Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối và thu hồi chủng streptococcus thermophilus vny3 có ứng dụng trong lên men sữa chua

Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” LỜI CẢM ƠN Thời gian thực tập thời gian quan trọng em trước tốt nghiệp trường Thơng qua q trình em tiếp xúc với kiến thức học, vận dụng kiến thức cách linh hoạt, sáng tạo thực tế Hơn qua thời gian em tiếp xúc với môi trường làm việc động, rèn luyện tác phong làm việc học đượcnhiều học quý báu Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn La Anh- Chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm, người tận tình hướng dẫn, bảo, tạo iều kiện giúp em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, cán - Bộmôn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Cơng nghiệp Thực phẩm giúp đỡ em hồn thành tốt công việc Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệsinh học, Viện đại học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ chúng em trongsuốt năm học qua Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè người động viên, khích lệ em đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày23 tháng05 năm2016 Người thực Tạ Thị Thu Huyền i Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cám ơn thơng tin trích dẫn chun đề ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 23 tháng05 năm 2016 Người thực Tạ Thị Thu Huyền ii Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi DANH MỤC HÌNH vii PHẦN1: MỞ ĐẦU PHẦN 2:TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn lactic 2.1.1 Tổng quan chung vi khuẩn lactic 2.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic sản xuất sữa chua 2.1.3 Chủng Lactobacillus bulgaricus 2.1.4 Mối liên hệ Lactobacillus bugaricus Streptococcus thermophilus 2.2 Chủng vi khuẩn Streptococcus thermophilus 2.2.1 Đặc điểm chủng Streptococcus thermophilus 2.2.1.1 Tên gọi 2.2.1.2 Đặc điểm, hình thái, kích thước 2.2.1.3 Cấu trúc gen 2.2.1.4 Cấu tạo tế bào 2.2.1.5 Chuyển hóa lactose 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng S thermophilus 10 2.2.2.1 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh trưởng 10 2.2.2.2 Ảnh hưởng môi trường lên men đến khả sinh trưởng10 2.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng 11 2.2.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới khả sinh trưởng 11 2.2.3 Vai trò chủng S thermophilus 11 2.2.4 Tình hình sản xuất tiêu thụ sữa chua giới Việt Nam 14 2.2.4.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ sữa chua giới 14 iii Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” 2.2.4.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ sữa chua Việt Nam 15 PHẦN 3:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 18 3.1.1 Chủng giống 18 3.1.2 Nguyên liệu hóa chất 18 3.1.3 Thiết bị 18 3.1.4 Môi trường 19 3.1.4.1 Môi trường giữ giống 19 3.1.4.2 Môi trường lên men 19 3.2 Phương pháp phân tích vi sinh 20 3.3 Phương pháp đo độ đục quang học 21 3.4 Phương pháp phân tích hàm lượng đường tổng 22 3.5 Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Xác định thời gian sinh trưởng chủng VNY3 25 4.2 Ảnh hưởng thơng khí 27 4.3 Ảnh hưởng pH môi trường 28 4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 29 4.5 Ảnh hưởng hàm lượng lactose 30 4.6 Ảnh hưởng nguồn đạm 31 4.6.1 Lựa chọn nguồn đạm 31 4.6.2 Ảnh hưởng hàm lượng đạm 32 4.7 Lựa chọn nhiệt độ lên men 33 4.8 Động học trình lên men 34 4.9 Thu hồi sinh khối 36 4.9.1 Ảnh hưởng chất bảo vệ màng tế bào đến trình thu hồi 36 4.9.2 Ảnh hưởng trình sốc nhiệt 37 4.9.3 Ảnh hưởng sốc thẩm thấu 38 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 iv Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Tài Liệu Tiếng Việt 41 Tài Liệu Tiếng Anh 41 v Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi STT Ký hiệu Chữ viết tắt BSA Bovine serium albumin OD Optical Density (mật độ quang) MRS Medium Resolusion Spectrograph CFU Colony Forming Unit(mật độ tế bào ) Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Đề tài:“ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng lên men sữa chua” DANH MỤC HÌNH Hình 1: Biểu đồ mức tiêu thụ sản phẩm từ sữa giới ( ngàn tấn) [2] 15 Hình 2: Mức tiêu thụ sữa chua trung bình người năm nước (hũ/người/năm) [14] 15 Hình 3: Động học lên men VNY3 42˚C 26 Hình 4: Ảnh hưởng thơng khí 28 Hình 5: Sự thay đổi pH mơi trường 29 Hình 6: Ảnh hưởng pH đến mật độ tế bào VNY3 29 Hình 7: Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống 30 Hình 8: Ảnh hưởng hàm lượng đường lactose 31 Hình 9: Ảnh hưởng nguôn đạm đến mật độ tế bào 32 Hình 10: Ảnh hưởng hàm lượng đạm 33 Hình 11: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men 34 Hình 12: động học trình lên men 35 Hình 13: Ảnh hưởng thời gian đến mật độ tế bào 36 Hình 14: Ảnh hưởng trình sốc nhiệt đến VNY3 38 Hình 15: Ảnh hưởng sốc thẩm thấu đến VNY3 39 vii Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học PHẦN1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Trên giới, ngành công nghiệp sữa lên men phát triển từ lâu đời, tạo nhiều mặt hàng đa dạng chủng loại.Tại Việt Nam, năm gần nhu cầu tiêu dùng sản phẩm từ sữa tăng lên đáng kể, tác động tích cực đến phát triển ngành công nghiệp chế biến sữa.Tuy nhiên, nguồn giống khởi động cho sản phẩm sữa lên men chủ yếu nhập từ nước ngoài.Hiện nay, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu cơng bố đến sản xuất giống khởi động lĩnh vực mẻ Một sản phẩm ngành công ngiệp chế biến sữa phải kể đến sữa chua Sữa chua sản phẩm thu lên men lactic sữa động vật, có nhiều lợi ích đến sức khỏe người Nhờ trình lên men lactic, đường sữa chuyển hóa thành đường lactose dễ tiêu hóa chất thơm diacetyl Sữa chua trở thành ăn dinh dưỡng, dễ hấp thụ, nhờ có vi khuẩn lactic (một loại lợi khuẩn) nên sữa chua hỗ trợ cho đường ruột, dày vấn đề tiêu hóa Giống khởi động ứng dụng sản xuất sữa chua bao gồm hai chủng vi sinh vật Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Để thu lượng sinh khối tối đa ứng dụng sản xuất giống khởi động lên men sữa chua thực đề tài: “Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Streptococcus thermophilus VNY3 có ứng dụng nghiên cứu lên men sữa chua” để kết hợp với chủng Lactobacillus bulgaricus VNY4 1.2 Nhiệm vụ Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp chủng Streptococcus thermophilus (VNY3) để đạt mật độ tế bào sau lên men cao nhất; Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học tiếp tiến hành tối ưu hóa q trình thu hồi sinh khối sau lên men để đạt tỷ lệ tế bào sống cao 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu công nghệ lên men tăng sinh khối: khảo sát ảnh hưởng từ điều kiện môi trường, nhiệt độ, pH, thiết bị, tỷ lệ tiếp giống, thời gian… tác động đến khả lên men tăng sinh khối chủng Streptococcus thermophilus (VNY3) Từ đó, tối ưu hóa điều kiện lên men tăng sinh khối để đạt mật độ tế bào mức tối ưu Nghiên cứu công nghệ thu hồi sinh khối: sau kết thúc lên men, chủng VNY3 ly tâm rửa, lượng sinh khối đưa vào mơi trường bảo quản thích hợp nhằm đạt tỷ lệ sống cao trước tiến hành sấy chế phẩm 1.4 Nội dung nghiên cứu Xácđịnh thời gian sinh trưởng chủng VNY3 Ảnh hưởng thơng khí Ảnh hưởng pH môi trường Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống Ảnh hưởng môi trường lên men Ảnh hưởng nhiệt độ lên men Nghiên cứu động học trình lên men VNY3 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tạo chế phẩm VNY3 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học PHẦN 2:TỔNG QUAN 2.1.Vi khuẩn lactic 2.1.1 Tổng quan chung vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae, có dạng hình cầu hình que, Gram dương, khơng bào tử, không di động Vi khuẩn lactic không khử nitrate, phản ứng catalase âm tính, kị khí tuỳ ý, vài lồi kị khí sống hệ tiêu hố người Đặc điểm hình thái: khuẩn lạc trịn, đơi có ria xung quanh, thường có màu trắng vàng kem, số chủng có màu trong, khuẩn lạc lồi.Đặc biệt khuẩn lạc tỏa mùi chua acid.Vi khuẩn lactic vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp Để sinh trưởng bình thường, ngồi nguồn cacbon, chúng cần nitơ, phần dạng amino acid, số vitamin, chất sinh trưởng, chất khống… Chúng khơng thể phát triển mơi trường có thành phần đơn giản glucose NH4+ số loài khác Các vi khuẩn lactic lên men đường monno disaccharide không lên men tinh bột polysaccharide khác, ngoại trừ L delbrueckii đồng hóa tinh bột.Vì người ta phải cho vào môi trường số chất giàu dinh dưỡng: cao nấm men, cao thịt, loại đường để chúng lên men.Vi khuẩn lactic lên men đồng hình dị hình Một số vi khuẩn lactic tồn mơi trường khơ, chịu hàm lượng cồn từ 10 – 15% chịu nồng độ CO2 cao Chúng tìm thấy khắp nơi tự nhiên, da, hệ tiêu hoá…[8] 2.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic sản xuất sữa chua Vi khuẩn lactic coi vi sinh vật an toàn ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực sản xuất bảo quản thực phẩm Trong sản xuất sữa chua, vi khuẩn lactic thường sử dụng hai loài ưa nhiệt Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học phải có tỷ lệ tiếp giống ng phù hợp h để tiết kiệm môi trường ng lên men, rút ngắn thờii gian lên men đảm bảo trình lên men đạt hiệuu qu Khảo sát tỉ lệ tiếp p gi giống từ 1% đến 10% môi trường ng MRS MRS-lactose 8ml, pH 7, nhiệt độ lên men 42˚C, 42 thời gian lên men 8h Log (mật độ tế bào CFU/ml) Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 8.95 8.9 8.85 8.8 8.75 8.7 8.65 8.6 8.55 Tỷ lệ 1% Tỷ lệ 2% Tỷ lệ 3% Tỷ lệ 4% Tỷ lệ 5% Tỷ lệ 6% Tỷ lệ 7% Tỷ lệ 8% Tỷ lệ 9% Tỷ lệ 10% Tỷ lệ tiếp giống (%) Hình 7: Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống Chủng ng VNY3 có thời th gian phát triển ban đầu rấtt nhanh, với v tỷ lệ tiếp giống ban đầu 4,85.106 CFU/ml tương ứng với tỷ lệ 1%,, sau 8h lên men mật độ tế bào đạt 8,0.10 10⁸ CFU/ml Tỷ lệ tiếp giống 3% % cho m mật độ tế bào lên men cao tương ứng ứ 8,38.10⁸ CFU/ml 8,25.10⁸ CFU/ml T Tăng mật độ tế bào tiếp giống ống ban đầu mật độ tế bào sau lên men có xu hhướng giảm thấp so với ới tiếp tiế giống 3% Do đó, chọn tỷ lệ tiếpp giống 2% cho thí nghiệm 4.5 Ảnh hưởng hàm àm lượng l lactose Theo kết kiểểm tra khả sử dụng nguồnn cacbon bbằng kit API CH50 chủng ng VNY3 ch sử dụng loại đường ng glucose lactose S thermophilus lên men mơi tr trường có lactose tốt hơnn so với v glucose hệ thống vận chuyểnn đường đư disacharide (lactose) loài tốốt 30 Hơn việcc lên men chủng ch VNY3 môi trường ng ch chưa glucose thờii gian dài th gây tượng đột biến, n, không ssử dụng lactose để đông tụ sữa a Do đó, nghiên cứu này, sử dụng ng lactose để khảo sát Nghiên cứu ảnh nh hưởng hư hàm lượng đường lactose môi tr trường: 5g/l, 10g/l, 15g/l, 20g/l, 25g/l, 30g/l, 40g/l Ảnh nh hưởng hưở hàm lượng đường lactose Log (mật độ tế bào CFU/ml) 8.8 8.6 8.4 8.2 7.8 5g/l 10g/l 15g/l 20g/l 25g/l 30g/l 40g/l Hàm lượng đường lactose (g/l) Hình 8: Ảnh Ả hưởng hàm lượng đường lactose Mật độ tế bào tăng tă nhanh tăng dần hàm lượng ng đư đường từ 5g/l (1,63.10⁸CFU/ml) đến ến 20 g/l (8,75.10⁸ (8,75 CFU/ml), tăng gấp ấp llần Từ hàm lượng đường 20 g/l đến 40 g/l mật độ tế bào có xu hướng ng giả giảm dần (giảm thấp so vớii lactose 20g/l) Do đó, hàm lượng đường ng lactose 20 g/l mơi trường thích hợp ợp nh cho chủng VNY3 4.6 Ảnh hưởng nguồn ngu đạm 4.6.1 Lựa chọn nguồn ồn đạm đạ Mỗi chủng ng vi khu khuẩn khác có nhu cầuu khác vvề nguồn đạm m Chính vvậy, dựa mơi trường MRS-lactose lactose đđể chọn nguồn đạm thích hợp cho chủng ng VNY3phát triển Nguồn đạm khảoo sát bao gồm: sữa gầy, peptone, cao nấm m men men, hỗn hợp peptone cao nấm m men (cùng hàm 31 lượng protein môi tr trường 9g/l) Điều kiệnn lên men: 420C, thời gian lên men 8h, tỷ lệ tiếpp gi giống 2% Log (mật độ tế bào CFU/ml) Ảnh hưởng nguồn đạm 8.5 7.5 6.5 Peptone cao nấm men sữa gầy đối chứng Nguồn đạm Hình 9: Ảnh hưởng h nguôn đạm đến mật độ tế bào Quan sát đồ thị th cho thấy, hàm lượng ng protein môi trường đượcc thay th hoàn toàn nguồnn khác nh như: peptone, cao nấm men, sữa gầyy hỗn h hợp cao nấm men + peptone Chủủng VNY3 lên men rấtt mơi tr trường có thành phần peptone sữaa ggầy, mật độ tế bào tương ứng ng 2,63 2,63.107 CFU/ml 1,39.10⁸ CFU/ml Ngư Ngược lại, chủng VNY3 lại lên men tốtt môi tr trường có thành phần đạm m cao nnấm men hỗn hợp cao nấm m men+peptone Mật M độ tế bào mơi trường ng có chứa ch cao nấm nem (3,9.10⁸ CFU/ml) CFU/ml gần mật độ tế bào mơi trư trường có chứa hỗn hợp cao nấm men peptone (4,53.10⁸ CFU/ml) Do đó, chọọn mơi trường có chứa hỗn hợp p cao nấ nấm men+peptone để lên men chủng ng VNY3 4.6.2 Ảnh hưởng hàm àm lượng l đạm Sau lựa chọn n đư nguồn đạm hỗn hợpp peptone cao nnấm nem, tiếp tục khảo sát tỷ lệ đạm mơi trường mơi trường ng có nồng n độ đạm hợp lý, nồng độ đạm đ không q thấp khơng đáp ứng đủ nhu cầu nguồn đạạm cho chúng sử dụng, ngược lại nguồnn đạm đ nhiều gây nên ức chế phát triển tri 32 Khảo sát mẫẫu lên men có tỷ lệ peptone/cao nấm m men khác như:: 5g/l peptone + 10g/l cao nấm n m men; 5g/l peptone + 15g/l cao nnấm men; 10g/l peptone + 10g/l cao nnấm m men; 10g/l peptone + 15g/l cao nnấm men; 10 g/l peptone + 20g/l cao nấm n m men; 15g/l peptone + 15g/l cao nnấm men; peptone ptone 15g/l + 20g/l cao nấm n men để chọn lựa tỷ lệ peptone +cao nnấm men phù hợp Log (mật độ tế bào CFU/ml) Ảnh hưởng hàm lượng đạm 9.05 9.00 8.95 8.90 8.85 8.80 8.75 Peptone Peptone Peptone Peptone Peptone Peptone Peptone 5:CNM 5:CNM 10:CNM 10:CNM 10:CNM 15:CNM 15:CNM 10 20 15 10 15 20 15 Hàm lượng đạm Hình 10: Ảnh hưởng hàm lượng đạm Quan sát hình 10 thấy mật độ tế bào cao nhấtt hàm lượng đạm peptone 10g/l g/l + cao nấm men 10g/l có mật độ tế bào 1,02.10 1,02.10⁹ CFU/ml Ngoài ra, mật độ tế bào giảm gi dần tăng hàm lượng cao nấm m men mơi trường Điển hàm lượng l peptone 5g/l + cao nấm m men 10 10g/l peptone 5g/l + cao nấm m men 15g/l 15 có mật độ tế bào tương ứng ng 8,65 8,65.10⁸ CFU/ml và8,19.10⁸ CFU/ml 4.7 Lựa chọn nhiệt ệt độ lên men Nhiệt độ mộtt nh yếu tố quan trọng ảnh hưở ởng tởi sinh trưởng phát triển củaa vi sinh vvật Vì chủng S thermophilus VNY3 ch chủng ưa nhiệt nên tiến hành khảo kh sát nhiệt độ lên men củaa VNY3 ttại nhiệt độ: 35oC; 37oC;40oC;42oC;45oC 33 Log (mật độ tế bào CFU/ml) Ảnh hưởng h nhiệt độ lên men 9.1 9.05 8.95 8.9 8.85 8.8 8.75 35oC 37oC 40oC 42oC 45oC Nhiệt độ (oC) Hình 11: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men Theo kết thí nghiệm, nghi mật độ tế bào chủng ng VNY3 cao nh nhiệt độ lên men 37 37˚C, đạt 1,24.10⁹ CFU/ml Ở 35˚C ˚C m mật độ đạt 9,65.10⁸ CFU/ml Và ccũng thấy rằng, tăng nhiệt độ từ 37˚C C đến 45˚C mật độ tế bào giảm dầnn từ t 1,24.10⁹ CFU/ml xuống 7,65.10⁸⁸ CFU/ml Kết thể nhiệt nhi độ tăng dần tăng trưởng củaa vi sinh vật v tăng theo đến nhiệtt độ đ định tất dừng lại giảm m ddần Như vậy, nhiệt độ thích hợp nhấất chủng VNY3 37oC, để khảo sát động học lên men chủng ng VNY3 trình lên men sữa s tạại 42oC lựa chọn nhiệt độ để khảo o sát 42oC để gần vớii trình lên men ssữa 4.8 Động học trình ình lên men Sau khảo o sát đư yếu tố ảnh hưởng đến VNY3, tiếnn hành động học trình lên men chủ ủng nhằm xác định lại thờii gian lên men ttốt để thu lượng sinh khối tốii đa đ Trong trình động học, kiểm tra khả phát triển mật độ tế bào theo th thời gian, theo dõi biến đổi củaa pH, thay đổi hàm lượng đường tổng đạm m tổng t Thực khảo sát động họcc lên men VNY3 ttại 42oC, thời gian từ 0-24h 24h Trong khoảng thời gian đầu 1h lấyy m mẫu lần, sau 2h lấy mẫu mộtt lần l 34 Mật độ tế bào tăng nhanh từ 0h đến 7h, sau 7h lên men mật độ tế bào tăng từ 1.10⁷CFU/ml đến 9,7.10⁸ CFU/ml (tăng 10 lần so với 0h) Đến thời điểm 8h mật độ tế bào đạt 1,33.10⁹ CFU/ml, mật độ tế bào trì mức ổn định khoảng thời gian từ 8h đến 14h, sau thời gian mật độ tế bào có xu hướng giảm dần đến 24h Dong hoc len men VNY3 30 10 16 10 9 20 15 10 hàm luong duong tong (g/l) 10 25 pH 12 Log (mat te bao CFU/ml) Hàm luong protein (g/l) 14 5 10 15 20 25 30 Thoi gian (h) Log (mat te bao CFU/ml) pH Ham luong duong tong (g/l) ham luong protein (g/l) Hình 12: động học trình lên men Sự tăng sinh số lượng tế bào nghịch đảo với giá trị pH, thời gian từ 0h đến 2h pH môi trường giảm chậm từ 6,81 xuống 6,76.Từ 2h đến 7h pH môi trường giảm mạnh xuống 4,65 sau 7h lên men Khi giá trị pH có giảm với giá trị không đáng kể thời điểm 16h sau lên men giá trị pH khơng thay đổi Chọn thời gian lên men tăng sinh khối VNY3 thời gian từ 8h đến 14h – khoảng thời gian lên men cho mật độ tế bào cao 35 4.9 Thu hồi sinh khối ối 4.9.1 Ảnh hưởng chất bảo vệ màng tế bào đến trình ình thu h hồi Sau kếtt thúc lên men 16h ttại 42oC, dịch lên men sẽẽ ly tâm, phần sinh khốii lên men ssẽ bảo quản chất bảoo vvệ tế bào khác (8 dung dịch) ch) Thí nghi nghiệm thực nhiệt độ 30oC, đánh giá ttỷ lệ tế bào sống thời điểm m phút, 60 phút 120 phút phút Khảoo sát ch chất bảo vệ khác như:: Glycerol 3%, Sucrose 3%, Trehalose 3%, Sodium glutamate 3%, Sobitol 3%, Mannitol 3%, chất ch bảo vệ đượcc pha dung dịch d đệm m photphat 0,01M pH 7,0 Ngồi cịn có nước n cấtt NaCl 0,85% (đối ( chứng) Sau 60 phút: so vvới thời điểm phút, tỉ lệ sốngcủa tế bào bảo vệ số chất bảoo vệ v không bị suy giảm, số bị giảm nhẹ, riêng tỉ lệ sốngcủa tế bào bảo vệ nước bị giảm mạạnh xuống 11,8% Sau 120 phút:tỉ lệệ sốngcủa tế bào bảo vệ mannitol 3% cao (từ 60 phút trở ttỉ lệ sốngcủa tế bào bị giảm nhẹẹ giữ nguyên 96,9%) tỉ t lệ sốngcủa tế bàođược bảo vệ ch chất bảo vệ khác bị giảm xuống ng từ t 0,7% đến 50,4% Tỉ lệ sống sót (%) Ảnh hưở ưởng chất bảo vệ tế bào đến VNY3 100 80 60 40 20 Chất bảo vệ tế bào phút 60 phút 120 phút Hình 13: Ảnh Ả hưởng thời gian đến mật độ tế bào 36 Kết thúc thí nghiệm, thấy chất bảo vệ mannitol 3%, sorbitol 3%, sodium glutamate 3% chất bảo vệ tế bào thích hợp với chủng VNY3 4.9.2 Ảnh hưởng trình sốc nhiệt Sau lựa chọn số chất bảo vệ tế bào thích hợp với chủng VNY3, tiến hành làm thí nghiệm sốc nhiệt để lựa chọn chất bảo vệ tốt cho chủng VNY3 Sinh khối VNY3 sau ly tâm rửa bổ sung vào dung dịch chất bảo vệ khác Thực sốc nhiệt (-30oC); (-20oC);4oC qua đêm 4oC; 30oC;42oC;50oC 1h Các chất bảo vệ tế bào như: Mannitol 3%, Mannitol 3% + glycerol 0,3%,Sorbitol 3%,Sorbitol 3% +glycerol 0,3%, Sodium glutamate 3%, Sodium glutamate 3% + glycerol 0,3%, NaCl 0,85%; dung dịch pha đệm photphat 0,01M pH 7,0 Ở 4˚C 30˚C có tỉ lệ tế bào sống cao so với nhiệt độ khác, NaCl 0,85% 30˚C có tỉ lệ sống lên đến 95,3% Ở 50˚C, mật độ tế bào giảm nhiều, tỉ lệ sống sót thấp sodium glutamate 3%+glycerol 0,3% 0,3% tỉ lệ sống sót cao nhiệt độ 15,3% (mannitol 3%) Ở -20˚C -30˚C, mẫu cất 13h cịn vài phần trăm sống sót Từ đó, thấy tỉ lệ tế bào sống giảm theo hướng: 30˚C, 4˚C, 42˚C, 4˚C-13h, 50˚C, -20˚C-13h, -30˚C-13h 37 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học Ảnh hưở ưởng trình sốc nhiệt đến n VNY3 100 90 tỉ lệ sống sót (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 Mannitol 3% Mannitol 3%+ glycerol 0.3% Sorbitol 3% Sorbitol 3%+ glycerol 0.3% Sodium glutamate 3% NaCl Sodium 0.85% glutamate đệm 3%+ pp glycerol 0.3% chất bảo vệ 4oC 30oC 42oC 50oC 4oC-13h (-20oC)-13h (-30oC)-13h 13h Hình 14: Ảnh hưởng h trình sốc nhiệt đến n VNY3 Như thấy rằng, dung dịch bảo vệ sorbitol 3% glycerol 0,3% có tỷ lệ tế bào sống (-30oC); (-20oC);4oC qua đêm cao nên chọnn dung dịch d làm dung dịch bảo vệ sấyy đđông khô chế phẩm m VNY3 Dung ddịch ch Mannitol 3%, Mannitol 3% glycerol 0,3% vàSorbitol 3% có tỷ lệ tế bào sống 50oC cao nên có thểể chọn lựa dung dịch bảo vệ sấy s chế phẩm 50oC 4.9.3 Ảnh hưởng sốc thẩm thấu Sinh khốii VNY3 sau ly tâm rửa r bổ sung vào dung ddịch chất bảo vệ khác nh Glycerol 40%, Glycerol 85%, NaCl 0,85% (đối ( chứng), để đánh ánh giá s ảnh hưởng sốc thẩm thấu đếnn tế t bào VNY3 (glycerol 40% NaCl 0,85% hòa tan dung dịch ch đệm đ photphat 0,01M pH 7,0; Glycerol lycerol 85% hòa tan đệm m photphat 0,01M pH 38 6,8) Thực sốc thẩẩm thấu 4oC; 30oC;42oC;50oC 1h, đánh giá tỷ lệ tế bào sống Ở 4˚C có tỉ lệ sốống sót cao ba chất bảoo vvệ tế bào, tỉ lệ sống sót giảm dần n theo ssự tăng nhiệt độ Điển NaCl 0,85%, 4˚C tỉ lệ sống ng sót 53,38%, 30˚C 52,06%, 42˚C giảm m 8,82%, 50˚C 0,88% Ảnh nh hưởng hưở sốc thẩm thấu đến VNY3 Tỷ lệ sống sót (%) 100 80 60 40 20 4oC 30oC 42oC 50oC Nhiệt độ (oC) NaCl 0.85% pH 6.5 Glycerol 40% đệm pp 0.01M pH Glycerol 85% đệm pp 0.01M pH 6.8 Hình 15:: Ảnh hưởng sốc thẩm thấu đến n VNY3 Quan sát hình 15 thấy th rằng: tỉ lệ sống sót chấtt bbảo vệ tế bào glycerol 85% đệệm photphat pH 6,8 cao Ở 4˚C ˚C vvà 30˚C: tỉ lệ sống sót đạt 100%, 42˚Cvà 50˚C tỉ lệ sống sót tương ứng ng 63,53% 61,76% Như chứng ng ttỏ chủng VNY3 có khả chịu sốcc th thẩm thấu tốt nên ứng dụng ng sấy s chế phẩm nhanh 39 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Thời gian lên men 7h-9h thời gian lên men giống trẻ, mật độ tế bào cao đạt 5,04.108 CFU/ml - Ống nghiệm nút xốylà dụng cụ lên men tích mơi trường chiếm 60% thể tíchdụng cụ cho kết mật độ tế bào cao (6,55.108 CFU/ml) - PH môi trường lên men tốt cho VNY3 pH 7,0 - Tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho VNY3 8,7.106 CFU/ml (tỷ lệ 2%) - Chọn hàm lượng đường lactose 20g/l để thực lên men - Chọn nguồn đạm hỗn hợp peptone cao nấm men với hàm lượng peptone 10g/l cao nấm men 10g/l - Nhiệt độ lên men tốt 37oC, nhiên chọn nhiệt độ thực động học lên men 42oC - Thời gian lên men tốt VNY3 từ 7h đến 11h/42oC - Chất bảo vệ tế bào thích hợp cho q trình đơng khơ chế phẩm VNY3 dung dịch sorbitol 3% + glycerol 0,3%; chất bảo vệ thích hợp cho q trình sấy chế phẩm VNY3 50oC dung dịch Mannitol 3%, Mannitol 3% + glycerol 0,3% vàSorbitol 3% - Chủng VNY3 có khả chịu sốc thẩm thấu tốt nên thích hợp với điều kiện sấy chế phẩm nhanh 5.2 Kiến nghị Sau tối ưu điều kiện lên men lựa chọn được phương pháp sấy chế phẩm Cần nghiên cứu điều kiện sấy để tạo chế phẩm VNY3 có tỷ lệ tế bào sống cao 40 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt Đỗ Quốc Cường (2009), ”Nâng cao chất lượng sữa chua phương pháp vi gói vi khuẩn lactic” Đồ án tốt nghiệp đại học – Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ T.p HCM Công ty nghiên cứu thị trườngNielsen (2012 Việt Dũng Hoài Nhân, “Sữa chua đua giành vị số 2” theo Brandsvietnam http://lambachdt1987.blogspot.com/2010/10/vi-khuan-lactic.html http://z11.invisionfree.com/Biotechnology/ar/t128.htm PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn (2013), ”Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic” Nguyễn Thanh Ngân cộng (2011), “Lên men sữa chua” Đại Học Quốc Gia T.p HCM – Trường Đại Học Bách Khoa Lương Đức Phẩm(2002) “ vi sinh vật bảo quản thực phẩm” NXB Nông nghiệp Hà Nội.) Minh Trí, “Thị trường sữa chua nhiều tiềm năng” theo Vnexpress Tài Liệu Tiếng Anh 10 Alexander B,& etc (2004) Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus Nature biotechnology Volume 22, number 12, december 2004, 15541558 11 Berg RD (1996) The indigenous gastrointestinal microflora Trends Microbiol 1996; 4:430–435 12 Dr Edward Group DC, NP, DACBN, DCBCN, DABFM (2015).Published on September 6, 2015, Last Updated on October 5, 2015 41 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học 13 Encyclopædia Britannica, "Streptococcus." Encyclopædia Britannica Online 13 April 2011 14 Euromonitor (2013),”Global yoghurt consumption per capita and per year”, The Nutri Journal 15 Fernandez-Espla, Maria Dolores and Rul, Franỗoise (1999) "PepS from Streptococcus thermophilus: A new member of the aminopeptidase T family of thermophilic bacteria." Eur J Biochem 263, 502 – 510 FEBS 1999 16 Foucaud, C and Poolman, B (1992) "Lactose transport system of Streptococcus thermophilus Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport." J Biol Chem., Vol 267, Issue 31, 22087-22094, 11, 1992 17 Francesca Stingele, John W Newell, and Jean-Richard Neeser (1999) "Unraveling the Function of Glycosyltransferases in Streptococcus thermophilus Sfi6." J Bacteriol 1999 October; 181(20): 6354–6360 18 Geertsma, Duurkens, Poolman "The Lactose Transport from Streptococcus thermophilus is Activated by Phosphorylated IIA." EU-FP6, E-Mep; 504601 19 Hickson M, D'Souza AL, Muthu N et al (2007) Use of probiotic Lactobacillus preparation to prevent diarrhoea associated with antibiotics: randomised double blind placebo controlled trial, BMJ 2007; 335:80 20 Jump up "Validation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB: List No 54" International Journal of Systematic Bacteriology 45 (3): 619– 620 July 1995 doi:10.1099/00207713-45-3-619 21 Jump up "Thermophile." Encyclopædia Britannica Encyclopædia Britannica Online Encyclopædia Britannica, 2011 Web 24 Apr 2011 42 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học 22 Marzio L, Cinque B, Cifone M (1999) Effect of the lactic acid bacterium Streptococcus thermophiles on ceramide levels in human keratinocytes invitro and stratum corneum in vivo, The journal of investigative dermatology 1999; 113 23 Marzio L, Centi C, Cinque B, Masci S, Giulani M, Arciery A, Zicari L, De Simone C, Cifone M Effect of the lactic bacterium 24 McSweeney, P L H., and Sousa, M J (2000) Biochemical pathways for theproduction of flavour compounds in cheeses during ripening: A review Lait80: 293–324 25 Nopchinda, S et al (2002) “Effect of Bifidobacterium Bb12 with or without Streptococcus thermophilusSupplemented Formula on Nutritional Status.” J Medical Association of Thailand 2002; 85:12251231 26 Saavedra JM, Bauman NA, Perman JA, Yolken RH, Oung I (1994) Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilusto infants in hospital for prevention of diarrhoea and shedding of rotavirus The Lancet 1994; 344:1046-49 27 Stackebrandt E, & Teuber M, (1988) Molecular taxonomy and phylogenic position of lactic acid bacteria Biochimie 70, 317–324 28 Tannock, Gerald W, &etc (2005) Probiotics And Prebiotics: Scientific Aspects Caister Academic Press p 43 ISBN 1-904455-01-8 Retrieved 2014-03-31 29 Thomas, T D 1985 “Roleoflactic acid bacteria and their improvement for production of better fermented animal products” N Z J Dairy Sci Technol 20:1 30 Rodriguez C, Medici M, Mozzi F, Font de Valdez G (2010) Therapeutic effect of Streptococcus thermophilusCRL 1190- fermented milk on chronic gastritis World J Gastroenterol 2010; 16(13):1622−1630 43 Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học 31 Virtanen T., Pihlanto A., Akkanen S and Korhonen H (2007),” Development of antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteria”, Journal of Applied Microbiology, 102(1), pp 106 - 115 32 Wang Y, Reifer C, Miller L (2010) Efficacy of vaginal probiotic capsules for recurrent bacterial vaginosis: a double-blind, randomized, placebo-controlled study Amer J Obst/Gyn 2010; 120.1-120.6 33 Whitford EJ, Cummins AG, Butler RN, Prisciandaro LD, Fauser JK, Yazbeck R, Lawrence A, Cheah KY, Wright TH, Lymn KA, Howarth GS (2009) Effects of Streptococcus thermophilusTH-4 on Intestinal Mucositis Induced by the Chemotherapeutic Agent, 5- Fluorouracil (5FU) National Center for Biotechnology Information 2009 34 Zelenaia OA, Patel BG, Dheer RS, Ranganathan BSN (2004) Streptococcus thermophilus KB19 is a Potential Component of a Probiotic Regimen Applicable in Enteric Dialysis for Uremia J American Society of Nephrology 2004; 765 35 44 http://downtoearth.danone.com/2013/01/31/a-brief-history-of-yogurt/ Tạ Thị Thu Huyền, Lớp 12.01-K19, khoa Công nghệ sinh học