Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối và thu hổi chủng lactococcus lactis subsp lactis vnc1 có ứng dung lên men phomat

Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Lời cảm ơn Thời gian thực tập thời gian quan trọng em trước tốt nghiệp trường Thơng qua q trình em tiếp xúc với kiến thức học, vận dụng kiến thức cách linh hoạt, sáng tạo thực tế Hơn qua thời gian em tiếp xúc với môi trường làm việc động, rèn luyện tác phong làm việc học nhiều học quý báu Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn La Anh- Chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Cơng nghiệp Thực phẩm, người tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện giúp em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, cán - Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm giúp đỡ em hồn thành tốt cơng việc Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Công nghệ sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ chúng em suốt năm học qua Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè người ln động viên, khích lệ em đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2016 Sinh viên Vũ Thị Thu Hường [Type text]  Page i  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường MỤC LỤC Mở đầu .1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic sản xuất phomat 1.1.1 Phomat 1.1.2 Vai trò vi khuẩn lactic sản xuất phomat 1.2 Giống khởi động cho sản xuất phomat 10 1.1.3 Lactococcus lactis subsp lactis ứng dụng sản xuất phomat 12 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men tăng sinh khối 13 1.3.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường 13 1.3.2 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng 14 1.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng 14 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới tạo chế phẩm 15 1.4.1 Môi trường sấy 16 1.4.2 Điều kiện sấy 17 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Hóa chất thiết bị 20 2.1.1 Chủng giống 20 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 20 2.1.4 Môi trường 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp vi sinh 21 2.2.2 Xác định mật độ tế bào 22 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 24 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 25 [Type text]  Page ii  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 27 3.1.1 Lựa chọn thành phần đường môi trường phù hợp cho lên men tăng sinh khối 27 3.1.2 Lựa chọn thành phầm đạm môi trường phù hợp lên men tăng sinh khối 29 3.1.3 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống 30 3.1.4 Ảnh hưởng pH môi trường 31 3.1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường 32 3.2 Động học trình lên men chủng Lactococcus lactis subsp lactis VNC1 33 3.3 Nghiên cứu lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào 35 3.3.1 Lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào chủng VNC1 35 3.3.2 Ảnh hưởng sốc nhiệt đến chủng VNC1 36 3.3.3 Ảnh hưởng sốc thẩm thấu đến tế bào chủng VNC1 37 KẾT LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 [Type text]  Page iii  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Những từ viết tắt STT Ký hiệu Chữ viết tắt BSA Bovine serium albumin OD Optical Density (mật độ quang) MRS CFU [Type text]  de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB) Colony Forming Unit Page iv  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Danh mục bảng biểu Bảng 1: Phân loại mát theo độ ẩm Bảng 2: Mô tả vị ngưỡng giá trị vị số axit amin phomat Cheddar (ủ chín tháng) 10 Bảng 3: Các giống khởi động số loại phomat 11 [Type text]  Page v  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Danh mục hình ảnh Hình 1: Sơ đồ sản xuất mát Cheddar (a) Emmental (b) Hình 2: Các đường lên men hexose (glucose) vi khuẩn lactic Hình 3: Các đường chuyển hóa lactate giai đoạn ủ chín mát Hình Một số chế phẩm giổng khởi động phomat sử dụng chủng ưa ấm 13 Hình 5: Ảnh hưởng nguồn đường đến chủng VNC1 27 Hình 6: Ảnh hưởng hàm lượng lactose đến chủng VNC1 28 Hình 7: Ảnh hưởng nguồn đạm đến chủng VNC1 29 Hình 8: Ảnh hưởng tỉ lệ đạm đến chủng VNC1 30 Hình 9: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới chủng VNC1 31 Hình 10: Ảnh hưởng pH tới chủng VNC1 32 Hình 11: Ảnh hưởng nhiệt độ tới chủng VNC1 33 Hình 12: Quá trình động học 24h 34 Hình 13: Ảnh hưởng chất bảo quản đến chủng VNC1 35 Hình 14: Ảnh hưởng chất bảo quản đến chủng VNC1 36 Hình 15: Ảnh hưởng sốc thẩm thấu đến tế bào chủng VNC1 37 [Type text]  Page vi  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Phomat thực phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy đủ axit amin không thay thế, chứa nhiều vitamin như: vitamin A, riboflavin, vitamin B, vitamin D Phomat mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như: bảo vệ răng, chống loãng xương, ngăn ngừa ung thư Hiện nước ta, công ty chế biến sữa trang trại sữa có nhu cầu chế biến sữa thành sản phẩm khác nhau, bao gồm phomat nhằm chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu sữa tươi sản xuất Nhu cầu sử dụng phomat tăng qua năm giống khởi động cho sản xuất phomat hoàn toàn nhập Do đó, việc nghiên cứu sản xuất giống khởi động cho lên men phomat nhằm chủ động nguồn giống tạo sản phẩm phù hợp với thị hiếu người Việt Nam cần thiết ChủngLactococcus lactis subsp lactis VNC1 chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu, tuyển chọn đặc tính cần thiết giống khởi động cho lên men phomat Tuy nhiên, hướng nghiên cứu công nghệ sản xuất giống khởi động chưa tiến hành nhiều Do đó, em thực đề tài: “Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Lactococcus lactis subsp lactis VNC1 có ứng dụng lên men phomat” [Type text]  Page 1  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu hóa điều kiện lên men chất vệtế bào thích hợp để thu lượng tế bào khả dụng chủng Lactococcus lactis subsp lactis VNC1 cao nhất, tạo giống khởi động cho sản xuất phomat Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu điều kiện thích hợp để lên men chủng Lactococcus lactis subsp lactis VNC1 nhằm thu nhận sinh khối cao: xác định thời gian, môi trường, nhiệt độ, pH tỷ lệ tiếp giống thích hợp để lên men thu sinh khối - Nghiên cứu phương pháp bảo vệ tế bào chủng Lactococcus lactis subsp lactis VNC1 [Type text]  Page 2  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic sản xuất phomat 1.1.1 Phomat Phomat (hay phơ mai) tên gọi chung nhóm sản phẩm từ sữa, sản xuất toàn giới với đủ hương vị, màu sắc, độ mềm cứng khác Hiện nay, có 1000 loại mát, làm từ nhiều nguồn khác sữa bò, cừu, dê , chủ yếu từ sữa bị Phomat thực phẩm có nguồn gốc lâu đời, cho bắt nguồn từ khu vực nằm hai sông Tigris Euphrates, Iraq, cách khoảng 8000 năm [8, 13] Phomatđược làmbằng cách đông tụ sữa nguyên liệu từ sữa như: sữa tách béo,sữa gầy, whey cream,cream, nhờ hoạt động enzym rennet, pepsin, chymosin tác nhân đông tụ thích hợp khác làm tách phần nước khỏi quện sữa đơng Phomat phân loại theo nhiều cách khác nhau: tác nhân đông tụ casein, độ ẩm, loại vi sinh vật tham gia vào trình ủ chín hay dựa vào cấu trúc mát Phân loại theo độ ẩm, phomat chia loại sau: [Type text]  Page 3  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Bảng 1: Phân loại phomat theo độ ẩm [16] Loại mát Độ ẩm, % Sản phẩm Phomat tươi, khơng ủ chín: Cottage, Phomat mềm 55- 80 Ricotta, Quarg, Mozzarella Phomat ủ chín bề mặt nấm mốc: Brie, Camembert Phomat bán rắn 41 - 55 Phomat có q trình ủ chín: Limburger, Gorgonzola, Roquefort Phomat ủ chín có cấu trúc mắt: Emmental Phomat rắn 20 - 40 Phomat ủ chín khơng có cấu trúc mắt: Cheddar, Cheshire Sản xuất phomat thực chất trình loại nước khỏi sữa, casein chất béo sữa cô đặc từ – 12 lần tùy loại phomat Quy trình sản xuất phomat gồm khâu chính: đơng tụ sữa, loại nước khỏi quện sữa (cắt quện sữa, nấu, khuấy, ép), tạo hình (nghiền, đổ khn, ép) muối Quy trình sản xuất tóm tắt sau [3, 4, 13] - Tiêu chuẩn hóa: Phomat làm từ sữa, sữa tách béo tách phần chất béo Trước đưa vào sản xuất sữa tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu ổn định để tạo sản phẩm phomat có chất lượng đồng - Thanh trùng: Thanh trùng nhằm tiêu diệt hệ vi sinh vật có mặt sữa Tuy nhiên, trùng làm giảm hàm lượng canxi sữa làm giảm khả đông tụ sữa enzym Để khắc phục nhược điểm này, nhà sản xuất thường bổ sung thêm muối calcium chloride Chế độ trùng phổ biến 72 – 76oC, 15 – 20 giây - Đông tụ sữa: Q trình đơng tụ casin thực tác nhân đông tụ enzym giống khởi động Một số loại phomat, trình diễn nhờ kết hợp hai tác nhân Giống khởi động cho loại phomat thường [Type text]  Page 4  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường PH HẦN 3: KẾT K QUẢ Ả VÀ THẢ ẢO LUẬN N Trongg công nghhệ sản xuấất giống kh hởi động, trongg yếu y tố ảnhh hư ưởng lớn tới t giá thàành sản phhẩm mậật độ tế bàoo vi sinh vvật chế c phẩm Đ tăng số lượng tế bào, nhà sản xuất thường Để t ngghiên cứu tác độ ộng giaii đooạn lên men m Do đóó, nghiên cứu điều đ kiện môi trư ường lên men như: ngguồn cacbbon, nguồnn đạm, pH H môi trườ ờng… cần tiếnn hành 3.1 Cáác yếu tố ảnh hưởn ng đến qu uá trình lêên men 3.1.1 Lựa L chọn n thành ph hần đườn ng môi m trườn ng phù hợ ợp cho lên m tăng sinh men s khối 3.1.1.11 Lựa chọọn nguồn đường Mỗi m chủngg vi khuẩnn khác nh hau cóó nhu cầu khácc ngguồn đườ ờng, nguồnn đạm Dựa D kết k kếế thừa khả g sử dụng ngguồn cacbbon, chủnng VNC11 sử dụng g tốt cácc loại đườ ờng sau: Lactose, M Maltose, G Glucose, G Galactose Do đó, tiiến hành đánh giá khả sử dụng củủa loại đường đ nàyy môi trường MRS M Ảnh hưởng nguồn n đường đến đ chủngg VNC1 Log (CFU/ml) 9.2 8.8 8.6 8.4 8.2 L Lactose Maltose Glucosee ồn đường Galacttose Nguồ Hình 5: Ảnh hưở ởng ng guồn đườnng đến chủủng VNC1 Type text]  [T Page 27 7  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường Kết quuả Hình cho thấyy chủ ủng VNC11 sinh trưở ởng tốt nh hất sử dụụng lactosse nguồồn cacbon,, sau lên men 30oC m mật độ đạt 1,15×109 C CFU/ml G Galactose k khơng phảải nguồ ồn đường thích hợpp cho ng VNC1 phhát triển, sau lên men mật độ c đạt 4,008×108 CF FU/ml Từ kết trrên, lựa chhọn lactosee để tiến hành h thí ng ghiệm tiếpp theo 3.1.1.22 Lựa chọọn hàm lư ượng đườn ng Sau khhi lựa chọn nguồn đường đ lactose, l tiếếp tục khảảo sát lựaa chhọn hàm lượng l lacttose thích hợp cho chủng c VN NC1 lên men Tiến hành h khảoo sáát phát triển chủng VN NC1 bổ b sung: 10; 15; 20; 25; 30 g/l g lactose K thểể hìình dướii Kết Ảnh h hưởng c hàm lượng lacctose đến sinh trrưởng a chủng VNC1 V Log (CFU/ml) 9.06 9.03 8.97 8.94 8.91 10 g/L 15 g/L 20 g/L 25 g/L 30 g/L Tỉ lệ đường H Hình 6: Ảnh Ả hưởngg hàm m lượng lacctose đến cchủng VN NC1 Kết quuả Hình cho thấấy, chủng g VNC1 lên men ttốt trrong môi trrường ứa 25g/L lactose, l vớ ới mật độ ộ tế bào saau 9h lên men đạt 1,12×109 C CFU/ml K tăng hààm lượng lactose lêên 30 g/L,, m Khi mật độ tế bào b dịịch lên men m tương t đươ ơng với bổ suung 10 – 15g/L (9,33x10 ( C CFU/ml) D đó, lựaa chọn mơơi trường có Do c hàm lư ượng đườnng 25 g//L để tiếp tụục tiến hànnh tối ưu hóa h nguồnn đạm Type text]  [T Page 28 8  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường 3.1.2 Lựa L chọn n thành ph hầm đạm môôi trường phù hợp lên men tăăng sinh khối k 3.1.2.11 Lựa chọọn nguồn đạm Nguồnn đạm khảảo sát bao gồm: Sữaa gầy, pepptone, cao nấm men n Kết thhể quua mật độ tế t bào tronng dịch lên n men Ảnh hưởng h a nguồn đạ ạm đến ự sinh trưở ởng chủng g VNC1 9.2 Log (CFU/ml) 8.8 8.6 8.4 8.2 Sữa Pepton Cao nấm men Đối chứn ng MRS Nguồn n đạm Hình 7: Ảnh hư ưởng nguồn n đạm m đến chủnng VNC1 Kết quuả Hình 7cho thhấy, với nguồn n đạm m peptonn cao nấm n men, m độ tế bào mật b chủng VNC1 saau lên men n tương đốối thấp, chhỉ đạt tươn ng ứng 2,,83×108 CFU/ml C vàà 7,17×108 CFU/ml Mơi trườnng đối ứng (MRS S) có ngguồn đạm m peptonn cao nấm men, n mậật độ tế bàoo chủng VNC1 V lêên men trêên môi trư ường 1,07×1 109 CFU/m ml thấấp so o với mơi trrường có nguồn n đạm m sữa gầy g (1,38×109 CFU U/ml) Dự ựa vào kếtt lự ựa chọn ngguồn đạm môii trường lêên men sữa gầy 3.1.2.22 Lựa chọọn nguồn hàm lượn ng đạm Sau khhi chọnn nguuồn đạm thích t hợp cho chủngg VNC1 phát p triển, tiến hành thí t nghiệm m lựa chọnn hàm lượ ợng thích hợp, nhằằm thu đư ược lượng Type text]  [T Page 29 9  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường siinh khối tốối đa Khảảo sát hàm m lượng sữ ữa gầy từ – 15g/L Kết thể t H Hình Ảnh hư ưởng hàm h lượng sữa gầy đến sin nh trưởng g chủ ủng VNC1 9.3 Log (CFU/ml) 9.25 9.2 9.15 9.1 9.05 g/L 5g 7g//L 9g/L 10g/L Hàm lượng l đạm 12g/L 15g/L Hình h 8: Ảnh hưởng h tỉ lệ đạm đến chủngg VNC1 Khi tăăng hàm lư ượng sữa gầy từ – 10g/L đ thúc đẩyy phát triển chhủng VNC C1 đạtt mật độ tế t bào cao o tronng dịch lêên men nồng độ 100g/L sữa gầy, đạt 11,87×109 CFU/ml C Ngược lạại, hàm m lượng đạm đ tăng lêên 12 g/L v 15 g/L lại trở thành yếu u tố bất lợ ợi cho chủnng VNC1, thể quua giảm m nhẹ mậtt độ tế bàoo dịcch lên menn, giảm xuuống cịn 1,65×109 C CFU/ml môi m trườnng chứa 155g/L sữa gầy g Hơn nữa, n việc bổ sung q nhiều sữ ữa gầy, cịịn ảnh hưở ởng tới chhi phí ngu un liệu Do đó, lự ựa chọn hààm lượng sữ ữa gầy tối ưu 10gg/L 3.1.3 Ảnh Ả hưởn ng tỷ lệ tiếp giố ống Lựa chọn c tỷ lệệ tiếp giốnng thích hợp h trrong nhữn ng yếu tốố quuyết định đến hiệu suất trình lên men m Lượ ợng giống q chúng sử dụụng khôngg hết lượnng dinh dư ưỡng tron ng môi trư ường nhưnng lượng giống g quáá lớ ớn xảy cạnh tranh t dinhh dưỡng, c hai trườ ờng hợp nnày ch ho kết quảả m độ tế bào mật b khôngg lớn Tiếnn hảnh kh hảo sát ảnhh hưởng ccủa tỷ lệ tiếp t giốngg Type text]  [T Page 30 0  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường tớ ới sinh trưởng chhủng VNC C1 tiếp p 2%, 4% %, 6%, 8% %, 10% Kếết thểể hiiện Hìnhh 9: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tới s sinh trư ưởng VN NC1 9.15 Log (CFU/ml) 9.10 9.05 9.00 8.95 8.90 8.85 2% 4% % 6% % 8% 10% Tỷ lệ tiếp giống, % Hình 9: Ảnh hưở ởng tỷ ỷ lệ tiếp giốống tới chhủng VNC C1 Kết quuả Hình khẳng địnnh rõ điều u đó, với tỷ t lệ tiếp ggiống 2% mật độ tếế bàào đạt đạt 9×108 CFU/ml, k tăng tỷ lệ tiếp giốống từ – 10%, thìì lạại làm giảảm mật độộ tế bào trrong dịch lên men từ 1,17×1109 CFU/m ml (ở 6% % giiống) xuốnng 9,83×1108 CFU/m ml (10% giống) g Mậật độ tế bàào chủng VNC1 V đạtt caao khhi tiếp 4% giống (1,37×109 CF FU/ml) Dựa vào v kết quảả thu đượcc, lựa chọn n tỷ lệ tiếpp giống 4% % để lên men m 3.1.4 Ảnh Ả hưởn ng pH H môi trư ường pH ảnnh hưởng r nhiều đến đ khả n sinh trưởng t củủa vi khuẩn n Mỗi vi siinh vật cóó khoảng pH p tối ưuu riêng, nếếu pH môôi trường ccao h thấp hơ ơn vi khuẩn k bị b kìm hãm m kh hơng phát triển Tronng thí ngh hiệm này, chhủng Lacttococcus lactis l subssp lactisV VNC1 đượ ợc lên menn dảải pH saau: 5,0; 5,5; 6,0; 6,55; 7,0; 7,5;; 8,0 Kết nhận sau: Type text]  [T Page 31 1  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường Log (CFU/ml) Ảnh hư ưởng pH đến ự sinh trưở ởng ch hủng VNC C1 9.20 9.00 8.80 8.60 8.40 8.20 8.00 7.80 7.60 pH 5,0 pH 5.5 pH 6,0 pH H 6.5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0 pH H Hình h 10: Ảnh hưởng củ pH tới chủng c VN NC1 Qua hình h 10thấy từ pH 5,0 đếến pH 6,5 mật độ tếế bào ng VNC1 tăăng dần từ 1,76×108CFU/ml đến đ 8,29× ×108 CFU//ml đạtt cao pH 7,0 (11,40×109 CFU/ml) C Nhưng khhi pH tăng g lên 7,5 v 8,0 m mật độ tế bào b dịịch lên meen lại giảm m dần, chỉỉ đạt tương g ứng là8,,98×108 C CFU/ml vàà7,63×108 C CFU/ml Từ kếtt trên,, lựa chọn pH 7,0 đểể tiến hànhh thí nghiệệm tiếp th heo 3.1.5 Ảnh Ả hưởn ng nhiệt độ đ môi trư ường Nhiệt độ mộtt nhữ ững yếu tố quan trọọng, ảnh hhưởng tới trình lêên men tănng sinh khối k Tiến hành khảảo sát khảả phhát triển củ chủng V VNC1 cáác dải nhiệệt độ: 25oC, C 28oC, 30oC, 32oC, C 35oC Type text]  [T Page 32 2  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường Ảnh hưở ởng nh hiệt độ tới sinh trrưởng a chủng VNC C1 9.2 Log (CFU/ml) 9.15 9.1 9.05 8.95 25oC 28oC C 30o oC 32 2oC 35oC Nh hiệt độ Hình 11: Ảnh hư ưởng nhiệt n độ tớ ới chủng V VNC1 Biểu đồ đ Hình 11 cho thấyy, dải d nhiệt độ từ 25 – 30oC, khii nhiệt độ tăăng, sinnh trưởng chủnng VNC1 tăngg theo, mậật độ tế bàào đạt tối đaa lên men m 30oC (đạt 1,48×109 CFU/ml) C T nhiênn, tăng Tuy g tới 32oC vàà 35oC, mật m độ tế bào trongg dịch lên n men lạii giảm đááng kể, xu uống cịn 1,,18×109 CFU/ml C D đó, lựaa chọn 30oC nhiệtt độ tối ưuu cho phát Do p triển củủa chủng VNC1 V 3.2 Độộng học q trình lên l men chủng c Lacctococcuss lactis sub bsp laactis VNC C1 Sau khhi tìm đượ ợc điều kiiện tối ưu u cho lêên men tăăng khối, tiến t hành khhảo sát độộng học q trình lên men ch hủng VNC C1 với điều kiệện tối ưu: H Hàm lượngg đường 25g/L lactoose; lượng g đạm 10gg/L sữa gầầy; pH mô ôi trường lêên men 7,00; tỷ lệ tiếếp giống 4%; nhiệt độ lên men m 30oC Khảo sát thời gian lêên men từ – 24h Ở thhời điểm tiến t hành lấy mẫu xxác định mật m độ tế bàào phương p phháp đếm khuẩn k lạc,, đo pH, xác x định llượng đườ ờng, đạm còòn lại tronng dịch lênn men Kết thể h Hìnnh 12 Type text]  [T Page 33 3  Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường Dong hoc qua trinh len men chung VNC1 14 9.5 12 9.0 30000 25000 20000 pH Log (CFU) Dam sot g/L 8.5 8.0 15000 10000 5000 7.5 Duong sot mg/L 10 7.0 6.5 10 15 20 25 30 Time (h) Log (CFU) pH Duong sot Dam sot Hình 12: Quá trình động học 24h Kết Hình 12 cho thấy, mật độ tế bào dịch lên men tăng 10 lần đầu từ 7,2x107 tới 7,28x108 CFU/ml Đây giai đoạn pH môi trường giảm nhanh từ 7,0 xuống 5,25 Ở giai đoạn – 10h, mật độ tế bào tăng chậm đạt tối đa thời điểm 10h với mật độ 2,07x109 CFU/ml Sau 10h lên men, pH giảm xuống 4,6 Đây giai đoạn lượng lactose sử dụng nhiều (8,77 g/L) Ở giai đoạn sau từ 11 – 24h giai đoạn ổn định, mật độ tế bào có giảm, dao động giá trị 1,65x109 CFU/ml Lượng lactose sử dụng giai đoạn 4,81g/L Kết thúc trình động học, lựa chọn 10h thời gian lên men để thu lượng sinh khối chủng VNC1 tối đa [Type text]  Page 34  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường 3.3 Ngghiên cứu u lựa chọn n chất bảo o vệ màngg tế bào Sau k nghhiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu cho chủngg V VNC1, cácc nghiên cứu c tiếp thheo: lựa ch họn chất bảo b vệ mààng tế bào o, phươngg phháp tạo chhế phẩm, cần tiến hành h để tạo raa sản phẩm m giống khởi k độngg cóó mật độ tế t bào sống cao nhấtt 3.3.1 Lựa L chọn chất bảo vệ màng tế bào chủ ủng VNC C1 Một trrong nhữnng nguyên nhân gây y chết tế bàào hư hỏng xảảy trongg m màng tế bàoo vi khuẩnn Do đó, chọn lựa chất c bảo vệ v màng tếế bào cầần thiết đểể tăăng tỷ lệ sống tếế bào Tronng thí ngh hiệm này, dung dịch sử dụngg Sodium glutamate, đểể bảo vệ màng m tế bào b chủng VNC1: Sucrose, S T Trehalose, g , Sorbitol Sinh khốii chủng VNC1, G Glycerol, M Mannitol, V đượ ợc bổ sung vào cácc duung dịch bảo b vệ nồng n độ 3% % Theo dõi d tỷ lệ sốống tếế bào sau m 300oC Kết q Hình 13 thể hiệện tỷ lệ số ống chủng VNC C1 dungg dịịch bảo vệệ sau Ảnh hưởng ch hất bảo vệ màng tế bào b tới chủ ủng C1 VNC 100.0 Tỷ lệ sống, % 80.0 60.0 40.0 20.0 Sucrrose Trehalose Sodium m glutamatte Glycerol Mannitol Sorbitol Chất bảảo vệ H Hình 13: Ảnh Ả hưởng chấtt bảo quảnn đến chủnng VNC1 Kết quuả Hình 13 choo thấy, succrose monosodiu m um glutam mate có tácc dụụng bảo vệ v màng tếế bào chủnng VNC1 tốt t nhất, sau giờ, ssố lượng tế t bào bảoo quuản dung dịch d hầu h không k thayy đổi (tỷ llệ sống đạạt 100%) Type text]  [T Page 35 5  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường N Ngược lại, tỷ lệ sốngg tế bàào chủng VNC1 V mannittol thấp p nhất, chỉỉ chhỉ 400,5% sau Nhhư vậy, lự ựa chọn đường đ succrose axit aminn m monosodiu um glutam mate chấất bảo vệ màng m tế bào b cho chhủng VNC C1 Trongg khhn khổ khóaa luận, sử dụng succrose chất c bảo vvệ để tiến n hành thíí ngghiệm tiếpp theo 3.3.2Ả Ảnh hưởn ng sốcc nhiệt đến n chủng VNC1 V Nhiệt độ mộtt nhữ ững thông g số quan trọng củaa trình h sấy, ảnh hư ưởng tới s sống sót s tế bào Do đó, đ kiểm tra khả năăng chịu đựng với nhhiệt độ củủa chủng VNC1 làà cần thiếtt Sinh khhối chủngg VNC1, đ bảo quuản hai dungg dịch: suucrose 3% hỗn hợp h sucrose 3% vàà glycerol 0,,3% đư ược khảo sát cácc dải nhiệtt độ: 4oC,, 30oC, 422oC, 50oC Sau 1h, kiiểm tra tỷ lệ sống sót tế bào b phương pháp p đếm kkhuẩn lạc Kết thhể troong hình 14 Khả n thích ứng với nhiệt n độ củ chủng VNC1 V 100.0 Sucrosee 3% Tỷ lệ sống, % 80.0 Sucrosee 3%+ glycero ol 0.3% 60.0 40.0 20.0 0.0 oC/1h 30 oC/1h 42oC/1hh 50oC C/1h Nhiệt độ ộ, oC H Hình 14: Ảnh Ả hưởng chấtt bảo quảnn đến chủnng VNC1 Biểu đồ đ hình 144 cho thấyy chủng VN NC1 thíchh ứng tốt vvới dải nh hiệt độ – 422oC, số lư ượng tế bàào hầu nhhư không đổi sau 1hh (tỷ lệ tếế bào sống g 89,68 – Type text]  [T Page 36 6  K Khoa Côngg Nghệ Sinnh Học Sv: V Vũ Thị Thu u Hường 1000%) Tuyy nhiên, 50oC, tế bào chủng g VNC1 bị b chết nhiiều, thể hiiện qua tỷỷ lệệ sống thấp (7,744 – 12,9%) Kết quảả cũngg cho thấyy, khơng có c khácc biiệt đáng kể k tỷ lệệ sống sót ng VNC1, bổ ssung thêm m glyceroll 0,,3% vào hỗn h hợp duung dịch bảo b vệ tế bào b 3.3.3Ả Ảnh hưởn ng sốcc thẩm thấ ấu đến tế bào ng VNC1 Trongg phươ ơng pháp sử dụng tạo chế phẩm giốống khởi động, đ phhương phááp sấy châân không, thường gâây m nước nnhanh cho tế bào vi siinh vật doo: trộn vớ ới vật liệuu sấy khaan, thời gian g sấy nnhanh Ngược lại, phhương pháp sấy đôông khô lààm giảm nước n khỏii tế bào m cách từ t từ Do vậậy, đánh giá khả n chịu sốc thẩm m thấu củaa chủng V VNC1 cần c thiết K Khảo sát ảnnh hưởngg sốc thẩm t thấu u đến tế bào b VNC1 du ung dịch: gllycerol 400% glyccerol 85% % Kết khảo sát thể t trrong hình 15: Ảnh h hưởng củ sốc thẩ ẩm thấu đếến tế bào cchủng VN NC1 Tỷ lệ sống, sống % 100 80 NaC Cl 0,85% 60 Gly ycerol 40% 40 Gly ycerol 85% 20 oC/ 1h oC/1h 30 42 oC/1h 50 oC/1h Nhiệt độ, đ oC Hình 15: Ảnh Ả hưởng c sốc thẩm m thấu đến tế bào chủnng VNC1 Kết quuả hình 155 cho thấyy, tỷ lệ tế bào b sống trrong dungg dịch glyccerol 85% % tất cácc nhiệt độ thhấp Ngượcc lại, trongg dung dịcch glycero ol 40%, tếế bàào chủng VNC1 hầầu khôông bị chếết (tỷ lệ sốống 100%) dải – 30oC Ở dảải nhiệt độ đ cao hơnn 42, 50oC, tỷ lệ sống s chủng c VN NC1 g glyceroll Type text]  [T Page 37 7  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường 40% giảm xuống tương ứng 26.4% 0% Như vậy, chủng VNC1 thích hợp với điều kiện nước khỏi tế bào cách từ từ, dải nhiệt độ – 30oC Căn vào kết thí nghiệm sốc nhiệt, sốc thẩm thấu cho thấy, phương pháp sấy đơng khơ thích hợp cho việc tạo chế phẩm giống khởi động chủng VNC1 [Type text]  Page 38  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết quả: Qua trình nghiên cứu khảo sát nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phát triển chủng VNC1 như: pH môi trường, tỉ lệ tiếp giống, nguồn đạm nguồn đường tỉ lệ nguồn đạm, nguồn đường mơi trường tối ưu hóa điều kiện lên men chất bảo vệ tế bào thích hợp để đạt mật độ tế bào cao Kết thu sau: ™ Lựa chọn điều kiện lên men: • Nguồn đường: Lactose • Tỉ lệ đường: 25g/L • Nguồn đạm: Sữa gầy • Tỉ lệ đạm tan sữa: 10g/L • pH mơi trường: • Tỉ lệ tiếp giống: 4% • Động học: 9giờ ™ Lựa chọn chất bảo quản • Chất bảo vệ tế bào chủng VNC1: sucrose 3% • Phương pháp tạo chế phẩm giống khởi động chủng VNC1 phương pháp đông khô Kiến nghị: Sauk hi tối ưu điều kiện lên men tăng sinh khối chủng VNC1, tiếp tục nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm để thu tế bào có tỉ lệ sống cao [Type text]  Page 39  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Kiều Hữu Anh, 1999 Giáo trình vi sinh vật cơng nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 113-118 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tý , “ Vi sinh vật học’’, NXB Giáo Dục, (1997) tr 224-230 Lâm Xuân Thanh (2002), Giáo trình công nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hoàng (2002), Công nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 5.Lê Ngọc Trân, Hồ Thị Yến Linh (2008), “Nâng cao độ ổn định bột đông khô vi khuẩn lactic nấm men dùng làm chế phẩm probiotic”, Đề tài khoa học- ĐH Y Dược Tp HCM Tài liệu tiếng Anh 6.B.J.B Wood and W.H Holzapfel ( 1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria 7.Crowe, L.M., Reid, D.S., & Crowe, J.H (1996) Is trehalose special for preserving dry biomaterials Biophysical Journal, 71, pp 2087-2093 8.Elisa Sgarbi (2012), Non stater lactic acid bacteria during cheese ripening: survival, growth and production of molecules potentially involved in aroma formation, University of Parma, italia 9.Eman Hussien El – Sayed Ayad (2001), Characterisation of lactococci isolated from natural niches and their role in flavour formation of cheese,Wageningen University, Wageningen, The Netherlands 10.FAO (2013), FAO statistical yearbook 2013 world food and agriculture, Rome [Type text]  Page 40  Khoa Công Nghệ Sinh Học Sv: Vũ Thị Thu Hường 11.Juliano De Dea Lindner (2008), Traditional and innovative approaches to evaluate microbial contribution in long ripened fermented foods: the case of Parmigiano Reggiano cheese, University of Parma, italia 12.Leslie, S B., Israeli, E., Lighthart, B., Crowe, J.H., & Crowe, L.M (1995) Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying Applied and Environmental Microbiology, 61(10), pp 3592-3597 13 Patrick F.Fox, Paul L.H.McSweeney, Timothy M.Cogan and Timothy P.Guinee (2004), Cheese Chemistry, Physics and Microbiology Volume General Aspects, Elsevier Ltd., United Kingdom 14 Paul L.H.McSweeney (2000), “Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening: Areview”, INRA, EDP Sciences, lait 80, pp 293 – 324 15.Paul L.H McSweeney (2004), “Biochemistry of cheese ripening”, International Journal of Dairy Technology, 57, pp 127 – 144 16 Rhea Fernandes (2008), Microbiology handbook dairy products, Biddles Ltd., United Kingdom [Type text]  Page 41