Nghiên cứu tạo đột gene cytochrom từ chủng xạ khuẩn s carzinostaticus atcc 15944

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Tạ Thị Thu Thủy tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô q báu lịng nhiệt tình suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ cho em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, người ln bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt thời gian học tậpcũng trình thực đề tài Do thời gian khả thân cịn hạn chế, khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận bảo thầy cô đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hồn chỉnh Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thu Trang NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC Chương I :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.2 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh kháng sinh xạ khuẩn 10 1.2 Kháng sinh polyketide enediyne 13 1.2.1 Phân loại enediyne 13 1.2.2 Vai trò sinh học enediyne 14 Neocarzinostatin (NCS) 15 1.3.1 Cấu trúc NCS 15 1.3.2 Cơ chế hoạt động kháng sinh NCS 17 1.3.3.Các hướng nghiên cứu sinh tổng hợp NCS 18 1.3.4 Các nghiên cứu phát triển kháng sinh chống ung thư 19 1.4 Hệ thống enzyme Cytochrome - P450 Streptomyces 21 1.4.1 Chức sinh học cytochrome 21 1.4.2 Đặc điểm cytochrome P450 21 Chương II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1.Hóa chất, dụng cụ 23 2.2.Chủng giống, plasmid môi trường nuôi cấy 24 2.2.1.Chủng giống plasmid 24 2.2.2.Môi trường nuôi cấy 24 2.3 Tách chiết thu nhận NCS từ chủng đột biến 24 2.3.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học khoanh giấy khuếch tán 25 2.4 Phương pháp tạo đột biến gene trao đổi chéo 25 2.5.Phương pháp tạo tế bào trần (protoplast)(Transformation and Generation) 27 2.6 Phương pháp chuyển gen vào tế bào trần 29 NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2.7 Kỹ thuật PCR kiểm tra gene đột biến 30 Chương III : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31 3.1.Kiểm tra độ cảm ưng xạ khuẩn S carzinostatius với kháng sinh 31 3.2.Tạo chủng tái tổ hợp mang vector đôt biên 31 3.3.Sàng lọc chủng đột biến genencsB3 33 3.4 Phân tích đột biến kiểm tra PCR 34 3.5 Phân tích sản phẩm chiết tách từ chủng đột biến 35 3.5.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học 35 3.5.2 Phân tích sản phẩm từ chủng đột biến ncsB3 LC- Mass 36 PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 4.1 Kết luận: 38 4.2 Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 42 NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích KS kháng sinh VSV Vi sinh vật LB Luria Bertani L Lit G Gam HSCC Hệ sợi chất Gram(+) Gram dương Gram(-) Gram âm D Đường kính vịng vô khuẩn NCS Neocarzinostatin Apo-NCS Apoprotein Neocarzinostatin NCS-chro Neocarzinostatin-chromophore NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.Cấu trúchóahọc daunorumycin(DNR)và idarumycin(IDA) 10 Hình Đại diện enediyne nhóm phân tử C nhóm 10 phân tử C 14 Hình Cấu tạo neocarzinostatin 15 Hình (A) Các gen chủng S.carzinostaticus ATCC15944 đoán tham gia sinh tổng hợp gốc naphthoic acid; (B) Con đường sinh tổng hợp gốc naphthoic acid NCS (ncsB: naphthoic acid synthase; ncsB1: O-methyltransferase; ncsB2: CoA ligase; ncsB3: P-450 hydroxylase) 17 25 Hình Sơ đồ tách chiết NCS Hình Sơ đồ phương pháp tạo sàng lọc chủng đột biến 27 Hình Kiểm tra độ nhạy chủng S.carzinostaticus ATCC15944 với nồng độ kháng sinh khác loại: Apramycin, Neomycin Erythromycin Hình : A) Các khuẩn lạc phát triển đĩa thạch sau chuyển gen 36 B) Đĩa cấy chuyển chủng tái tổ hợp Hình Hai colony nuôi cấy môi trường lỏng R2YE/Neo50, R2YE/Apr20 cho thấy colony mọc môi trường lỏng R2YE/Neo50 không mọc R2YE/Apr20 Hình 10 Hình ảnh sản phẩm PCR với có mặt gene kháng neomycin thay cho ncsB3 Hình 11 Kiểm tra hoạt tính sinh học chất với chủng M luteus: Methanol (1); NCS tách từ chủng gốc S.carzinostaticus ATCC15944 (2) (4), chủng đột biến ncsB3 (3) Hình 12 Phân tích chất tách chiết từ chủng (A) S.carzinostaticus HDP450; (B) S.carzinostaticus HDP450/pIB3 (C) S.carzinostaticus HDP450/pIB3 kỹ thuật LC-MS 31 33 34 35 36 37 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Ví dụ cytochrome P450 Streptomyces…………… .22 Bảng khảo sát điều kiện thích hợp chuyển gen vào tế bào… … 32 NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỞ ĐẦU Trên giới ngành cơng nghệ hóa dược phát triển đến đỉnh cao, công ty dược, công ty công nghệ sinh học sản xuất bán thị trường loại thuốc, chế phẩm sinh học nhờ có ứng dụng từ cơng nghệ protein, cơng nghệ vi sinh, sinh học phân tử công nghệ gen, nhờ mà họ thu nguồn lợi nhuận khổng lồ Xu hướng công ty dược công ty công nghệ sinh học lớn giới coi trọng đầu tư cho nghiên cứu để tạo chế phẩm sinh học mới, hệ kháng sinh có hoạt lực mạnh hơn, không bị kháng lại vi khuẩn gây bệnh, chìa khóa để tạo nên thành cơng cho cơng trình ứng dụng cơng nghệ gen, công nghệ sinh học phân tử Neocarzinostatin (NCS), kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh tự nhiên enediyne.NCS tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomyces carzinostaticus ATCC15944 (Ishida et al 1965), kháng sinh nghiên cứu nhiều nhóm kháng sinh enediyne NCS có cấu tạo gồm phần: protein (NCS-apoprotein) phần non-protein (NCS-chromophore) theo tỉ lệ 1:1 Một số nghiên cứu trước cho thấy sau loại bỏ cytochrome P450 có khả tạo chất đồng phân làm tăng sản lượng chất (Mingot JM et al., 1999) Với mong muốn tạo sản phẩm giống với NCS chứng minh hoạt tính gen ncsB3 nhóm thưc hiên đột biến gene ncsB3(cytochrome P450 hydrogenase) từ chủng gốc S.carzinostaticus ATCC 15944 với tên đề tài: “Nghiên cứu taọ đột gene cytochrom từ chủng xạkhuẩn S.carzinostaticus ATCC 15944” với mục tiêu sau: Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợpmang vector đột biến gene ncsB3 từ tế bào S.carzinostaticus ATCC 15944 Sàng lọc lựa chọn chủng đột biến gen ncsB3 Phân tích sản phẩm tạo thành từ chủng đột biến NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chương I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan xạ khuẩn 1.1.1 Đặc điểm chung Xạ khuẩn (Actinomycetales) nhóm vi sinh vật đơn bào hay vi khuẩn thật Tênxạkhuẩn–actinomycete-bắtnguồntừ tiếngHy Lạp“actys”(tia)và“mykes”(nấm)vàbanđầuxạkhuẩnđượccoilànấm nhỏvì chúngsinhtrưởnggiốngvớinấm Phần lớn xạ khuẩn tế bào Gram (+), hoại sinh, có cấu tạo sợi phân nhánh Mạnglướiphânnhánhcủathểsợithườngpháttriểnở cảbềmặtcơchấtrắn(tạothành cơchất hệsợi khísinh)lẫnbêntrongtạothành (Ashutosh,2008) sinhbàotử,bàotửrấtkhácnhauvềhìnhdạngvàkích hệsợi Đasốxạkhuẩn thước Đâylàmộttrongnhữngđặcđiểm đểphânloại Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nước ao hồ, nước biển, phần bùn, lớp trầm tích chất hữu khác Xạ khuẩn nghiên cứu cách sâu sắc chúng có ý nghĩa quan trọng tự nhiên: tích cực tham gia vào q trình chuyển hóa nhiều hợp chất đất, nước, chúng có vai trị quan trọng chu trình tuần hồn vật chất tự nhiên Chúng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng khác nên dùng để sản xuất nhiều loại enzym như: protease, amilase, cellulase, glucoizomerase, vitamin axit hữu Nhưng đặc điểm quan trọng bậc xạ khuẩn khả sinh chất kháng sinh, 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả (Nguyễn Lân Dũng, 2001) Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh biết đến giới 80% xạ khuẩn (Lê Gia Hy, 1994) Đây kết trình đối kháng vi sinh vật thúc đẩy q trình tiến hóa xạ khuẩn NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nhìn chung, nhiệt độ ơn hịa 25-30°C pH trung tính điều kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển Mặc dầu vậy, nhiều loài phân lập môi trường khắc nghiệt ví dụ Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh phân lập từ trầm tích hồ Nam cực sống nhiệt độ 0°C (Chen et al., 2005) vàNocardiopsis alkaliphilađượcphân lậptừđấtsamạcởAiCậpcóthểsốngởpH 9.5-10(Hozzeinetal.,2004) Vềmặtphânloại,xạkhuẩncó5phânlớp,6bộtrongđóbộđượcnhắcđến nhiềunhất(cógiátrịtrongyhọcvàkinhtế)làbộActinomycetales.BộActinomycet ales có13 dướibộ,42 họvàkhoảng200chi Xạ khuẩn thường chia thành hai loại: Streptomyces Streptomyces(non-Streptomyces).Chi xạ khuẩn đượcbiết nhiều nhấtlàStreptomyces,với khoảng500loài Streptomycesđặcbiệt nhiềutrongđấtnơichúngphânhủy hoạisinhrấtnhiềuphứccácchấthữucơbằngcác enzymengoạibào.Thựctế,mùimốcđặctrưngcủanhiềuloạiđấtliênquanđến sản sinh hợp chất hữu dễ bay gọi Mộtphầnrấtlớncácchấtkháng geosmin sinh đượcsựdụnghiệuquảtrongđiềutrịcónguồngốctừcáclồiStreptomycestrongđó đượcbiếtđếnnhiềunhấtlàstreptomycin,erythromycinvàtetracycline 1.1.2 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường hình thành cuối pha sinh trưởng, pha cân Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với hình thành bào tử, điểm cần lưu ý nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Trong số 8000 chất kháng sinh biết đến giới 45% xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, 21% nấm (Lê Gia Hy, 1994) Chi Streptomyces chi nghiên cứu nhiều nhóm xạ khuẩn, với 500 lồi miêu tả, chi có nhiều lồi có khả NGUYỄN THUTRANG Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC sinh chất kháng sinh, loại kháng sinh quan trọng streptomycin Streptomyces griseus sinh Khả sinh kháng sinh kết trình đối kháng vi sinh vật thúc đẩy trình tiến hóa xạ khuẩn Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn, người ta thường mô tả hai pha: pha sinh trưởng (trophophase) - khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh; pha sinh tổng hợp (idiophase) - sinh trưởng chậm xuất trình tự tan khuẩn ty sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh Cáchợpchấtkhángsinhkhác nhaucủaxạkhuẩnđãđượcnghiêncứuđặcđiểm aminoglycoside,anthracyclin, nucleoside,peptide, gồm glycopeptide,β-lactam,macrolides, polyene, polyeste,polyketide, actinomycinvàtetracycline(Goodfellowetal.,1988).Cáchợpchấtnày thànhcơnglàm đãđượcsửdụng thuốcdiệtcỏ,thuốcchốngungthư,thuốc,cácchấtđiềuhịamiễndịch cácchấtchốngkýsinhtrùng(Thomsonetal.,1995) Nhiều chất hóa học dùng hóa trị liệu ung thư sản phẩm thứ cấp vi sinh vật sinh gọi kháng sinh chống/kháng khối u (Nduka, et al 2007; Carlos et al., 2009).Một số nhóm kháng sinh dùng điều trị ung thư kể đến anthracycline, actinomycin bleomycin Anthracycline sử dụng rộng rãi điều trị ung thư ung thư máu, ung thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999) Một số chủng cho anthracycline Streptomyces coeruleorubidus Streptomyces peucetius.Nhóm khángsinh chođếnnay (DNR),doxorubicin,epirubicinvà 1).Daunorubicinvàadriamycin đượcghinhậngồm idarumycin NGUYỄN THUTRANG (IDA) gắnvàocáccặpbasedođókìm RNAvàDNA.Mithramycinvàchromomycin A3kìm daunorubicin hãm (Hình hãmtổnghợp tổng hợp Page VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI RNAphụthuộc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC DNA, bleomycintươngtácvà làmđứtgãyDNA(Nduka,2007;Carlosetal.,2009) Hình 1.Cấu trúchóahọc daunorumycin(DNR)và idarumycin(IDA) 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh kháng sinh xạ khuẩn Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào yếu tố pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men… Để xạ khuẩn phát triển tốt hình thành sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo mơi trường lên men có đầy đủ nguồn cacbon, nitơ, nguyên tố vi lượng, thông số điều kiện ni cấy thích hợp 1.1.3.1 Ảnh hưởng môi trường Thành phần môi trường yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả sinh kháng sinh xạ khuẩn Môi trường nghèo dinh dưỡng thúc đẩy vi sinh vật hình thành bào tử nhiều sinh tổng hợp kháng sinh Nguồn cacbon nguyên liệu thiếu đời sống vi sinh vật, ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chất kháng sinh nguồn cacbon tham gia vào cấu tạo tế bào tham gia vào trình hình thành lên cấu trúc sản phẩm Trong nghiên cứu lên men sản xuất chất kháng sinh từ vi sinh vật, người ta nhận thấy glucose nguồn cacbon thích hợp cho phát triển xạ khuẩn lại yếu tố cản trở sinh kháng sinh (Nguyễn Như Hiền, 2006) Các polysaccaride oligosaccaride lại tốt cho sinh NGUYỄN THUTRANG Page 10 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Mơi trường dịch thể ni mơi trường R2YE sau 48h 280C (có bổ xung glycin) ↓ Ly tâm 6000 vòng/ phút ↓ Rửa lần dung dịch Sacazoza 10.3% ↓ Ly tâm 6000 vòng / phút ↓ Rửa buffer P loại bỏ dịch ↓ Sinh khối ủ dung dịch lyzozym (2mg/ml) 300C 30 phút ↓ Lọc qua ↓ Dịch huyền phù tế bào trần ↓ Ly tâm rửa lần dung dịch buffer P ↓ Tế bào trần ↓ Kiểm tra khả sống tế bào trần  Bảo quản dung dịch glyxerol 20% -80 0C 2.6 Phương pháp chuyển gen vào tế bào trần - Lấy 100µl dung dịch tế bào trần vào ống nghiệm 1,5 ml (ependoff) khử trùng - Trộn lẫn với 20 µl dung dịch chứa vector tái tổ hợp 200 µl PEG từ 20 - 60% - Trộn ly tâm ống nghiệm phút - Loại bỏ phần dịch thêm vào 100 µl P buffer - Cấy trải mẫu thí nghiệm 02 đĩa thạch R2YE, đồng thời cấy trải 100 µl tế bào trần làm đối chứng - Nuôi tĩnh nhiệt độ 280C thời gian từ 16 – 24 giơ - Khi có khuẩn lạc chấm nhỏ phủ kháng sinh Apramycin với nồng độ từ 50 100 µl.ml để nhận tế bào chuyển gen NGUYỄN THUTRANG Page 29 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2.7 Kỹ thuật PCR kiểm tra gene đột biến Các cặp mồi cho kiểm tra gene gene kháng neomycin (neor) dùng cho kỹ thuật PCR mua từ hãng Genotech - Hàn Quốc Trình tự mồi thiết kế sẵn cung cấp phịng thí nghiệm sinh học phân tử Khoa Cơng nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà nội Hỗn hợp phản ứng bao gồm 20 pM mồi, 0.125 mM deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), DNA tổng số, 2UI La Taq polymerase, 2.5 mM MgCl2 Điều kiện khuếch đại: nhiệt độ khử 94ºC vòng 7’, sau để 94ºC vịng 1’ cho 30 chu kỳ; nhiệt độ ủ dao động từ 55ºC đến 68ºC vòng 1’, nhiệt độ khuếch đại 74ºC vòng1’ cho 30 chu kỳ đầu, 74ºC vòng 7’ cho chu kỳ kéo dài sau NGUYỄN THUTRANG Page 30 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chương III : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kiểm tra độ cảmứng xạ khuẩnS carzinostatius với kháng sinh Để lựa chọn khả kháng sinh với chủng gốc, dùng loại kháng sinh neomycin, apramycin, erythromycin để kiểm tra độ nhạy cảm chủng xạ khuẩn S.carzinostatiusATCC15944 Kết cho thấy chủng xạ khuẩn S.carzinostatiusrấtnhạy cảm với loại kháng sinh chọn nồng độ kháng sinh mức thấp 1µg/ml (Hình 7) Với kết kiểm tra khẳng định tế bào khơng có gene neor khơng thể sinh trưởng mơi trường có chứa kháng sinh neomycin Tương tự tế bào có chứa gene neor, tế bào sinh trưởng mơi trường chứa neomrycin Với kết nhóm nghiên cứu sử dụng neomycin làm kháng sinh kiểm định lựa chọn đột biến phù hợp Nếu tế bàođã bị gây đột biến gene ncsB3 thay neorthì chủng đột biến tồn kháng sinh neomycin Kháng sinh apramycin kháng sinh để sàng lọc đột biến kép 2 1: 1µg/ml 6 5 4: 7.5µg/ml 7: 15µg/ml 2:3µg/ml 5: 10µg/ml 3: 5µg/ml 6: 12µg/ml Hình7 Kiểm tra độ nhạy chủng S.carzinostaticus ATCC15944 với nồng độ kháng sinh khác loại: Apramycin, Neomycin Erythromycin 3.2Tạo chủng tái tổ hợpmang vector đôt biên NGUYỄN THUTRANG Page 31 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thực tế nghiên cứu cho thấy việc chuyển gen vào tế bào xạ khuẩn vơ khó khăn thực nhiều thử nghiệm Đế tạo tế bào trần tốt cho việc chuyển gen cần thiết phải khảo sát tìm điều kiện thích hợp có ảnh hưởng đến chuyển gen như: điều kiện vi sinh vật, nồng độ lyzozyme ủ thời gian xử lý, nồng độ PEG thêm vào chuyển gen, nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc chuyển thành cơng (transformant) Để tìm điều kiện phù hợp cho thành công tạo tế bào tái tổ hợp thí nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu xuất chuyển gen là: Thời gian ủ lysozim để loại bỏ thành tế bào (petidoglycon) từ 20 đến 70 phút; nồng độ PEG xúc tác cho trình chuyển gen từ 10 đến 60% nồng độ kháng sinh phủ bề mặt đĩa chuyển gen từ 50 đến 100 µg.ml-1 Bảng khảo sát điều kiện thích hợp chuyển gen vào tế bào STT Apramycin Xử lý với PEG Khả N độ Khả Nồng chuyển Apr phát triển độ (%) µg.ml-1 S.p gen 50 ++ 10 - 60 + 20 - 70 - 30 + 80 - 40 ++ Thời gian ủ lyzozim Thời Tế bào trần thích hợp (giờ) gian (phút) 30 - TB sống cao; - Không chuyển gen 40 - TB sống cao; - Không chuyển gen 50 - Tỷ lệ TB sống cao - Chuyển gen thành công 60 - Tỷ lệ sống thấp - Chuyển gen thành công 90 50 70 60 100 Ghi chú: (+) phát triển; (-) không phát triển; Tế bào chết Với thời gian xử lý lysozim 50 phút thích hợp số tế bào trần có tỷ lệ sống cao tế bào khả biến thích hợp NGUYỄN THUTRANG Page 32 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Trong thực tế thí nghiệm ủ lysozim thời gian ngắn có lượng tế bào loại bỏ lơp vỏ peptidoglycon, thời gian dài toàn tế bào trần chết Khi phủ kháng sinh thiostrepton với dải nồng độ khác nhau, nồng độ chủng tự nhiên bị ức chế khơng phát triển ta lấy nồng độ chuẩn để phủ kháng sinh với mẫu chuyển gen để lựa chọn khuẩn lạc thành công Tương tự với nồng độ PEG thích hợp 40% với nồng độ kháng sinh phủ lên đĩa chuyển gen 70 µg.ml-1 tỷ lệ tế bào nhận vector tái tổ hợp (tế bào tái tổ hợp đạt cao nhất) (Hình 8) A B Hình : A) Các khuẩn lạc phát triển đĩa thạch sau chuyển gen 36 B) Đĩa cấy chuyển chủng tái tổ hợp 3.3 Sàng lọc chủng đột biến genencsB3 Để lựa chọn colony có đột biến kép hoàn toàn ncsB3, colony lựa chọn nuôi cấy môi trường dịch R2YE bổ sung 50 µg/mlneomycin ni cấy nhiệt độ 37°C Các sợi xạ khuẩn pha loãng với nồng độ 1/103, 1/104, 1/105 1/106 sau dàn đĩa thạch R2YE khơng có kháng sinh ủ tủ ấm vô khuẩn 28°C Sau khoảng 60-72 xuất colony tiến hanhlấy ngẫu nhiên nhiên khoảng 500 colony cấy đồng thời môi trường khác đĩa thạch R2YE bổ sung 50 µg/ml neomycinvà đĩa thạch R2YE bổ sung 20 NGUYỄN THUTRANG Page 33 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC µg/ml apramycin (R2YE/Neo50, R2YE/Apr20) Colony có gene kháng neomycin gene nhạy cảm với apramycin (neor.aprs) colony tiềm cho việc lựa chọn chủng đột biến kép gene ncsB3 hoàn toàn genome Những colony bước đầu khẳng định qua sản phẩm PCR Trong số khoảng 500 colony nuôi cấy môi trường đĩa thạch loại đĩa (R2YE/Neo50, R2YE/Apr20) Ở hệ thứ phát colony phát triển tốt môi trường R2YE/Neo50 không mọc môi trường R2YE/Apr20 Khi nuôi cấy colony môi trường dung dịch R2YE có kháng sinh với nồng độ tương ứng thu kết tương chủng đột biến sinh trưởng mơi trường có chứa neomycin 50 mg/l chết mơi trường có chứa apr 20mg/lit (Hình 9) Apr 20µg/ml Neo 50µg/ml Neo 50µg/ml Apr 20µg/ml Hình9 Hai colony ni cấy môi trường lỏng R2YE/Neo50, R2YE/Apr20 cho thấy colony mọc mơi trường lỏng R2YE/Neo50 khơng mọc R2YE/Apr20 3.4 Phân tích đột biến kiểm tra PCR Hai colony nuôi cấy để tách DNA tổng số Bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi gene kháng neomycin (neor) cặp mồi gene kháng apramycin (aprr) thấy hình ảnh 1kb xuất sản phẩm PCR khơng thấy hình ảnh PCR gene apr Kết cho thấy hình ảnh NGUYỄN THUTRANG Page 34 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC sản phẩm PCR đoạn gene kháng neomycin (neor) điện di DNA có độ dài tương ứng khoảng1,0 kb, điều chứng tỏ gene neor chèn vào genome chủng S.carzinostaticus Bên cạnh đo sản phẩm PCR gene nhiên khơng thấy xuất hiệnhình ảnh PCR gene kháng apramycin (aprr) điện di, chứng tỏ vector pKC1139 bị loại bỏ khỏi genome chủng tự nhiên Điều chứng tỏ chủng đột biến tạo thành hoàn toàn ncsB3 thay gene kháng neomycin – neo Apramycin M Neomycin Hình 10 Hình ảnh sản phẩm PCR với có mặt gene kháng neomycin thay cho ncsB3 3.5 Phân tích sản phẩm chiết tách từ chủng đột biến 3.5.1 Kiểm tra hoạt tính sinh học Sản phẩm tách chiết từ chủng S.carzinostaticus (chủng gốc),S.carzinostaticus HDP450 (chủng độtbiến) vàS.carzinostaticus HDP450/pIB3 (chủng đột biến có bổ sung ncsB3) kiểm tra hoạt tính sinh học với chủng tụ cầu vàng Kết cho thấy vịng kháng khuẩn xuất chủng chất tách chiết từ chủng gốc ban đầu chủng đột biến có bổ sung ncsB3 Riêng chủng đột biến khơng thấy xuất vịng kháng khuẩn Như gene ncsB3 có vai trị vơ quan trọng đường sinh tổng hợp kháng sinh neocazinostatin, gene cấu trúc kháng sinh bị biến đổi hoạt tính NGUYỄN THUTRANG Page 35 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ Ở HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH H HỌC Hình 11 Kiểm tra hoạtt tính sinh học h chất với chủng M luteus: Methanol (1); NCS tách từ chủng gốc S.carzinostaticus ATCC15944 (2) (4), chủng đột biếến ncsB3 (3) 3.5.2 Phân tích sản n phẩm ph từ chủng đột biến ncsB3 LC Mass Để khẳng định ự có mặt NCS chromophore chủng ng đột biến S.carzinostaticus HDP450 chủng S.carzinostaticus carzinostaticus HDP450/pIB3, chấất sau tách chiết từ chủng đượ ợc phân tích kỹ thuật LC-MS Chúng tơi khơng thấy khối lượng tươ ương ứng với khối lượng cuả NCS m/z [M+H]+ = 660 đồng đẳng củaa NCS Tuy nhiên bổ sung ncsB3 chủng đột biến S.carzinostaticus HDP450 sản phẩm NCS lại đượcc ttạo ra, điều khẳng định nh thơng qua kkỹ thuật LC-MS (Hình 12) NGUYỄN THUTRANG UTRANG Page 36 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hình 12 Phân tích chất tách chiết từ chủng (A) S.carzinostaticus HDP450; (B) S.carzinostaticus HDP450/pIB3 (C) S.carzinostaticus HDP450/pIB3 kỹ thuật LCMS NGUYỄN THUTRANG Page 37 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHẦN IV : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận: Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu thu kết sau: 1) Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp chuyển gene ncsB3 chủng tái tổ hợp chứa vector đột biến 2) Sàng lọc chủng đột biến gene ncsB3 3) Thu nhận kháng sinh Neocarzinostatin từ chủng đột biến phân tích sản phẩm kháng sinh 4.2 Đề xuất 1) Tinh kháng sinh biến đổi cấu trúc sau đột biến gen ncsB3 phân tích cấu trúc sản phẩm NGUYỄN THUTRANG Page 38 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO Denis, F., R Brzezinski (1991), An improved aminoglycoside resistant gene cassette for use in grame-negative bacteria and Streptomyces FEMS Microbiol Lett 65, 261-264 Edo, K., Mizugaki, M., Koide, Y., Seto, H., and Ishida, N (1985), The structure of neocarzinostatin chromophore possessing a novel bicyclo[7.3.0] dodecadiyne system Tetrahedron Lett, 26, 331-340 Kiserse, T., Bibb, MJ., Buttner M.J., and Hopwood,DA (2000) Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich KappenL.S., Goldberg,I.H(1985), Activation of neocarzinostatin chromophore and formation of nascent DNA damage not require molecular oxygen, Nucleic Acids Res, 13, 1637 –1648 Liu, W., Nonaka, K., Nie, L., Zhang, J., Ben Shen et al(2005), The neocarzinostatin biosynthetic gene cluster from Streptomyces carzinostaticus ATCC 15944 involving two iterative type I polyketide synthases Chem Biol, 12, 293-302 Luo, Y., Lin, Zhang, SJ., Cooke, H., Bruner, S., and Shen, B (2008), Regiospecific O-methylation of naphthoic acids catalyzed by NcsB1, an O-methyltransferase involved in the biosynthesis of the enediyne antitumor antibiotic neocarzinostatin JBC paper, 283(21), 14694-702 Sambrook, J., Fritsch, EF.,and Maniatis,T (1989) Molecular cloning alaboratory manual, 2ndedition Cold Spring Habour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA Shen, B., Liu, W., and Nonaka, K (2003), Enediyne natural products: biosynthesis and prospects towards engineering novel antitumor agents Curr Med Chem, 10, 2317-2325 NGUYỄN THUTRANG Page 39 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sthapit, B., Oh, T.J., Lamichhane, R., Liou, K., and Sohng,J.K (2004), Neocarzinostatin naphthoate synthase: An unique iterative type I PKS from neocarzinostatin producer Streptomyces carzinostaticus FEBS Lett, 566, 201-206 10 Urbaniak, M D., Bingham, J P., Hartley, J A., Woolfson, D N., and Caddick, S (2004) J Med.Chem, 47, 4710-4715 11 Urbaniak, M D., Muskett, F W., Finucane, M D., Caddick, S., and Woolfson, D N (2002) Biochemistry,41, 11731-11739 12 NdukaO (2007), ModernIndustrial Microbiologyand Biotechnology,Science, Enfield, USA,pp.429–453 13 CarloO.,CarmenM.,JoseA.S.(2009),“Antitumorcompounds frommarine actinomycetes”,MarineDrugs,97,pp.210– 248 14 GewirtzD.A.(1999),“Acriticalevaluationofthemechanismofactionprop osedfor theantitumoreffectsof theanthracyclineantibioticsadriamycinanddaunorubicin”, BiochemPharmacol,57,pp.727–741 15 George P.R (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, pp 1709 – 1712 16 Feyereisen, R (1999) Annu Rev Entomol., 44, 507-533 17 Werck-Reichhart D., Feyereisen, R., (2000) Genome Biol 11:reviews3003.1–3003.9 18 Chung, L., Liu, L., Patel, S., Carney, J R., Reeves, C.D (2001) J Antibiot., 54, 250-356 19 Xue, Y., D Wilson, L Zhao, H Liu, and D H Sherman (1998) Chem Biol., 5, 661–667 20 Grimm, A., Madduri, K., Ali, A., Hutchinson, C R (1994) Gene, 151, 1-10 21 Ikeda, H., Nonomiya, T., Usami, Ohta, T., Omura, S (1999) Prod Natl Acad Sc., 96, 9509-9514 NGUYỄN THUTRANG Page 40 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC 22 Lamb, D C., Ikeda, H., Nelson, D R., Ishikawa, J., Skaung, T., Jackson, C., 23 Omura, S., Waterman, M.R., Kelly, S L (2003) Biochem Biophys Res Commun., 307, 610-619 24 O’ Keefe, D P., Harder, P.A (1991) Mol Microbiol., 15, 2099-2105 25 Guengerich, F P (1991) J Biol Chem., 266, 10019–10022 NGUYỄN THUTRANG Page 41 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHỤ LỤC Môi trường R2 (1000ml) Sucrose K2SO4 103 g 0.25 g MgCl2.6H2O 10.12 g Glucose 10 g Difco Casaminoacids 0.1 g Cho tất thành phần hòa tan nước cất vạch 800 ml, khuấy thành phần thành dung dịch hòa tan Khử trùng nhiệt độ 1210C vịng 30 phút, sau cho thêm thành phần sau: KH2PO4 (0.5%) 10 ml CaCl2.2H2O (3.68%) 80 ml L-proline (20%) 15 ml TES buffer (5.73%, adjusted to pH7.2) 10 ml Trace element solution 0.2 ml NaOH 1N 0.5 ml Môi trường R2YE Tương tự pha chế mơi trường R2 có thêm 5g Difco yeast extract 1000ml dung dịch Môi trường YEME Bacto-yeast extract 3g Bato-peptone 5g Malt extract 3g Glucose 10g Sucrose 103g MgCl2.6H2O (1M) 50 ml Glycine 20% 60 ml Cho nước cất vào đến vạch 1000ml NGUYỄN THUTRANG Page 42 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Môi trường N-Z amin (1000ml) Glucose 10 g Bacto-soluble starch 20 g Bacto-yeast extract 5g N-Z amine 5g NGUYỄN THUTRANG Page 43