Mar 2021, doi: 10.1155/2021/6646846 [26] A Kumar, P Kaushik, Anjay, P Kumar, and M Kumar, ‘Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin and nasal carriage isolates from bovines and its antibiogram’, Vet World, vol 10, no 6, pp 593–597, Jun 2017, doi: 10.14202/vetworld.2017.593-597 [27] W Wang et al., ‘Enterotoxigenicity and Antimicrobial Resistance of Staphylococcus aureus Isolated from Retail Food in China’, Frontiers in Microbiology, vol 8, 2017, Accessed: Mar 17, 2022 [Online] Available: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.02256 [28] R Y Mashouf, S M Hosseini, S M Mousavi, and M R Arabestani, ‘Prevalence of Enterotoxin Genes and Antibacterial Susceptibility Pattern of Staphylococcus aureus Strains Isolated from Animal Originated Foods in West of Iran’, Oman Med J, vol 30, no 4, pp 283–290, Jul 2015, doi: 10.5001/omj.2015.56 [29] D Asgarpoor, F Haghi, and H Zeighami, ‘Frequency of Enterotoxin Producing Staphylococcus aureus and Toxin Genes in Raw and Cooked Meat Samples’, Infection Epidemiology and Microbiology, vol 4, no 2, pp 53–58, Jul 2018, Accessed: Mar 19, 2022 [Online] Available: http://iem.modares.ac.ir/article4-19049-en.html [30] S Khaledian, M Pajohi-Alamoti, and P Mahmoodi, ‘Molecular Characterization of Methicillin-Resistant Enterotoxin-Producing Staphylococcus aureus Isolated From Samosa and Falafel in Iran’, International Journal of Enteric Pathogens, vol 8, no 1, Art no 1, Feb 2020, doi: 10.34172/ijep.2020.05 [31] Y.-C CHIANG, L.-T CHANG, C.-W LIN, C.-Y YANG, and H.-Y TSEN, ‘PCR Primers for the Detection of Staphylococcal Enterotoxins K, L, and M and Survey of Staphylococcal Enterotoxin Types in Staphylococcus aureus Isolates from Food Poisoning Cases in Taiwan’, Journal of Food Protection, vol 69, no 5, pp 1072–1079, May 2006, doi: 10.4315/0362-028X-69.5.1072 [32] M Song, Y Bai, J Xu, M Q Carter, C Shi, and X Shi, ‘Genetic diversity and virulence potential of Staphylococcus aureus isolates from raw and processed food commodities in Shanghai’, International Journal of Food Microbiology, vol 195, pp 1–8, Feb 2015, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2014.11.020 [33] D LOETO, M I MATSHEKA, and B A GASHE, ‘Enterotoxigenic and Antibiotic Resistance Determination of Staphylococcus aureus Strains Isolated from Food Handlers in Gaborone, Botswana’, Journal of Food Protection, vol 70, no 12, pp 2764–2768, Dec 2007, doi: 10.4315/0362-028X-70.12.2764 [34] J El Jakee et al., ‘Rapid Method for Detection of Staphylococcus aureus Enterotoxins in Food’, Global Veterinaria, vol 11, pp 335–341, Jan 2013, doi: 10.5829/idosi.gv.2013.11.3.1140 50 [35] D Rodríguez-Lázaro et al., ‘Detection and Characterization of Staphylococcus aureus and Methicillin-Resistant S aureus in Foods Confiscated in EU Borders’, Front Microbiol., vol 8, 2017, doi: 10.3389/fmicb.2017.01344 [36] M EL-Maghraby, M Hassan, F Hassanin, and N Shawky, ‘Street Vended Meat Products as Potential Sources of Staphylococcus aureus’, Benha Veterinary Medical Journal, vol 35, no 1, pp 197–202, Sep 2018, doi: 10.21608/bvmj.2018.38364 [37] T Yildirim, F Sadati̇ , B Kocaman, and B Si̇ Ri̇ Ken, ‘Staphylococcus aureus and Staphylococcal enterotoxin detection in raw milk and cheese origin coagulase positive isolates’, International Journal of Science Letters, vol 1, no 1, pp 30–41, Aug 2019, doi: 10.38058/ijsl.596007 [38] Nguyễn Đỗ Phúc, ‘Mối tương quan đậm độ khả sinh độc tố ruột (enterotoxin) S.aureus hai môi trường nuôi cấy TSGM BHI’, Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, 10 (4), 412 - 417, 2006 [39] Giang N T., Huyen N T T., Oanh Đ T., and Hai P T., ‘Genetic diversity of some strains of Staphylococcus aureus isolated from kitchens at primary schools in Hanoi in 2015’, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, vol 33, no 1S, Art no 1S, Oct 2017, doi: 10.25073/2588-1140/vnunst.4607 [40] H SINA et al., ‘Characterization of Staphylococcus aureus isolated from street foods: Toxin profile and prevalence of antibiotic resistance’, journal of applied biosciences, vol 46, pp 3133–3143, Nov 2011 [41] G G Rebouỗas, M R Abrantes, M de O Rebouỗas, B V S de Araỳjo, S M Sakamoto, and J B A da Silva, ‘Detection of enterotoxigenic genes and mecA gene in Staphylococcus aureus isolated from goat milk, Brazilian Journal of Development, vol 6, no 7, Art no 7, Jul 2020, doi: 10.34117/bjdv6n7-263 [42] M Weldeselassie et al., ‘Isolation and Characterization of From Food of Bovine Origin in Mekelle, Tigray, Ethiopia’, The Open Microbiology Journal, vol 14, no 1, Sep 2020, doi: 10.2174/1874285802014010234 [43] J E L Corry, G D W Curtis, and R M Baird, Eds., ‘Baird-parker agar’, in Progress in Industrial Microbiology, vol 37, Elsevier, 2003, pp 400–403 doi: 10.1016/S0079-6352(03)80030-9 [44] Wilkie Harrigan, Laboratory Methods in Food Microbiology - 3rd Edition Academic Press, 1998 [45] Patricia Shields and Laura Cathcart, ‘Oxidase Test Protocol’, American society for microbiology, 2010 [46] Sue Katz, ‘Coagulase Test Protocol’, American society for microbiology, 2010 [47] Jan Hudzicki, ‘Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test Protocol’, American society for microbiology, 2009 [48] Karen Reiner, ‘Carbohydrate Fermentation Protocol’, American society for microbiology, 2012 51 [49] Clinical Laboratory Standards Institute, ‘Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests’ Clinical Laboratory Standards Institute, 2006 [50] I S Kroning, ‘Staphylococcus aureus isolated from handmade sweets: Biofilm formation, enterotoxigenicity and antimicrobial resistance’, Food Microbiology, p 7, 2016 [51] W Wang et al., ‘Enterotoxigenicity and Antimicrobial Resistance of Staphylococcus aureus Isolated from Retail Food in China’, Frontiers in Microbiology, vol 8, 2017, Accessed: Apr 29, 2022 [Online] Available: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.02256 [52] P Thakur, C Nayyar, V Tak, and K Saigal, ‘Mannitol-fermenting and tube coagulase-negative staphylococcal isolates: unraveling the diagnostic dilemma’, Journal of laboratory physicians, vol 9, no 01, pp 065–066, 2017 [53] J a Davis, S r Farrah, and A c Wilkie, ‘Selective growth of Staphylococcus aureus from flushed dairy manure wastewater using acriflavine-supplemented mannitol salt agar’, Letters in Applied Microbiology, vol 42, no 6, pp 606–611, 2006, doi: 10.1111/j.1472-765X.2006.01915.x [54] D P Kateete et al., ‘Identification of Staphylococcus aureus: DNase and Mannitol salt agar improve the efficiency of the tube coagulase test’, Ann Clin Microbiol Antimicrob, vol 9, p 23, Aug 2010, doi: 10.1186/1476-0711-9-23 [55] Nguyễn Thị Giang, Nguyễn Thị Thu Huyên, Đặng Thị Oanh Phạm Thế Hải, ‘Sự đa dạng di truyền số chủng Staphylococcus aureus phân lập từ bếp ăn tập thể số trường tiểu học bán trú địa bàn Hà Nội năm 2015’, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, vol 33, no 1S, 2017 [56] Kroning I S., Iglesias M A., Sehn C P., Gandra T K V., Mata M., and Silva W P., ‘Staphylococcus aureus isolated from handmade sweets: Biofilm formation, enterotoxigenicity and antimicrobial resistance.’, undefined, 2016, Accessed: Apr 28, 2022 [Online] Available: https://www.semanticscholar.org/paper/Staphylococcus-aureus-isolated-fromhandmade-and-KroningIglesias/83875551c91513ed89de8cdc537ba18eb0a3a313 [57] A M Hammad, W Watanabe, T Fujii, and T Shimamoto, ‘Occurrence and characteristics of methicillin-resistant and -susceptible Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci from Japanese retail ready-to-eat raw fish’, International Journal of Food Microbiology, vol 156, no 3, pp 286–289, Jun 2012, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2012.03.022 [58] M Ostojić and M Hukić, ‘Genotypic and phenotypic characteristics of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains, isolated on three different geography locations’, Bosn J Basic Med Sci, vol 15, no 3, pp 48–56, Aug 2015, doi: 10.17305/bjbms.2015.402