Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn nitrat hóa có khả năng ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi lợn sau biogas

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Lương Hữu Thành-Trưởng Bộ môn Sinh học Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp Đã tận tình giúp đỡ em hướng dẫn em kiến thức khoa học phương pháp nghiên cứu suốt q trình hồn thành khóa luận Em xin cảm ơn tới anh chị Bộ môn Sinh học Môi trường, Viện Môi trường Nông nghiệp giúp đỡ hướng dẫn bảo em suốt thời gian em thực khóa luận Em xin cảm ơn tới thầy (cô) giáo khoa Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện thuận lợi truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tời gia đình, bạn bè người động viên, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện vật chất tinh thần giúp em hoàn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Hà nội, ngày 16 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Đình An Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nước thải chăn nuôi 1.2 Các thành phần tính chât nước thải chăn ni lợn 1.2.1 Các chất hữu vô nước thải chăn nuôi 1.2.2 Nguồn nitơ photpho nước thải chăn nuôi 1.2.3 Vi sinh vật gây bệnh nước thải chăn nuôi 1.3 Công nghệ xử lý nước thải chăn nuôi 1.3.1 Cơng nghệ xử lý hóa lý 1.3.2 Công nghệ xử lý học 1.3.3 Công nghệ xử lý sinh học 1.4 Các kỹ thuật ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi 1.4.1 Cơng nghệ khí sinh học (biogas) 1.4.1 Ưu nhược điểm sử dụng công nghệ biogas trang trại chăn nuôi 1.5 Nitơ nước thải sau biogas 11 1.5.1 Tính độc hợp chất chứa nitơ 11 1.5.2 Vai trị vi khuẩn nitrat hóa xử lý nước thải sau biogas 13 1.5.2.1 Chu trình chuyển hóa nito nước vi sinh vật tham gia 13 1.5.2.2 Quá trình amon hóa hợp chất hữu 14 1.5.2.3 Q trình amon hóa protein 14 1.5.2.4 Quá trình nitrat hóa 15 1.5.2.5 Các chủng vi khuẩn tham gia vào q trình nitrat hóa 17 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phạm vi nghiên cứu 19 2.3 Dụng cụ hóa chất 19 2.3.1 Dụng cụ 19 2.3.2 Hóa chất 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Môi trường phân lập, ni cấy giữ giống vi khuẩn nitrat hóa 20 2.4.1.1 Môi trường winogradsky I 20 2.4.1.2 Môi trường winogradsyi II 20 2.4.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn nitrat hóa 21 2.4.3 Phương pháp làm tuyển chọn chủng hoạt lực cao 21 2.4.4 Phương pháp nhuộm gram 22 2.4.5 Phương pháp giữ giống 22 Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp 2.4.6 Phương pháp xác định hàm lượng Nitrit ( NO2- -N ) nước 23 2.4.7 Phương pháp xác định hàm lượng Nitrat ( NO3 N) nước 25 PHẦN III : KẾT QUẢ 27 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn nitrat hóa 27 3.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính nitrat hóa cao 27 3.2.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrat hóa cao 27 3.2.1.1 Tuyển chọn chủng có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrit 27 3.2.2.2 Tuyển chọn chủng có hoạt tính oxy hóa nitrit thành nitrat 28 3.2.3 Hoạt tính oxy hóa chủng tuyển chọn 29 3.2.3.1 Hoạt tính oxy hóa amon thành nitrit 29 3.2.3.2 Hoạt tính oxy hóa nitrit thành nitrat 30 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 30 3.3.2 Đặc điểm, hình dạng tế bào 31 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng nitrat hóa 32 3.4.1 Ảnh hưởng pH 32 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 34 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển hoạt tính nitrat 36 3.5 Khả sử dụng chủng vi sinh vật tuyển chọn vào xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng : Thành phần đặc trưng khí biogas Bảng 2: Đặc điểm nước thải đầu hầm biogas thành phố Huế Bảng : xây dựng đường chuẩn Nitrit Bảng : xây dựng đường chuẩn nitrat hóa Bảng 5: Hoạt tính hóa amon thành nitrit chủng tuyển chọn Bảng : Hoạt tính oxy hóa nitrit chủng tuyển chọn Bảng : Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn Bảng : Đặc điểm tế bào chủng vi khuẩn nghiên cứu Bảng : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng C1 Bảng 10 : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng D3 Bảng 11 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng C1 Bảng 12 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng D3 Bảng 13 : Ảnh hưởng thời gian đến tốc độ phát triển hoạt tính hai chủng C1 D3 Bảng 14 : Kết thử nghiệm xử lý gián đoạn Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình : Chu trình nitơ nước Hình : Chủng vinh sinh vật có hoạt tính nitrat mơi trường winogradsky Hình : Chủng vi sinh vật nitrit mơi trường có chứa thuốc thử griss Hình : Chủng vi sinh vật nitrat mơi trường có chứa thuốc thửgriss Hình : Hình thái khuẩn lạc chủng C1 D3 Hình : Hình thái tế bào chủng C1 Hình : Hình thái tế bào chủng D3 Hình : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng C1 Hình : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng D3 Hình 10 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng C1 Hình 11 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng D3 Hình 12 : Các bình ni thời điểm ngày Hình 13 : Các bình ni thời điểm ngày Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa Luận Tốt Nghiệp DANH MỤC VIẾT TẮT BOD : Nhu cầu oxy sinh hóa COD : Nhu cầu oxy hóa học CFU/ml : Số đơn vị hình thành khuẩn lạc DO : Hàm lượng oxy hòa tan nước SS : Nồng độ chất rắn dạng huyền phù TC : Tổng lượng cacbon TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TS : Chất rắn tổng số U: Unit OD: Mật độ quang Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 MỞ ĐẦU Chăn nuôi ngành kinh tế quan trọng Việt Nam, nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho người dân Đây ngành kinh tế giúp cho nông dân tăng thu nhập, giải nhiều công ăn việc làm cho người lao động Tuy nhiên, bên cạnh việc sản xuất cung cấp lượng lớn sản phẩm quan trọng cho nhu cầu người, ngành chăn nuôi gây nên nhiều tượng tiêu cực môi trường, đặc biệt nước thải từ trình chăn nuôi Nước thải chăn nuôi chứa nhiều hợp chất gây hại, hàm lượng N, P vi sinh vật gây bệnh cao Do khơng có biện pháp xử lý phù hợp gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sống người dân xung quanh Hiện nay, việc xử lý nước thải chăn ni chủ yếu sử dụng hình thức ủ kỵ khí (phân nước thải) qua mơ hình hầm khí sinh học biogas Qua mơ hình hầm khí sinh học, chất hữu nước thải vi sinh vật chuyển hóa tạo sản phẩm hỗn hợp khí gas, qua giảm thiểu nhiễm chất hữu Tuy vậy, nguồn nước sau biogas chứa hàm lượng nitơ, photpho định cần nghiên cứu xử lý triệt để Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật xử lý nước ô nhiễm ngày phổ biến Các vi sinh vật sử dụng bổ sung vào nước ô nhiễm giảm thiểu, loại bỏ hàm lượng C, N, P dư thừa nước theo trình khác để tạo sinh khối tế bào vi sinh vật, oxy hóa chất thành sản phẩm cuối CO2 H2O, chuyển hóa nitơ dạng hữu vơ thành dạng khí N2 ngồi mơi trường, tích tụ photpho thể tế bào, Quá trình loại nitơ dư thừa nước thường diễn chủ yếu q trình amon hóa, nitrat hóa phản nitrat hóa[1] Trong đó, q trình nitrat hóa q trình hiếu khí, NH4+ oxi hóa thành nitrit NO2-, sau nitrit chuyển hóa thành nitrat NO3-, biến đổi thực vi khuẩn Nitrosomonas, Nitrobacter Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Đề tài tiến hành nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa với mục đích hy vọng tạo kết có ý nghĩa ứng dụng vi sinh vật xử lý ô nhiễm hợp chất chứa nitơ nước thải chăn nuôi Xuất phát từ thực tế đó, tơi chọn đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn nitrat hóa có khả ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi lợn sau biogas” Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 PHẦN I : TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nước thải chăn nuôi Nước thải chăn nuôi bao gồm nước tiểu, nước rửa chuồng, nước tắm vật nuôi với khối lượng nước thải lớn nước thải chăn ni có khả gây ô nhiễm môi trường cao chứa hàm lượng chất hữu cơ, cặn lơ lửng, hàm lượng N, P, vi sinh vật gây bệnh cao.Nguồn nước thải chăn nuôi nguồn chất thải có chứa nhiều hợp chất hữu cơ, virus, vi trùng, trứng giun sán… Nguồn nước có nguy gây nhiễm tầng nước mặt, nước ngầm trở thành nguyên nhân trực tiếp phát sinh dịch bệnh cho đàn gia súc Đồng thời lây lan số bệnh cho người ảnh hưởng đến môi trường xung quanh nước thải chăn ni cịn chứa nhiều mầm bệnh như: Samonella, Leptospira, Clostridium tetani,…nếu không xử lý kịp thời Bên cạnh cịn có nhiều loại khí tạo hoạt động vi sinh vật NH3, CO2, CH4, H2S, Các loại khí gây nhiễm độc khơng khí nguồn nước ngầm ảnh hưởng đến đời sống người hệ sinh thái Chính mà việc thiết kế hệ thống xử lý nước thải cho trại chăn nuôi hoạt động cần thiết Đặc trưng ô nhiễm nước thải chăn ni lợn là: Ơ nhiễm hữu cơ, ô nhiễm N, P chứa nhiều loại vi trùng, vi khuẩn gây bệnh 1.2 Các thành phần tính chât nước thải chăn ni lợn 1.2.1 Các chất hữu vô nước thải chăn nuôi Những chất hữu chưa gia súc đồng hoá, hấp thụ tiết theo phân, nước tiểu sản phẩm trao đổi chất khác.Thức ăn dư thừa nguồn gây ô nhiễm hữu Trong nước thải chăn nuôi, hợp chất hữu chiếm 70-80 % gồm protit, acid amin, chất béo, hydratcarbon dẫn xuất chúng Hầu hết chất hữu dễ phân huỷ, giàu nitơ, photpho Các chất vô chiếm 20-30% gồm cát, đất, muối, ure, amonium, muối chlorua, sulfate… Các hợp chất hoá học phân nước thải dể dàng bị phân huỷ Tùy điều kiện hiếu khí hay kị khí mà q trình phân huỷ tạo thành sản phẩm khác Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 acid amin, acid béo, aldehide, CO2, H2O, NH3, H2S Nếu trình phân huỷ có mặt O2 sản phẩm tạo thành CO2, H2O, NO2, NO3 Cịn q trình phân hủy diễn điều kiện thiếu khí tạo thành sản phẩm CH4, N2, NH3, H2S, Indol, Scatol…Các chất khí sinh q trình phân huỷ kị khí thiếu khí NH3, H2S…gây mùi thối khu vực nuôi ảnh hưởng xấu tới môi trường khơng khí 1.2.2 Nguồn nitơ photpho nước thải chăn nuôi Khả hấp thụ nitơ photpho gia súc, gia cầm kém, nên ăn thức ăn có chứa nitơ, photpho vào chúng bị tiết theo phân nước tiểu Trong nước thải chăn nuôi thường chứa hàm lượng nitơ photpho cao Hàm lượng nitơ tổng nước thải trại chăn nuôi đo sau biogas từ 571 – 594 mg/l, Photpho từ 13.8-62 mg/l Theo Jongbloed Lenis (1992), heo trưởng thành ăn vào 100 g nitơ thì: 30 g giữ lại thể, 50g tiết theo nước tiểu dạng ure, 20 g dạng phân nitơ vi sinh khó phân huỷ an tồn cho mơi trường Tùy theo có mặt oxy nước mà nitơ chủ yếu tồn dạng NH4+, NO2-, NO3- Khi nước tiểu phân tiết ngồi mơi trường nitơ gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Vì vào thể, gặp điều kiện thíc hợp (NH4+), (NO3-) chuyển hóa thành NO2-, mà NO2- có lực mạnh với hồng cầu máu mạnh oxy nên thay oxy tạo thành methemoglobin, ức chế chức vận chuyển oxy đến quan hồng cầu ngăn cản trình trao đổi chất thể, làm cho quan thiếu oxy, đặc biệt não dẫn đến nhức đầu, mệt mỏi, hôn mê chí dẩn tới tử vong 1.2.3 Vi sinh vật gây bệnh nước thải chăn nuôi Nước thải chăn nuôi chứa nhiều loại vi trùng, vius trứng ấu trùng giun sán gây bệnh Do đó, loại nước thải có nguy trở thành nguyên nhân trực tiếp phát sinh dịch bệnh cho đàn gia súc, gia cầm đồng thời lây lan số bệnh cho người không xử lý Theo nghiên cứu Nanxera nước thải chăn ni: vi trùng gây bệnh đóng dấu (Erisipelothris insidiosa) tồn 92 ngày, Brucella từ 74-108 ngày, Samolnella từ 6-7 tháng, Leptospira 5-6 tháng, Microbacteria tuberculosis 75-150 ngày, vius lở mồm long móng (FMD) sống nước thải 100-120 ngày…, Nguyễn Đình An Lớp CNSH 11.01-K18 Sau quan sát ta thấy, chủng vi khuẩn phân lập xảy phản ứng dương tính với thuốc thử Griss, màu thuốc thử chủng D2 D3 nhạt hẳn so với màu chủng D1 D4 Hay nói cách khác, chủng D2 D3 có hoạt tính oxy hóa nitrit cao chủng sử dụng cho bước nghiên cứu 3.2.3 Hoạt tính oxy hóa chủng tuyển chọn Khi chủng vi khuẩn phát triển môi trường winogradsy có phản ứng tạo màu với thuốc thử griss chứng tỏ chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrat hóa Tuy nhiên, hoạt tính xác định tương đối dựa vào mắt thường Để có kết xác việc tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrat hóa cao, cần tiến hành chọn lọc tiếp tục theo phương pháp hóa học dựa vào hàm lượng nitrit nitrat (tính theo mg/l) tạo thành môi trường nuôi cấy 3.2.3.1 Hoạt tính oxy hóa amon thành nitrit Để xác định hoạt tính oxy hóa amon, chủng phân lập C1 C4 nuôi cấy môi trường lỏng Winogradsky I có chứa 15 mg/l NH4+-N, pH mơi trường 7,5 Lắc nhiệt độ 20 - 30°C với tốc độ 200 vịng/phút ngày Hoạt tính oxy hóa amon chủng thể thông qua thay đổi hàm lượng NH4+ NO2- môi trường nuôi cấy STT Ký hiệu tên chủng Mật độ Hàm lượng NO2 N (OD620 nm) sinh (mg/l) C1 0,695 10,24 C4 0,526 5,32 Bảng 5: Hoạt tính hóa amon thành nitrit chủng tuyển chọn Từ bảng cho ta thấy chủng C1 C4 có khả oxy hóa amon thành nitrit tương đối tốt Nhìn vào kết C1 có khả oxy hóa amon tốt C4 sau ngày ni cấy môi trường lỏng winogradsky I, hàm lượng nitrit sinh C1 10,24 mg/l Xét thấy kết tuyển chọn nhanh phù hợp với thuốc thử griss mơi trường đặc, đề tài định chọn chủng C1 vào nghiên cứu Nguyễn Đình An 29 Lớp CNSH 11.01-K18 3.2.3.2 Hoạt tính oxy hóa nitrit thành nitrat Để xác định hoạt tính oxy hóa nitrit, chủng phân lập D2 D3 nuôi cấy mơi trường lỏng Winogradsky II có chứa 15 mg/l NO2 N, pH môi trường 7,5 Lắc nhiệt độ 28 - 30°C với tốc độ 200 vòng/phút ngày Hoạt tính chuyển hóa nitrit chủng xác định theo hàm lượng NO3- môi trường nuôi cấy STT Ký hiệu tên chủng Mật độ Hàm lượng NO3- -N (OD620 nm) sinh (mg/l) D2 0,262 6,58 D3 0,358 10,31 Bảng : Hoạt tính oxy hóa nitrit chủng tuyển chọn Từ bảng cho ta thấy chủng D2 D3 có khả chuyển hóa nitrit tương đối tốt Nhìn vào kết chủng D3 có hoạt tính chuyển hóa mạnh Sau ngày nuôi cấy môi trường lỏng winogradsky II, hàm lượng nitrat tạo D3 10,31 mg/l Xét thấy kết tuyển chọn nhanh phù hợp với thuốc thử griss môi trường đặc, đề tài định chọn chủng D3 vào nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bảng : Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn STT Kí hiệu Kích thước chủng khuẩn lạc Đặc điểm hình thái khuẩn lạc (mm) C1 - 4,5 Khuẩn lạc màu trắng, lồi, trơn, bóng, mép cưa D3 3,5 - Khuẩn lạc màu trắng đục, lồi, trơn, viền không đều, bề mặt khuẩn lạc sần sùi, nhân Nguyễn Đình An 30 Lớp CNSH 11.01-K18 Hình : Hình thái khuẩn lạc chủng C1 D3 3.3.2 Đặc điểm, hình dạng tế bào Tiến hành làm tiêu theo phương pháp gram để quan sát hình dạng tế bào chủng C1 D3 Kết nhuộm gram thể qua bảng : STT Kí hiệu tên chủng Đặc điểm tế bào C1 Tế bào hình bầu dục, rời rạc Gram âm ( - ) D3 Tế bào hình que ngắn gọn, rời rạc Gram âm ( - ) Bảng : Đặc điểm tế bào chủng vi khuẩn nghiên cứu Hình : Hình thái tế bào chủng C1 Nguyễn Đình An 31 Lớp CNSH 11.01-K18 Hình : Hình thái tế bào chủng D3 Qua nghiên cứu hình thái tế bào cho thấy chủng C1 D3 vi khuẩn gram âm, rời rạc hình dáng khác - Chủng C1 có tế bào hình bầu dục, rời rạc, gram âm - Chủng D3 có tế bào hình que ngắn gọn, rời rạc gram âm Cả chủng không quan sát thấy bào tử Từ đặc điểm nhận thấy Chủng C1 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas, cịn chủng D3 có đặc điểm giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng chủng nitrat hóa 3.4.1 Ảnh hưởng pH pH mơi trường ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển vi khuẩn nitrat hóa Khi pH mơi trường q cao dẫn đến việc tạo lượng NH3 môi trường làm ức chế phát triển vi khuẩn oxy hóa amon nitrit Trong trường hợp pH mơi trường thấp dẫn đến việc tích tụ lượng lớn axit nitric chất ức chế phát triển vi khuẩn nitrate hóa Do việc xác định giá trị pH phù hợp cho q trình nitrate hóa cần nghiên cứu Kết ảnh hưởng pH đến phát triển hai chủng C1, D3 (hình hình 9) Cả hai Chủng C1 D3 phát triển tốt pH 8, nhiên mức độ ảnh hưởng pH khác ( Hình ) pH có ảnh hưởng lớn đến phát triển chủng D3 Ở pH phát triển D3 đạt giá trị cao OD 620 nm 0,391 sau 72 h ni cấy Khi Nguyễn Đình An 32 Lớp CNSH 11.01-K18 tăng pH lên hay giảm hay giá trị OD 620 nm 0,288, 0,31 0,264 Chủng C1 bị ảnh hưởng pH giải pH từ 7-9 Giá trị OD 620 nm đạt cực đại pH 7, 8, 0,352, 0,353 0,293 sau 48h nuôi cấy Đối với hai chủng , pH không thích hợp cho phát triển pH mơi trường thíc hợp cho hai chủng C1,D3 Kết phù hợp điều kiện Nitrosomonas Nitrobacter Tuy nhiên chủng Nitrosomonas Nitrobacter phát triển chậm Nitromonas đạt giá trị OD 620 nm cực đại 0,17 sau 72 nitrobacter đại giá trị OD 620nm 0,15 sau 96 nuôi cấy Vi khuẩn Nitrosomonas Nitrobacter điển hình cho trình nitrate hóa nhiên so với chủng tơi phân lập tốc độ phát triển chúng phát triển chậm Đối với việc sử dụng vi sinh vật để xử lý nước thải sau biogas tốc độ phát triển vi sinh vật đóng vai trị quan trọng vi sinh vật phát triển chúng chuyển hóa chất dư thừa nước thành sinh khối góp phần đáng kể việc làm giảm ô nhiễm Thời gian (giờ) 24 0,12 48 72 96 120 144 0,18 0,19 0,17 0,15 0,13 pH= 0,05 Mật độ pH= 0,05 0,22 0,33 0,28 0,24 0,22 0,19 (OD620n pH= 0,05 0,09 0.36 35 0.25 0.23 0.21 m) pH= 0,05 0,14 0.29 0.26 0.2 0.19 0.18 Bảng : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng C1 Hình : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng C1 Nguyễn Đình An 33 Lớp CNSH 11.01-K18 Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 pH= 0,05 0.17 0.23 0.25 0.24 0.22 0.21 Mật độ pH= 0,05 0.19 0.26 0.28 0.26 0.24 0.23 (OD620nm) pH= 0,05 0.12 0.31 0.39 0.38 0.33 0.31 pH= 0,05 0.19 0.25 0.27 0.25 0.22 0.21 Bảng 10 : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng D3 Hình : Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng D3 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hai chủng thể hiên hình 10 hình 11 Chủng C1 phát triển tốt nhiệt độ 30oC đạt giá trị OD 620nm cực đại 0,353 sau 48 ni cấy (hình 10) Sự phát triển C1 bị giảm rõ rệt nhiệt độ thay đổi Ở 20oC, 30oC 40oC C1 phát triển chậm giá trị OD 620 nm cực đại 0,175, 0,188 0,142 sau 48 nuôi cấy Chủng D3 phát triển chậm so với chủng C1 đạt giá trị OD 620 nm cực đại sau 72 ni cấy (hình 11) Chủng phát triển tốt nhiệt độ 30oC 40oC, giá trị OD 620 nm cực đại 0,391 0,368 Khi nhiệt độ tăng lên 50oC giảm xuống 20oC phát triển D3 giảm rõ rệt giá trị OD 620 nm cao 0,168 0,192 Các chủng C1, D3 có nhiệt độ tối ưu 30oC, pH Nguyễn Đình An 34 Lớp CNSH 11.01-K18 ban đầu tối ưu Tốc độ sinh trưởng cao C1 thời gian 48 giờ, D3 72 giờ, điều kiện tối ưu để thu hồi sinh khối hai chủng vi khuẩn nhằm ứng dụng vào chế phẩm sinh học để xử lí nước thải Tuy nhiên nghiên cứu này, ảnh hưởng yếu tố tới sinh trưởng chủng khảo sát độc lập, để áp dụng quy mơ lớn cần phải khảo sát tương tác yếu tố tới sinh khối thu đưa hàm toán học mối quan hệ yếu tố sinh khối Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 Mật độ T=20°C 0.05 0.13 0.16 0.15 0.14 0.12 0.11 (OD620nm) T=30°C 0.05 0.11 0.37 0.35 0.27 0.24 0.21 T=40°C 0.05 0.16 0.18 0.17 0.15 0.14 0.13 T=50°C 0.05 0.1 0.14 0.13 0.12 0.11 0.09 Bảng 11 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng C1 Hình 10 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng C1 Nguyễn Đình An 35 Lớp CNSH 11.01-K18 Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 Mật độ T=20°C 0.05 0.08 0.13 0.16 0.15 0.14 0.13 (OD620nm) T=30°C 0.05 0.11 0.31 0.39 0.38 0.32 0.29 T=40°C 0.05 0.15 0.29 0.37 0.35 0.28 0.27 T=50°C 0.05 0.07 0.12 0.15 0.14 0.13 0.12 Bảng 12 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng D3 Hình 11 : Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng D3 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến phát triển hoạt tính nitrat Chủng C1 ni bình tam giác chứa mơi trường lỏng winograsky I có chứa 15 mg/l NH4+ -N, ni lắc nhiệt độ 28- 30oC với tốc độ 200 vòng/phút Cứ sau ngày lấy mẫu để đo mật độ tế bào hoạt tính chuyển hóa NH4+ -N chủng Mật độ tế bào xác định mật độ quang đo bước song 620 nm Hoạt tính nitrit hóa xác định theo hàm lượng NH4+ -N hàm lượng NO2- -N sinh môi trường nuôi cấy Chủng D3 ni bình tam giác chứa mơi trường lỏng winograsky II chứa 15 mg/l NO2- -N, nuôi lắc nhiệt độ 28-30oC với tốc độ 200 vòng/phút Cứ sau ngày lấy mẫu để đo mật độ tế bào hoạt tính chuyển hóa NO2- -N Mật độ tế bào xác định mật độ quang đo bước sóng 620 nm Hoạt tính nitrat hóa xác định theo hàm lượng NO2- -N hàm lượng NO3- -N Nguyễn Đình An 36 Lớp CNSH 11.01-K18 sinh môi trường nuôi cấy Tốc độ phát triển chủng vi khuẩn theo thời gian trình bày bảng sau: Thời gian (ngày) Chủng nitrat hóa C1 Chủng nitrat hóa D3 Mật độ NO2- -N Mật độ NO3- -N (OD620 nm) (mg/l) (OD620 nm) (mg/l) 0,08 0,072 0,131 1,53 0,316 0,297 0,202 3,82 0,502 4,96 0,275 5,71 0,658 7,25 0,396 7,73 0,639 10,269 0,389 8,71 0,652 10,78 0,396 9,47 0,665 11,02 0,402 10,16 0,641 10,85 0,384 9,88 Bảng 13 : Ảnh hưởng thời gian đến tốc độ phát triển hoạt tính hai chủng C1 D3 Từ số liệu bảng cho thấy, chủng nitrit nitrat hóa đạt sinh khối cực đại vào ngày thứ 4, chủng C1 ( OD620nm = 0,658 ), chủng D3 ( OD620nm = 0,396 ) Các ngày sau đó, lượng sinh khối vẩn tiếp tục tăng khơng đáng kể Sự tích lủy sinh khối đồng thời với tăng hoạt tính chủng tuyển chọn Chủng C1, sau ngày nuôi cấy hàm lượng NO2- -N xác định môi trường nuôi cấy không đáng kể, ngày tiếp theo, hàm lượng NO2- -N tăng nhanh (từ 0,297 mg/l vào ngày thứ lên 10,269 mg/l vào ngày thứ 5) Tương tự chủng D3, có hoạt tính đạt kết cao vào ngày thứ 5, hàm lượng NO3- -N tạo thành môi trường nuôi cấy 8,71 mg/l Từ ngày đến ngày thứ hoạt tính Nguyễn Đình An 37 Lớp CNSH 11.01-K18 tiếp tục tăng tăng không nhiều Sang ngày thứ 8, tốc độ phát triển hoạt tính hai chủng tuyển chọn giảm dần Như vậy, chủng vi khuẩn tuyển chọn đạt sinh khối cực đại vào ngày thứ hoạt tính chúng cho kết cao vào ngày thứ 5, tức muộn chút so với Pick phát triển cực đại tế bào Sau ngày khảo sát, nhận thấy tốc độ phát triển hoạt tính chủng vi sinh vật tăng lên không đáng kể, từ để tiết kiệm thời gian chi phí, đề tài định dừng mốc thời gian ngày 3.5 Khả sử dụng chủng vi sinh vật tuyển chọn vào xử lý nước thải chăn nuôi sau biogas Từ mẫu nước thải chăn nuôi lợn sau biogas, đề tài tiến hành đưa hai chủng vi khuẩn nghiên cứu vào thử nghiệm xử lý gián đoạn, xác định hàm lượng nitrit nitrat tron mẩu ngày sau xử lý Mẫu nước thải sau biogas thu nhận có thơng số xác định sau: + Nhiệt độ : 28oC + pH = 7.9 + Hàm lượng NO2- -N : 0,289 mg/l + Hàm lượng NO3- N : 6,601 mg/l Hai chủng vi khuẩn nghiên cứu tiến hành tăng sinh cấp để thu sinh khối Sinh khối cấp đước pha loãng đến nồng độ thích hợp để xác định mật độ tế bào chủng trước đưa vào xử lý + Chủng C1 : Mật độ tế bào M1 = 4,2 108 ( CFU/ml ) + Chủng D3 : Mật độ tế bào M2 = 1,21 109 ( CFU/ml ) Lấy bình tam giác dung tích 500ml, bình có chứa 200ml nước thải sau biogas + Bình : Bình đối chứng , khơng bổ sung vi sinh vật + Bình : Bổ sung 0,5 % dịch cấp chủng C1 Nguyễn Đình An 38 Lớp CNSH 11.01-K18 + Bình : Bổ sung 0,5 % dịch cấp chủng D3 Hình 12 : Các bình ni thời điểm ngày Tiến hành ni bình nhiệt độ 30oC, tốc độ 120 vòng./phút Cứ từ từ sau ngày lấy mẩu để xác định hàm lượng NO2- -N , NO3- N sinh bình ni Kết thu sau: Nước thải đầu : Hàm lượng NO2- -N : Bình (đối chứng) : 1,598 mg/l Bình (bổ sung 0,5 % dịch cấp chủng C1) : 2,958 mg/l Hàm lượng , NO3- N : Bình (đối chứng): 9,55 mg/l Bình (bổ sung 0,5 % dịch cấp chủng D3) : 16,584 mg/l Kết thể qua số liệu bảng : Nguyễn Đình An 39 Lớp CNSH 11.01-K18 Ngày Hàm lượng NO2- -N Hàm lượng , NO3- N Bình Bình Bình Bình (đối chứng) (chủng C1) (đối chứng) (chủng D4) 0,289 0,289 5,163 6,058 0,353 0,598 7,376 8,40 0,856 1,167 8,398 9,134 0,956 1,369 8,538 10,976 1,149 1,889 9.156 12,236 1,497 2,116 9,279 14,789 1,579 2,568 9,136 15,346 1,579 2,568 8,987 15,759 Bảng 14 : Kết thử nghiệm xử lý gián đoạn Hình 12 : Các bình ni thời điểm ngày Như sau ngày thử nghiệm xử lý, bình có bổ sung 0,5 % dịch cấp chủng C1, hàm lượng NO2- -N xác định 2,568 mg/l, tăng 2,279 so với đối chứng Nguyễn Đình An 40 Lớp CNSH 11.01-K18 thời điểm ngày Tăng 0.989 mg/l so với bình đối chứng thời điểm ngày Với bình có bổ sung 0,5 % dịch cấp II chủng D3, hàm lượng NO3- N xác định 15,759 mg/l, tăng 10,596 mg/l so với chúng thời điểm ngày tăng 6,772 mg/l so với bình đối xứng thời điểm ngày Điều chứng tỏ chủng vi khuẩn ngiên cứu bước đầu có hoạt tính nitrit nitrat hóa tốt có khả ứng dụng vào thực tế Nguyễn Đình An 41 Lớp CNSH 11.01-K18 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu nước thải chăn nuôi lợn sau biogas đề tài tiến hành phân lập chủng vi khuẩn tự dưỡng nitrat hóa Đã tuyển chọn chủng vi khuẩn : chủng C1 có hoạt tính oxy hóa amon cao chủng D3 có hoạt tính oxy hóa nitrit cao Qua nghiên cứu hình thái cho thấy, chủng C1 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas, cịn chủng D3 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter Đã xác định điều kiện tối ưu cho sinh trưởng hoạt tính vi khuẩn tuyển chọn, bao gồm: - Nhiệt độ tối ưu 28 – 30oC chủng C1 30 – 32 oC chủng D3 - pH thíc hợp cho phát triển chủng : pH = 7,5 – 8,0 - Thời gian đạt sinh khối tối đa sau ngày nuôi cấy, thời gian cho hoạt tính cao sau ngày ni cấy Kết thử nghiệm có mặt chủng VSV phân lập xử lý nước thải sau biogas KIẾN NGHỊ Mặc dù đạt kết định việc phân lập chọn lọc chủng nitrat hóa, để đưa chủng vi khuẩn vào ứng dụng thực tế cần tìm hiểu sâu chủng đấy: - Tiếp tục nghiên cứu sâu mặt ảnh hưởng yếu tố khác đến sinh trưởng hoạt tính chủng - Cần nghiên cứu xác chủng vi khuẩn thuộc chi định tên chủng vi khuẩn Nguyễn Đình An 42 Lớp CNSH 11.01-K18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Trần Hiếu Nhuệ, Trần Đức Hạ, Lê Hiền Thảo (1996), trình vi sinh vật cấp thoát nước, NXB Khoa Học Kỷ Thuật Lê Văn Khoa (1995), môi trường ô nhiễm, NXB Giáo Dục Lê Thị Hương Mai, Mai Thị Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà, Trần Văn Nhị (1997), nghiên cứu vi khuẩn nitrat hóa từ nước thải chế biến nông sản, thực phẩm số ngoại ô Hà Nội, kỹ yếu viện công nghệ sinh học, NXB khoa học kỹ thuật Nguyễn Thị Thu Thủy (1999), xử lý cấp nước sinh hoạt công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Nguyễn Thị Kim Cúc, số tính chất sinh học chủng vi khuẩn nitrate hóa phân lập Hà Nội, viện công nghệ sinh học Lê Văn Cát, xử lý nước thải giàu hợp chất nito photpho Giáo trình xử lý nước thải, NXB khoa học kỹ thuật, Trần Văn Nhân, Ngô Thị Nga Lương Đức Phẩm (2002), công nghệ xử lý nước thải phương pháp sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Văn Phước (2008), Quản lý Xử lý chất thải rắn, NXB Xây dựng Tài Liệu Tiếng Anh 10 Gupta A B (1997), thiosphaera pantotropha: sulfur bacterium capable ò simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic defnintrification, Enz.microb.tenchnol, 21, pp.135.214 11 J Lee Selective photocatalytic oxidation of NH3 to N2 on platinized TiO2 in water Environ Sci Technol Vol 36, 5462 - 5468 (2002) 12 D K Lee Mechanism and kinetics of the catalytic oxidation of aqueous ammonia to molecular nitrogen Environ Sci Technol Vol 37, 5745 - 5749 (2003) 13 A Mulder The quest for sustainable nitrogen technologies Wat Sci Technol Vol 48, No 1, 67 - 75 (2003) Nguyễn Đình An 43 Lớp CNSH 11.01-K18