Nghiên cứu quy trình thu nhận pullulal từ nấm aureobasidim pullulans trên nguồn phụ phẩm nông nghiệp và ứng dụng trong bảo quản trái cây

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI -o0o - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH THU NHẬN PULLULAN TỪ NẤM AUREOBASIDIUM PULLULANS TRÊN NGUỒN PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TRÁI CÂY Mã số: MHN 2022-02.28 Chủ nhiệm đề tài : TS Bùi Thị Hải Hòa Hà Nội, tháng 12/ 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI -o0o - BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình thu nhận pullulan từ nấm Aureobasidium pullulans nguồn phụ phẩm nông nghiệp ứng dụng bảo quản trái Mã số: MHN 2022-02.28 Chủ nhiệm đề tài : TS Bùi Thị Hải Hòa Hà Nội, tháng 12/ 2022 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PULLULAN 1.1.1 Cấu tạo tính chất pullulan Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo pullulan 1.1.2 Ứng dụng pullulan 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM AUREOBASIDIUM PULLULANS 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý hóa 11 1.3 NGHIÊN CỨU THU NHẬN PULLULAN TỪ NẤM AUREOBASIDIUM PULLULANS 14 1.3.1 Ảnh hƣởng điều kiện lên men sinh tổng hợp pullulan 14 1.3.2 Các phƣơng pháp thu nhận pullulan 18 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PULLULAN TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 20 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị dụng cụ 22 2.1.3 Môi trƣờng phân lập nuôi cấy 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh 24 2.2.2 Phƣơng pháp hóa sinh 29 2.3 Phƣơng pháp bảo quản xoài sử dụng chế phẩm pullulan 31 2.3.1 Chuẩn bị màng bao pullulan 31 2.3.2 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm bảo quản xồi 32 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Phân lập, tuyển chọn, phân loại A.pullulans từ nguồn mẫu đất, rau 35 3.1.1 Kết phân lập nấm từ đất rau 35 3.1.2 Kết quan sát hình thái phân loại chủng nấm phân lập 36 3.1.3 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng Aureobasidium pullulans TP chủng APM01 38 3.1.4 Kết định tính hiệu suất thu hồi pullulan từ chủng Aureobasidium pullulan M01 39 3.2 Nghiên cứu lên men A.pullulans nguồn phụ phẩm nông nghiệp khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men sinh tổng hợp pullulan từ A.pullulans 42 3.2.1 Xác định ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng đến sinh tổng hợp pullulan từ A pullulans M01 42 3.2.2 Xác định ảnh hƣởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp pullulan từ chủng A pullulans M01 45 3.3 Nghiên cứu thu nhận pullulan từ chủng A.pullulans tuyển chọn 50 3.3.1 Loại bỏ màu 50 3.3.2 Thu hồi pullulan 51 3.3.3 Đánh giá chế phẩm tạo thành 52 3.3.4 Quy trình thu nhận pullulan từ nấm A pullulans M01 54 3.4 Bƣớc đầu ứng dụng sản phẩm pullulan từ chủng A.pullulan M01 bảo quản trái 56 3.4.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên xoài Cát Chu thời gian bảo quản 56 3.4.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi độ cứng xoài Cát Chu thời gian bảo quản 57 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi màu sắc vỏ xoài Cát Chu thời gian bảo quản 59 3.4.4 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng axit hữu xoài Cát Chu thời gian bảo quản 61 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng chất khơ hịa tan tỷ lệ thối hỏng xồi Cát Chu thời gian bảo quản 63 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo pullulan Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Nấm Aureobasidium pullulans Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Con đƣờng sinh tổng hợp pullulan từ nấm A pullulansError! Bookmark not defined Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát phƣơng pháp phân lập Error! Bookmark not defined Hình 2.2 Cách pha loãng dung dịch Error! Bookmark not defined Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận pullulan Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng APM01 mơi trƣờng P2Error! Bookmark not Hình 3.3 Q trình lên men A pullulan M01 thu nhận pullulanError! Bookmark not defined Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính pullulan Error! Bookmark not defined Hình 3.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookmark n Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ rỉ đƣờng Error! Bookmark not defined đến khả sinh tổng hợp pullulan Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookmark not d Hình 3.8 Ảnh hƣởng tỷ lệ bột ngô đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookmark no Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookmark not defined Hình 3.10 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp pullulan Error! Bookmark not defined Hình 3.11 Ảnh hƣởng tốc độ khuấy tới khả tạo pullulan (sau 96 h lên men) Error! Bookmark not defined Hình 3.12 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan xử lý đến tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên (%) xoài theo thời gian Error! Bookmark not defined Hình 3.13 Ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến biến đổi độ cứng xồiError! Bookmark Hình 3.14 Ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến biến đổi màu sắc xoài (ΔE) theo thời gian Error! Bookmark not defined Hình 3.15 Sự biến đổi màu sắc xoài đối chứng sau ngày 10 ngày bảo quản nhiệt độ phòng Error! Bookmark not defined Hình 3.16 Sự biến đổi màu sắc xoài bảo quản CT2 sau ngày 10 ngày bảo quản nhiệt độ phòng Error! Bookmark not defined Hình 3.17 Sự biến đổi màu sắc xoài đối chứng sau ngày 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh Error! Bookmark not defined Hình 3.18 Sự biến đổi màu sắc xoài bảo quản CT2 sau ngày 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh Error! Bookmark not defined Hình 3.19 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng axit (mg/l) xoài Cát Chu thời gian bảo quảnError! Bookmark not defined Hình 3.20 Biến đổi chất khơ hịa tan theo thời gian bảo quảnError! Bookmark not defined Hình 3.21 Đồ thị tỷ lệ thối hỏng xoài theo thời gian bảo quản …………………….Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Khả phân giải tinh bột từ chủng nấm phân lập đƣợcError! Bookmark not d Bảng 3.2 Kết quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng kích thƣớc tế bào chủng A pullulans TP chủng nấm APM01, AMP02Error! Bookmark not define Bảng 3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng A pullulans TP chủng nấm phân lập APM01 Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Khả sinh tổng hợp pullulan chủng nấm A pullulans M01 MTcb Error! Bookmark not defined Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên men đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookma Bảng 3.6 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp pullulanError! Bookmark no Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỉ lệ than hoạt tính đến cƣờng độ màu dịch lên menError! Bookm Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Ảnh hƣởng loại dung môi (v/v) đến hiệu tách pullulanError! Bookmark not Bảng 3.9 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi pullulan Error! Bookmark not defined Bảng 3.10 Các thông số chế phẩm pullulan thôError! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT A.pullulans Aureobasidium Pullulans kDa: Kilodalton P: Photpho K: Kali Da: Dalton tlc: Thin layer chromatography pka: Hằng số phân ly OD: Optical density- Mật độ quang học DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TT Đơn vị công tác Nội dung nghiên cứu cụ thể lĩnh vực chuyên môn đƣợc giao Khoa Công nghệ sinh - Phân lập, tuyển chọn, phân học – Trƣờng ĐH Mở loại A.pullulans từ nguồn mẫu Họ tên Bùi Thị Hải Hòa Hà Nội Lĩnh vực chuyên mơn: Hóa sinh, Vi sinh đất, rau - Nghiên A.pullulans cứu lên men nguồn phụ phẩm nông nghiệp khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men sinh tổng hợp pullulan từ A.pullulans Trịnh Thị Thu Khoa Công nghệ sinh - Hằng học – Trƣờng ĐH Mở pullulan từ chủng A.pullulans Hà Nội Nghiên cứu thu nhận tuyển chọn Lĩnh vực chuyên mơn: - Nghiên cứu ứng dụng sản Hóa sinh, vi sinh phẩm pullulan bảo quản trái Chữ ký Thuyết minh qui trình a Hoạt hóa giống cấy giống môi trƣờng MTcb Chủng nấm A.pullulans M01 đƣợc hoạt hóa cấy chuyền ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng MTcb, nuôi cấy 30oC ngày Nhân giống nấm A pullulans M01 môi trƣờng MTcb bình tam giác 500 ml, thể tích mơi trƣờng MTcb 150 ml/bình Lắc máy lắc tốc độ 250 vòng/phút nhiệt độ 30oC thời gian ngày b Lên men pullulan máy lắc Bổ sung 8% giống nấm A pullulans M01 vào 10L môi trƣờng rỉ đƣờng – bột ngơ bình tam giác 500 ml Sau tiến hành lên men nhiệt độ 30oC, pH sau 96 dừng lên men để tiến hành thu hồi pullulan c Loại xác tế bào chủng nấm A pullulans M01 dịch lên men Dịch lên men đƣợc ly tâm 6000 v/p 30 phút Thu dịch có chứa pullulan, loại bỏ phần xác tế bào lắng đáy ống ly tâm d Loại màu dịch lên men Dịch sau lên men chủng A.pullulans M01 đƣợc ly tâm 6000 vòng/phút, 30 phút nhiệt độ phòng (khoảng 25-30oC) 30 phút Kết ống ly tâm phân lớp, phần kết tủa xác tế bào loại bỏ, lấy 40 ml dịch cho vào bình tam giác 100, bổ sung từ đến 1,2% (w/v) than hoạt tính chia làm mức: 0; 0,2; 0,6; 0,8; 1; 1,2% (w/v) Lắc 15 phút với tốc độ 150 v/p Sau lọc giấy lọc Ф11 cm, thu phần dịch lọc đem đo mật độ quang bƣớc sóng 320 nm Tại bƣớc sóng khả hấp thu màu tốt nên xác định mức độ giảm màu dung dịch thể giá trị OD thu đƣợc.Dịch đƣợc bổ sung nồng độ than hoạt tính 0,1% (w/v), lắc 15 phút tốc độ 150 v/p Sau lọc giấy lọc e Thu hồi pullulan từ dịch lên men Phần dịch sau loại màu đƣợc tủa với ethanol lạnh tỷ lệ 1:1, đảo để tĩnh 12 qua đêm Sau hỗn dịch đƣợc ly tâm 6000 vòng/phút, 20 phút Loại bỏ dịch nổi, thu phần kết tủa f Tạo chế phẩm pullulan 55 Sau trình ly tâm, phần kết tủa đƣợc đem sấy 70℃ đến trọng lƣợng không đổi cân định lƣợng Sau tiến hành đánh giá chất lƣợng chế phẩm pullulan thô, tiến hành nghiền nhỏ rây mịn, đóng gói qui cách 100g/ túi 3.4 Bƣớc đầu ứng dụng sản phẩm pullulan từ chủng A.pullulan M01 bảo quản trái 3.4.1 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên xoài Cát Chu thời gian bảo quản Hao hụt khối lƣợng tƣợng xảy trình bảo quản Tuy nhiên, mức độ hao hụt phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ loại ngun liệu, phƣơng pháp xử lý, bao bì đóng gói, điều kiện bảo quản… Việc sử dụng dung dịch pullulan nhằm tạo lớp màng bao bề mặt vỏ hạn chế trình sinh lý, sinh hố q trình bảo quản Kết đánh giá ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến tỷ lệ hao hụt khối tƣợng tự nhiên xoài điều kiện bảo quản nhiệt độ thƣờng (28-30oC) bảo quản nhiệt độ lạnh (12-13oC) đƣợc thể hình 3.12a 3.12b ĐC CT1 CT2 10 CT3 14 ĐC CT1 CT2 CT3 12 10 2 11 13 15 Thời gian bảo quản (ngày) 11 13 15 20 25 30 Thời gian bảo quản (ngày) (a) (b) Hình 3.12 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan xử lý đến tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên (%) xoài theo thời gian (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh Kết hình 3.12 cho thấy, hao hụt khối lƣợng tự nhiên diễn tất công thức tăng theo thời gian bảo quản Trong điều kiện bảo quản nhiệt độ thƣờng, mẫu ĐC, CT1, CT2, CT3 có tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên sau ngày bảo quản 7,45%, 6,4%, 3,83%, 4,03% Tỷ 56 lệ tiếp tục tăng mạnh ngày bảo quản Sau 15 ngày bảo quản điều kiện nhiệt độ thƣờng, hao hụt khối lƣợng tự nhiên mẫu ĐC 12,87%, CT1 10,60%, CT2 8,65% CT3 8,78% Trong điều kiện bảo quản lạnh, hao hụt khối lƣợng tự nhiên xảy chậm Mẫu ĐC, CT1, CT2, CT3 có tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên sau 15 ngày bảo quản 7,6%, 7,06%, 6,6% 5,42% Sau 30 ngày bảo quản, tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên mẫu ĐC, CT1, CT2, CT3 lần lƣợt 8,43%, 7,96%, 6,23% 6,37% Trong số công thức xử lý cơng thức CT2 có tỷ lệ hao hụt thấp so với công thức CT1 CT3 Nhƣ vậy, hao hụt khối lƣợng tự nhiên công thức ĐC lớn khác biệt so với công thức đƣợc xử lý chế phẩm pullulan điều kiện bảo quản Điều lý giải chế phẩm pullulan tạo lớp màng bọc bao phủ quả, lớp màng có tác dụng ngăn không cho bề mặt tiếp xúc trực tiếp với mơi trƣờng bên ngồi, q trình hơ hấp bay nƣớc nên hạn chế tổn thất khối lƣợng Từ kết bƣớc đầu đánh giá chế phẩm pullulan bảo quản xồi có khả làm giảm tỷ lệ hao hụt khối lƣợng tự nhiên 3.4.2 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi độ cứng xoài Cát Chu thời gian bảo quản Độ cứng tiêu vật lý quan trọng để đánh giá thay đổi trạng thái kết cấu ruột Độ cứng thay đổi trình bảo quản, nguyên nhân protopectin bị thủy phân thành pectin hòa tan làm cho mềm dần Để khảo sát ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến biến đổi độ cứng ruột trình bảo quản, tiến hành theo phƣơng pháp mục 2.3.3 Kết thu đƣợc thể hình 3.13 a 3.13b 57 ĐC CT1 CT2 CT3 12 10 ĐC CT1 CT2 CT3 2 11 13 Thời gian bảo quản (ngày) 15 11 13 15 20 25 30 Thời gian bảo quản (ngày) (a) (b) Hình 3.13 Ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến biến đổi độ cứng xoài (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh Qua kết hình 3.13 cho thấy, độ cứng xồi cơng thức giảm dần theo thời gian bảo quản, nhiên công thức khác có mức giảm khác Mẫu đối chứng cho thấy độ cứng giảm mạnh, độ cứng công thức ĐC 0,37 kg/cm2 sau 15 ngày nhiệt độ thƣờng 1,54 kg/cm2 sau 30 ngày nhiệt độ lạnh Ngun nhân q trình chín dẫn đến thay đổi kết cấu, trạng thái Ở nhiệt độ thƣờng, độ cứng công thức CT1, CT2 CT3 giảm sau ngày thứ bảo quản, nhiên cơng thức CT2 CT3 có độ cứng giảm chậm so với công thức CT1 Độ cứng công thức CT1, CT2 CT3 vào ngày thứ 15 bảo quản nhiệt độ thƣờng 0,72, 0,93 0,89 kg/cm2, cao hẳn so với cơng thức ĐC (0,37 kg/cm2) Khi bảo quản xồi nhiệt độ lạnh, độ cứng công thức CT1, CT2 CT3 giảm sau 25 ngày bảo quản, nhiên cơng thức CT2 CT3 có độ cứng giảm chậm so với công thức CT1 Độ cứng công thức CT1, CT2 CT3 lần lƣợt 2,18, 3,88 3,98 kg/cm2, cao hẳn so với công thức ĐC (1,78 kg/cm2) Sự giảm biến đổi độ cứng CT2 CT3 lý giải nhúng với chế phẩm pullulan tạo lớp màng bao làm cho trình hơ hấp hạn chế, q trình chuyển đổi protopectin sang pectin chậm độ cứng 58 giảm chậm, màng bao có nồng độ pullulan 8% 12% giúp giảm độ cứng chậm 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi màu sắc vỏ xoài Cát Chu thời gian bảo quản Kết theo dõi biến đổi màu sắc vỏ đƣợc đánh giá thông qua giá trị ΔE thời điểm theo dõi 5, 10, 15 ngày mẫu bảo quản nhiệt độ thƣờng 5, 10,15, 20, 25, 30 ngày mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh đƣợc trình bày hình 3.14 ĐC CT1 CT2 ĐC CT3 30.000 CT1 20.000 15.000 20.000 10.000 10.000 5.000 0.000 0.000 10 15 Thời gian bảo quản (ngày) 10 15 20 25 30 Thời gian bảo quản (ngày) (a) (b) Hình 3.14 Ảnh hƣởng chế phẩm pullulan đến biến đổi màu sắc xoài (ΔE) theo thời gian (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh Hình 3.15 Sự biến đổi màu sắc xoài đối chứng sau ngày 10 ngày bảo quản nhiệt độ phịng 59 Hình 3.16 Sự biến đổi màu sắc xoài bảo quản CT2 sau ngày 10 ngày bảo quản nhiệt độ phịng Hình 3.17 Sự biến đổi màu sắc xoài đối chứng sau ngày 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh Hình 3.18 Sự biến đổi màu sắc xồi bảo quản CT2 sau ngày 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh 60 Thời gian bảo quản dài màu sắc biến đổi nhiều chín Với thời gian bảo quản mẫu đối chứng mẫu CT1 biến đổi màu nhiều nhất, nhiệt độ thƣờng sau 15 ngày, ΔE ĐC CT1 lần lƣợt 24,530 20,471 Ở nhiệt độ lạnh sau 30 ngày, ΔE ĐC CT1 lần lƣợt 18,569 14,300 Trong mẫu CT2 CT3 biến đổi nhiệt độ bảo quản, ΔE lần lƣợt 16,544 16,900 sau 15 ngày bảo quản nhiệt độ thƣờng, 9,863 10.178 sau 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh Biên độ biến đổi màu (khoảng biến đổi màu thời điểm bảo quản nồng độ) mẫu có khác biệt rõ ràng: mẫu đối chứng màu sắc biến đổi nhanh, khoảng chênh lệch thời điểm bảo quản lớn Các khoảng chênh lệch giảm dần tƣơng ứng theo nồng độ pullulan 4%, 8% Mẫu CT2 CT3 màu sắc vỏ chuyển dần sang màu xanh vàng, có độ sáng dần lên, mẫu ĐC vỏ sậm màu chuyển sang lốm đốm Mẫu 8% (CT2) có biên độ màu biến đổi nhất, nhiên mức độ chênh lệch mẫu CT2 CT3 không đáng kể Từ kết trên, nhận thấy chế độ bảo quản lạnh bảo quản thƣờng, nồng độ pullulan 8% 12% có ảnh hƣởng làm giảm khả biến đổi màu xoài Tuy nhiên, bảo quản xoài nhiệt độ lạnh kết hợp màng pullulan 8% (CT2) có khả hạn chế biến đổi màu cách rõ rệt, màu sắc chênh lệch nhiều so với đối chứng 3.4.4 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng axit hữu xoài Cát Chu thời gian bảo quản Để đánh giá ảnh hƣởng màng bao pullulan tới hàm lƣợng axit hữu bảo quản xoài, tiến hành theo dõi thay đổi hàm lƣợng axit mẫu thí nghiệm thời điểm khác thời gian bảo quản Kết đƣợc thể hình 3.19 61 (a) (b) Hình 3.19 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng axit (mg/l) xoài Cát Chu thời gian bảo quản (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh Tất mẫu có biến thiên hàm lƣợng axit chung giống khác cƣờng độ biến thiên Những ngày đầu trình bảo quản, hàm lƣợng axit tăng lên nhanh chóng, sau ngày bảo quản hàm lƣợng axit đạt cực đại Theo biểu đồ hình 8, mẫu ĐC có cƣờng độ biến đổi axit hữu lớn nhất, sau đến CT1 Mẫu CT2 CT3 có cƣờng độ biến đổi axit hữu chậm hơn, nguyên nhân màng pullulan hạn chế trình sinh lý, sinh hố xồi nên kìm hãm trình biến đổi thành phần axit hữu Ở mẫu bảo quản nhiệt độ thƣờng, sau 11 ngày bảo quản, hàm lƣợng axit toàn phần mẫu đối chứng mẫu CT1 có biến thiên mạnh gần nhƣ tƣơng đƣơng nhau, mẫu CT1 giảm từ 185,16 mg/l xuống 35,74 mg/l từ ngày 11 đến ngày 15, mẫu đối chứng giảm từ 92,16 mg/l xuống 32,13 mg/l Trong mẫu CT2 CT3 trì hàm lƣợng axit 132,41 mg/l 127,13 mg/l vào ngày 15 nhiệt độ thƣờng Tƣơng tự nhƣ vậy, nhiệt độ lạnh, thời gian bảo quản kéo dài nhiệt độ lạnh làm giảm trình hơ hấp biến đổi hóa sinh xồi, thời gian bảo quản kéo dài lên đến 30 ngày, với hàm lƣợng axit biến thiên chậm mẫu ĐC, CT1, CT2 CT3, lần lƣợt 102,17, 225,17, 354,56 347,12 mg/l Nhƣ vậy, hiệu bảo quản thể rõ CT2, nguyên nhân CT3 với nồng độ pullulan 12% tạo màng bao dày kìm hãm q trình nƣớc CO2 (là sản phẩm q trình hơ hấp) nên lúc q trình yếm khí, ảnh hƣởng đến chất lƣợng Việc kết hợp bảo quản xoài pullulan 8% (CT2) 62 nhiệt độ lạnh cho kết biến thiên hàm lƣợng axit hữu tổng số chậm nhất, chứng tỏ hiệu bảo quản cao Kết tƣơng ứng với nghiên cứu Wei Zhou cs (2021) nghiên cứu nồng độ pullulan kết hợp với chitosan bảo quản xoài [40] 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ chế phẩm pullulan đến biến đổi hàm lƣợng chất khơ hịa tan tỷ lệ thối hỏng xoài Cát Chu thời gian bảo quản Sự biến đổi hàm lƣợng chất khơ hồ tan tổng số/tỷ lệ thối hỏng mẫu thí nghiệm đƣợc trình bày hình 3.20 3.21 (a) (b) Hình 3.20 Biến đổi chất khơ hịa tan theo thời gian bảo quản (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh 80 80 ĐC CT1 CT2 CT3 ĐC 60 60 40 40 20 20 CT1 CT2 CT3 0 11 13 Thời gian bảo quản (ngày) 15 11 13 15 20 25 30 Thời gian bảo quản (ngày) (a) (b) Hình 3.21 Đồ thị tỷ lệ thối hỏng xoài theo thời gian bảo quản (a) mẫu bảo quản nhiệt độ thường; (b) mẫu bảo quản nhiệt độ lạnh Nồng độ chất khơ hịa tan tỷ lệ thối hỏng biến đổi theo thời gian bảo quản tiêu quan trọng cần phải quan tâm đến trình bảo quản rau tƣơi Kết xác định nồng độ chất khơ tổng số (Hình 3.21) cho thấy, mẫu đối chứng khơng xử lý pullulan nên chất khơ hịa tan tăng nhanh so với mẫu CT1, CT2, 63 CT3 Các mẫu ĐC, CT1, CT2 CT3 sau 15 ngày bảo quản nhiệt độ thƣờng có lƣợng chất khơ hịa tan 15,7, 13,7, 12,2 12,4 độ Brix Mẫu CT2 CT3 có biến đổi chất khơ hịa tan theo thời gian bảo quản chậm so với mẫu CT1 ĐC màng pullulan hạn chế khả hô hấp nên chất tan tăng lên chậm Tƣơng tự với nhiệt độ bảo quản lạnh, mẫu CT2 CT3 có biến đổi chất khơ hịa tan thấp hẳn so với mẫu ĐC CT1 Sau 30 ngày bảo quản nhiệt độ lạnh, mẫu đối chứng chuyển sang giai đoạn hƣ hỏng, phân hủy nên nồng độ chất khơ hịa tan giảm rõ rệt ngày thứ 30 Đối với tỉ lệ thối hỏng xồi, kết hình 3.21 cho thấy, nhiệt độ bảo quản thƣờng, xoài bắt đầu hỏng ngày thứ mẫu ĐC, ngày thứ mẫu CT1 từ ngày thứ 11 CT2 CT3 Ở nhiệt độ bảo quản lạnh, thời gian bảo quản xoài đƣợc kéo dài Xoài bảo quản bắt đầu hỏng ngày thứ mẫu ĐC, ngày thứ 11 mẫu CT1 từ ngày thứ 15 CT2 CT3 Tỷ lệ thối hỏng ngày thứ 30 theo thứ tự mẫu ĐC, CT1, CT2, CT3 75%, 33,33%, 16,67%, 16,67% cho thấy hiệu bảo quản xoài sử dụng pullulan nhiệt độ lạnh tốt hẳn so với bảo quản nhiệt độ thƣờng Nhƣ vậy, sử dụng chế phẩm pullulan kết hợp với bao gói PE-L bảo quản xồi nhiệt độ lạnh (12-130C) gia tăng thời gian bảo quản xoài lên 25 ngày, kéo dài 12 ngày so với mẫu đối chứng Tỷ lệ thối hỏng CT2 CT3 nhiệt độ thƣờng nhiệt độ lạnh sau 13 ngày 25 ngày mức 8,33%, nhỏ 10% đạt yêu cầu bảo quản Do hiệu bảo quản xoài pullulan nồng độ 8% 12% tƣơng đƣơng nhau, để tăng hiệu kinh tế, nồng độ pullulan 8% (CT2) lựa chọn thích hợp bảo quản xoài 64 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN Đã phân lập định loại đƣợc chủng nấm A pullulan M01 theo khóa phân loại Kurtzman and Fell, 1998 từ 36 mẫu đất, trái Đã thu hồi, định tính phƣơng pháp sắc ký mỏng, cho thấy sản phẩm thu đƣợc pullulan hiệu suất thu hồi pullulan thô ethanol lạnh tỷ lệ 1:1 (w/v) từ A pullulan M01 lên men MTcb 18,58 g/l Đã nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp sinh tổng hợp pullulan từ chủng A pullulans M01 nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp xây dựng qui trình lên men từ mơi trƣờng rỉ đƣờng – bột ngô với thông số kỹ thuật: nguồn cacbon rỉ đƣờng 5,0%, nguồn nitơ bột ngô 3,0%, pH 6,0, tỷ lệ giống 8%, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, tốc độ khuấy 250 vòng/phút, thời gian lên men 96 giờ, hiệu suất thu hồi pullulan từ A pullulans M01 25,7 g/l Đã xác định đƣợc dung mơi thích hợp ethanol để kết tủa pullulan với tỉ lệ dịch lên men/ethanol 1/1 (v/v), hiệu suất thu hồi pullulan 1lít dịch lên men 26,1 g/l Chế phẩm pullulan thơ thu đƣợc có hàm lƣợng tro 3,8%, protein 0,44%, độ ẩm 5,8%, độ nhớt 104 mm2/s pH 6,56 Đã nghiên cứu đánh giá đƣợc ảnh hƣởng nồng độ pullulan thu nhận từ nấm A.pullulans M01 đến khả bảo quản xồi Cát Chu: nồng độ pullulan 8% kéo dài thời gian bảo quản xoài, giảm tỷ lệ thối hỏng, đặc biệt kết hợp với bảo quản xoài nhiệt độ lạnh 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alemzadeh, Iran (2009), “The study on microbial polymers: pullulan and PHB”, Iran J Chem Chem Eng, Vol 28 (No1), 13-21 A Lazaridou, C G.Billiaderis, T Roukas, M Izydorczyk, “Production and Characterization of Pullulan from Beet Molasses Using a Nonpigmented Strain of Aureobasidium pullulans in Batch Culture,” Applied Biochemistry and Biotechnology ,Vol 97(1), pp 1-22, 2002 Alicja Synowiec, Małgorzata Gniewosz, Karolina Kra´sniewska, Jarosław Leon Przybył, Katarzyna Baczek, Zenon Weglarz (2013) Antimicrobial and antioxidant properties of pullulan film containing sweet basil extract and an evaluation of coating effectiveness in the prolongation of the shelf life of apples stored in refrigeration conditions Innovative Food Science and Emerging Technologies Anna Chlebowska-Śmigiel, Małgorzata Gniewosz, Ewa Świńczak (2007) An attempt to apply a pullulan and pullulan – protein coatings prolong apples shelflife stability Acta Sci Pol., Technol Aliment 6(1) 2007, 49-56 A R Choudhury, N Sharma, G S Prasad, “Deoiledjatropha seed cake is a useful nutrient for pullulan production,” Microbial Cell Factories, vol 11(1), pp 39, 2012 Bộ Công Thƣơng (2020) Dự án sản xuất thử nghiệm “Hoàn thiện công nghệ sản xuất pullulan ứng dụng sản xuất số sản phẩm thực phẩm” Báo cáo tổng kết Cheng K.C., Demirci A., Catchmark J (2009), “Effect of temperature, carbon source, yeast extract, and pH on pullulan production by Aureobasidium pullulans”, The American Society of Agricultural and Biological Engineers,1-6.3 Dahui Wang., Xiaolui Yu., Wei Gongyuan (2013), “Pullulan production and physiological characteristics of Aureobasidium pullulans under acid stress”, Appl Microbiol Biotechnol, 2013 Sep; 97(18):8069-77 Dexter L.B., Assoc (2002), Pullulan GRAS Notification, H a y a s h i b a r a International Inc, 19-143 10 D Wang, X Ju, D Zhou, G Wei, “Efficient production of pullulan using rice hull hydrolysate by adaptive laboratory evolution of Aureobasidium pullulans,” Bioresource Technology, vol 164, pp 12–19, 2014 66 11 Duan X., Chi Z and etc (2008), “Influence of different sugars on pullulan production and activities of a-phosphoglucose mutase, UDPG-pyrophosphorylase and glucosyltransferase involved in pullulan synthesis in Aureobasidium pullulans Y68”, Carbohydrate Polymers 73, 587–593 12 F Federice, “Extracellular enzymatic activities in Aureobasidium pullulans,” Mycologia, 74(5), pp 738-743, 1982 13 H Punnapayak, M Sudhadham, S Pichayangkura, S Prasongsuk, “Characterization of Aureobasidium pullulans isolated from airborne spores in Thailand,” Journal of Industrial Microbiol Biotechnol, vol 30, pp 89-94, 2003 14 J.Huyn Lee, Jeong Hwa Kim, II Hui Zhu, Xiao Bei Zhan (2001) “Optimization of conditions for the production of pullulan and high molecular weight pullulan by Aureobasidium pullulans”, Biotechnology Letter 23(10), 817 – 820 15 K R Sugumaran and V Ponnusami, “Conventional optimization of aqueous extraction of pullulan in solid-state fermentation of cassava bagasse and Asian palm kernel,” Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, vol 10, pp 204–208, 2017b 16 Kachhawa D.K., Bhattacharjee P., Singhal R.S (2003), “Studies on downstream processing of pullulan”, Carbohydrate Polymers 52, 25–28 17 Kurtzman C.P., Fell J.W (1998), “The yeasts, a taxonomic study, fourthed”, Elsevier, 915-947 18 Lacroixt C., Le A.D and etc (1985), “Effect of pH on the batch fermentation of pullulan from sucrose medium”, Biotechnology and bioengineering, Vol XXVII, Pp 202-207 19 Lazaridou A., Roukas T., Biliaderis C.G., Vaikousi H (2002), “Characterization of pullulan produced from beet molasses by Aureobasidium pullulans in a stirred tank reactor under varying agitation”, Enzyme and Microbial Technology,31, 122– 132 20 M Liakopoulou-Kyriakides and T Roukas, “Production of pullulan from beet molasses by Aureobasidium pullulans in a stirred tank fermentor,” Journal of Food Engineering, vol 40, pp 89 – 94, 1999 21 Ngô Thị Vân (2008) Nghiên cứu ứng dụng pullulan sản xuất bánh kẹo bảo quản thịt Báo cáo tổng kết đề tài R-D cấp Bộ Công Thƣơng 67 22 Nguyễn Lân Dũng (dịch từ tiếng Nga) (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà nội 23 Nishant Kuma, Pratibha, Neeraj, Anka Trajkovska Petkoska, Sawsan Ali AL- Hilifi and Olaniyi Amos Fawole (2021) Effect of Chitosan–Pullulan Composite Edible Coating Functionalized with Pomegranate Peel Extract on the Shelf Life of Mango (Mangifera indica) Coatings 2021, 11, 764 24 Neetu Singh Tanwar, “Chapter Synthesis of pullulan”, Pullulan book, Jenny Stanford Publishing, 1st Edition, pp 58 – 70, 2020 25 Prasongsuk S., Berhow M.A and etc (2007) “Pullulan production by tropical isolates of Aureobasidium pullulans” J Ind Microbiol Biotechnol 34, 55–61 26 Ranjan Singh, Rajeeva Gaur, Soni Tiwari, and Manogya Kumar Gaur (2012), “Production of pullulan by a thermotolerant Aureobasidium pullulans strain in nonstirred fed batch fermentation process”, Braz J Microbiol; 43(3): 1042–1050 27 R S Singh, G.K Saini, J F Kennedy, “Pullulan: Microbial sources, production and applications,” Carbohydrate Polymers, vol 73, pp 515-531, 2008 28 R S Singha, N Kaura, J F Kennedy, “Pullulan production from agro-industrial waste and its applications in food industry: A review,” Carbohydrate Polymers, vol 217, pp 46–57, 2019 29 R S Singh and N Kaur, “Understanding response surface optimization of medium composition for pullulan production from de-oiled rice bran by Aureobasidium pullulans,” Food Science and Biotechnology, vol 28(5), pp 15071520, 2019 30 S Zarei, F Khodaiyan, S S Hosseini, J F Kennedy, “Pullulan Production Using Molasses and Corn Steep Liquor as Agroindustrial Wastes: Physiochemical, Thermal and Rheological Properties,” Applied food biotechnology, vol 7(4), pp 263-272, 2020 31 Shengjun Wua, Jinhua Chenb (2013) Using pullulan-based edible coatings to extend shelf-life of fresh-cut „Fuji‟ apples International Journal of Biological Macromolecules Volume 55, April 2013, Pages 254-257 32 TCVN 4326:2001 (ISO 6496:1999) Xác định độ ẩm hàm lƣợng chất bay khác 68 33 TCVN 4328:2007 Xác định hàm lƣợng protein thô theo phƣơng pháp Kjeljdahl 34 TCVN 4327:2007 Xác định hàm lƣợng tro thô 35 TCVN 5102:1990 Rau tƣơi – lấy mẫu 36 TCVN 7771:2007 Xác định chất rắn hòa tan – phƣơng pháp khúc xạ 37 TCVN 5483 – 2007 Sản phẩm rau - xác định độ axit chuẩn độ đƣợc 38 Thirumavalavan K., Manikandan TR, Dhanasekar R (2008), “Batch fermentation kinetics of pullulan from Aureobasidium pullulans using low cost substrates”, Biotechnology, Volume 7, Issue 2, p 317–322 39 T Roukas, “Pretreatment of beet molasses to increase pullulan production,” Process Biochemistry, vol 33, pp 805–810, 1998 40 WeiZhou., YunxiaHe and etc (2021) Carboxymethyl chitosan-pullulan edible films enriched with galangal essential oil: Characterization and application in mango preservation Carbohydrate Polymers, Volume 256, 15 March 2021, 117579 69