Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen polymerase chain reaction pcr trong chẩn đoán nhiễm trùng do leptospira tại việt nam

Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới BS.TS Hoàng Thị Thu Hà – Trưởng phòng Vi khuẩn Đặc biệt - Trưởng Khoa Vi khuẩn – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, thời gian qua tin tưởng, cho em hội nghiên cứu khoa học tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện để em hồn thành tốt khóa luận Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể chú, anh chị cán nhân viên phịng Vi khuẩn Đặc biệt – Khoa Vi khuẩn hết lòng giúp đỡ em suốt thời gian thực tập phòng Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội dạy dỗ tận tình tạo mơi trường học tập điều kiện trang thiết bị vật chất tốt cho em bạn sinh viên khoa học tập Bên cạnh em xin tỏ lịng biết ơn gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người ln chăm sóc, chia sẻ, động viên em suốt thời gian qua Trong trình thực tập, cịn thiếu kinh nghiệm thời gian có hạn nên khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo, góp ý thầy bạn Một lần em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Vũ Thị Thùy Linh Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2015 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC BẢNG, HÌNH ii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Lịch sử bệnh Leptospira 1.2 Đặc điểm vi khuẩn học xoắn khuẩn Leptospira 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Hình thể, cấu tạo tính chất 1.2.3 Độc tố vi khuẩn kháng nguyên 1.2.4 Khả gây bệnh 1.2.5 Đặc điểm lâm sàng 1.3 Dịch tễ học bệnh 10 1.3.1 Phương thức lây truyền 10 1.3.2 Đặc điểm dịch tễ học 11 1.4 Các phương pháp chẩn đoán Leptospira 12 1.4.1 Soi tươi kính hiển vi 12 1.4.2 Nuôi cấy 13 1.4.3 Phương pháp ngưng kết tan phát kháng nguyên đặc hiệu (Martin - Petit) 14 1.4.4 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ men (ELISA) 15 1.4.5 Phương pháp sinh học phân tử 16 1.4.5.1 PCR (Phản ứng khuếch đại gen) 16 1.4.5.2 Real-time PCR 18 1.4.5.3 Điện di xung điện trường (PFGE) 19 1.5 Phòng điều trị bệnh 19 1.5.1 Biện pháp dự phòng: 19 1.5.2 Biện pháp chống dịch: 20 1.5.3.Nguyên tắc điều trị: 21 Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2015 CHƯƠNG IIĐỔI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1.Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Vật liệu 22 2.2.1 Các chủng Leptospira chuẩn 22 2.2.2 Hóa chất, mơi trường sử dụng nghiên cứu 23 2.2.3 Các trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý bệnh phẩm 25 2.3.2 Vận chuyển bệnh phẩm 26 2.3.3 Xử lý bệnh phẩm (tại phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp độ 2) 27 2.3.4 Nuôi cấy 27 2.3.5 Tách chiết ADN 27 2.3.6 Tiến hành phản ứng PCR 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 3.1 Nuôi cấy vi khuẩn 31 3.2 Tạo bệnh phẩm mô với vi khuẩn Leptospira 31 3.3 Chuẩn hóa phương pháp flaB – PCR tổ 32 3.3.1 Xác định giá trị phương pháp flaB – PCR tổ 32 3.3.2.Xác định ngưỡng phát phản ứng flaB – PCR tổ 33 3.3.3 Xác định tính đặc hiệu phản ứng PCR 33 3.4 Phát Leptospira mẫu bệnh phẩm 34 3.5 Quy trình chuẩn phương pháp flaB - PCR tổ 36 BÀN LUẬN 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 Kết luận 44 Kiến nghị 44 Tài liệu tham khảo 46 PHỤ LỤC Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải nghĩa ADN Axit Deoxyribo Nucleic ARN Axit Ribonucleic BSA Bovine serum albumin (albumin huyết bò) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ men) EMJH Ellinghasue–McCullough–Jonson–Harris HIV Human Immunodeficiency Virus (Vi rút gây hội chứng suy giảm miễn dịch người) IS Insertion sequence (Trình tự chèn) LPS Lipopolysaccharide MAT Martin – Petit (Phản ứng ngưng kết tan) NIID National Institute of Infectious Disease (Viện Nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Nhật Bản) OD Optical Density (Mật độ quang học) PCR Polymerase Chain Reaction (Kỹ thuật khuếch đại gen) PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Kỹ thuật điện di trường xung điện) UV Vũ Thị Thùy Linh Ultraviolet (Tia tử ngoại) i Lớp 11 - 03 DANH MỤC BẢNG, HÌNH Bảng 1: Tình hình mắc Leptospirosis khu vực Châu Á Thái Bình Dương năm 2009 Bảng 2: Danh sách chủng Leptospira chuẩn Bảng 3: Trình tự cặp mồi Hình 1: Xoắn khuẩn Leptospira kính hiển vi điện tử phóng đại 200 lần Hình 2: Leptospira grippotyphosa kính hiển vi điện tử, phóng đại 15000lần Hình 3: Sơ đồ lây truyền bệnh Leptospira Hình 4: Các bước trình PCR Hình 5: Phủ tạng chuột Hình 6: Hộp vận chuyển bệnh phẩm theo tiêu chuẩn quốc tế Hình7: Quá trình tách chiết ADN Hình 8: Nuôi cấy vi khuẩn Leptospira môi trường EMJH lỏng Hình 9: Kết PCR tổ Hình 10: Ngưỡng phát phản ứng PCR Hình 11: Độ đặc hiệu phản ứng PCR Hình 12: Kết PCR tổ mẫu bệnh phẩm người Hình 13: Kết PCR tổ mẫu bệnh phẩm thận lợn Vũ Thị Thùy Linh ii Lớp 11 - 03 ĐẶT VẤN ĐỀ Leptospirosis - bệnh động vật truyền sang người, xoắn khuẩn Leptospira gây nên [25] Leptospira có mặt khắp nơi giới.Bệnh thường xảy nước nhiệt đới - nơi có mùa mưa kéo dài, vùng nơng thơn có nhiều vũng, ao, đầm lầy với môi trường thấp bị ô nhiễm với diện tích chăn ni gia súc trâu, bị, lợn lớn, xen lẫn khu vực dân cư [18] Con người bị nhiễm trùng tiếp xúc với mầm bệnh từ động vật môi trường bị nhiễm bẩn đất trồng, nước thải [2,21,25] Ngày nay, phương pháp sinh học phân tử, Leptospira phát nước sinh hoạt, nước bể bơi số nước phát triển [20] Gần đây, Leptospirosis trội bệnh nhiễm trùng nguy hiểm giới với gia tăng vụ dịch trầm trọng gây xuất huyết phổi, gan, thận với tỷ lệ tử vong cao [18] Leptospirosis coi bệnh mang tính chất nghề nghiệp – mối nguy cao liên quan tác nhân nghề nghiệp nông dân chăn nuôi gia súc, trồng trọt, công nhân hầm mỏ, khai thác lâm sản, người làm việc điều kiện ẩm ướt, chế biến thực phẩm [3,14,25] Mức độ lây nhiễm khác nghề nghiệp liên quan đến việc tiếp xúc yếu tố nguy thời gian, cường độ tiếp xúc Các cán thú ý hay người làm việc phịng thí nghiệm nghiên cứu Leptospira, phịng chăn ni động vật thí nghiệm nằm nhóm nguy cao [21,22] Các triệu chứng bệnh thường sốt, làm suy yếu thận, xuất huyết phổi, tác động đến gan (gây vàng da) nhiều triệu chứng khác Căn bệnh tác động đến hàng chục triệu người năm đặc biệt cao khu vực nhiệt đới Do tính đa dạng triệu chứng, Leptospirosis khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong số vùng lên đến 20%–25% [31] Bệnh thường chẩn đoán cách kết hợp triệu chứng lâm sàng phương pháp phịng thí nghiệm Các phương pháp thường sử dụng phịng thí nghiệm nhuộm soi, nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn từ máu, nước não tủy, nước tiểu môi trường đặc biệt cấy truyền chuột lang, chuột túi má (hamster), phương pháp huyết học MAT, ELISA [29] Tuy nhiên, với đặc tính nguy hiểm bệnh việc thực phương Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 pháp cần phải có phịng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 2, cần chủng vi khuẩn giống Thêm nữa, phương pháp không thiết thực cho chẩn đoán sớm bệnh bị ảnh hưởng mẫu bệnh phẩm, thời gian vận chuyển bệnh phẩm hay sử dụng kháng sinh trước Các tiến kỹ thuật sinh học phân tử giúp giải vấn đề mà PCR ví dụ điển hình Nguyên tắc phương pháp tạo lượng lớn đoạn ADN đặc thù từ ADN khuôn dựa sở hoạt động ADN–polymerase để tổng hợp sợi bổ sung PCR giúp phát ADN xoắn khuẩn trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm, không yêu cầu nghiêm ngặt bệnh phẩm, dễ thực hiện, cho kết nhanh, xác Đây cơng cụ góp phần hữu hiệu việc chẩn đoán xác định Leptospira hướng tới tìm hiểu mối liên quan bệnh động vật – người – môi trường [7] Việc chuẩn đốn nhanh xác ngun bệnh Leptospirosis cần thiết, nhằm phục vụ kịp thời có hiệu cho cơng tác điều trị bệnh ngăn chặn dịch bệnh Vì chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction - PCR) chẩn đoán nhiễm trùng Leptospira Việt Nam.” Nghiên cứu thực góp phần nâng cao hiểu biết tình hình bệnh Leptospira nước ta kết nghiên cứu sở để xác định biện pháp kiểm soát, phòng chống bệnh cộng đồng Mục tiêu đề tài: - Ứng dụng phương pháp PCR cho chẩn đoán sớm bệnh Leptospirosis - Xây dựng thường quy chuẩn phương pháp PCR phù hợp cho chẩn đoán Leptospira từ bệnh phẩm phịng thí nghiệm Việt Nam Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử bệnh Leptospira Trước năm 1886, bệnh Leptospira thường chẩn đoán nhầm với bệnh sốt vàng, sốt rét, sốt xuất huyết Dengue, viêm gan…[27] Năm 1886, Adolf Weil (bác sĩ người Đức) lần mô tả bệnh Leptospira bệnh nhiễm trùng cấp tính gây vàng da, viêm thận sau bệnh mang tên ơng – bệnh Weil Năm 1914 – 1915, tác nhân gây bệnh đồng thời phát nhà khoa học Nhật Bản Đức nghiên cứu khác Inada Ido tìm thấy xoắn khuẩn kháng thể đặc hiệu người thợ mỏ Nhật Bản bị bệnh vàng da truyền nhiễm Năm 1917, chuột phát ổ chứa mầm bệnh cho người Đến năm 1930 – 1940, Leptospira gây bệnh cho chó gia súc ghi nhận [11] Tại Việt Nam, bệnh Ragiot Souchard phát lần người năm 1931 Sau đó, xảy vụ dịch Lai Châu (1964) gây thiệt hại nhiều gia súc nhiễm cho người (1996) Đến nay, bệnh có tất vùng miền nước [30] Theo số liệu nghiên cứu Ann Florence B Victoriano [26] năm 2009 Việt Nam đứng thứ 10 khu vực Châu Á Thái Bình Dương tỉ lệ mắc hàng năm Vũ Thị Thùy Linh Lớp 11 - 03 Bảng Tình hình mắc Leptospirosis khu vực Châu Á Thái Bình Dương năm 2009 [26] Tỉ lệ mắc/100.000 dân hàngnăm Quốc gia/vùng lãnh thổ Cao (>10) Bangladesh Campuchia Fiji French Polynesia Ấn Độ Lào Nêpal Srilanka Thái Lan Việt Nam Wallis Futuna Trung bình (1-10) Samoa Trung Quốc Indonesia Malaysia New Zealand Philippine Vanuatu Thấp (