Nghiên cứu hoá học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất tử vi nấm biển phân lập tại miền trung việt nam

BỘ GIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀCÔNGNGHỆVIỆTNA M HỌCVIỆN KHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆ - PHANTHỊHOÀITRINH NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌCCỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬPTẠIMIỀNTRUNGVIỆTNAM LUẬNÁN TIẾN SĨSINHHỌC Hà Nội– 2019 BỘ GIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNA M PHANTHỊHỒITRINH NGHIÊN CỨU HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌCCỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ VI NẤM BIỂN PHÂN LẬPTẠIMIỀNTRUNGVIỆTNAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh họcMãsố:9.42.02.01 LUẬNÁN TIẾN SĨSINHHỌC NGƯỜI HƯỚNGDẪNKHOAHỌC: PGS.TS.PhíQuyết Tiến PGS.TS.Trần ThịThanh Vân Hà Nội–2019 LỜICAMĐOAN Tơixincamđoan: Đâylàcơngtrìnhnghiêncứucủatơivàmộtsốkếtquảcùngcộngtácvớimộtsốcộngsự khác Cácsốliệuvàkếtquảtrìnhbàytrongluậnánlàtrungthực,mộtphầnđãđượccơng bố tạpchíkhoahọcchunngànhvàđượcsựđồngýsửdụngsốliệucủacác đồngtácgiả Phầncịnlạichưađượcaicơngbốtrongbấtkỳcơngtrìnhnàokhác HàNội,ngày tháng Nghiêncứusinh PhanThịHồiTrinh năm2019 LỜICẢMƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc trân trọng củamình đến PGS.TS Phí Quyết Tiến, Viện Cơng nghệ sinh học PGS.TS Trần ThịThanhVân,ViệnNghiêncứuvàỨngdụngcơngnghệNhaTrang–nhữngngườiThầyđãlntậntình giúpđỡ,hướngdẫnkhoahọcvàđịnhhướngnghiêncứutrongsuốtqtrìnhtơithựchiệnvàhồnthànhluậnán TơixintrântrọngcảmơncốPGS.TS.BùiMinhLý,ngườiđãtruyềnniềmđammê nghiên cứu khoahọc,lnquantâmvàtạođộnglựcchotơitừnhữngngàyđầuthựchiệnluậnán Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Viện Cơng nghệ sinhhọcđãgiảngdạy,cungcấpcáckiếnthứcmớiđểtơihồnthànhcáchọcphầnvàcácchunđềt rongchươngtrìnhđàotạo Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học Công nghệđãtạođiềukiệnthuậnlợiđểtơihồnthànhcácnộidungtrongchươngtrìnhđàotạo Tơi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đàotạo Viện Công nghệ sinh học Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm Học việnKhoa học Cơng nghệ tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành hồ sơtrongqtrìnhhọc tập Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện NC&UDCN Nha Trang cùngcácđồngnghiệpđãlnủnghộvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợiđểtơitậptrungnghiêncứuvàhồ nthànhluậnán TơixinchânthànhcảmơnHợpphầnnhánhsố3thuộcDựánđiềutracơbảnvàDựánhợptác nghiên cứu khoa học Viện NC&UDCN Nha Trang ViệnKH&CNHảidươngHànQuốcđãhỗtrợ kinhphíthực hiệnđềtài Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè quan tâm,hỗ trợ động viên suốt thời gian qua để tơi hồn thành tốt nhiệm vụhọctậpvàcơngtácchunmơn Tơixintrântrọngcảm ơn! Nghiêncứusinh PhanThịHồiTrinh MỤCLỤC Trang Trangphụ bìa Lờicamđoan i Lờicảmơn ii Mụclục iii Danhmụccáckýhiệu, cácchữviếttắt vii Danhmụccácbảng .x Danhmụccáchình xi MỞĐẦU CHƯƠNG1.TỔNGQUAN .4 1.1 Giớithiệu chungvềhoạttínhsinh họctừvinấmbiển 1.1.1 Cáchợpchấtchuyểnhóathứ cấpcóhoạttínhsinhhọc từvinấmbiển 1.1.1.1 Chấtkhángsinh 1.1.1.2 Chấtgâyđộc tếbàoungthư 1.1.1.3 Chấtchốngoxyhóa .10 1.1.1.4 Chấtbảo vệtếbàothầnkinh 11 1.1.1.5 Mộtsốchấtcóhoạttínhsinhhọckhác .12 1.1.2 Đadạngsinhhọc vinấmbiển 12 1.1.3 Mộtsốđặctínhsinhhọccủavinấm biển 14 1.1.4 Nghiêncứusànglọcvi nấmbiển sinh tổnghợp hoạtchấtsinhhọc 16 1.2 Môi trường lên men ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năngsinhtổnghợp chấtkhángsinhcủavinấmbiển .17 1.2.1 Đặcđiểmcủaquátrìnhlênmensinh chấtkhángsinh 17 1.2.2 Môitrường lên menvinấmsinhkhángsinh 19 1.2.2.1 Lênmenrắn 19 1.2.2.2 Lênmenchìm 20 1.2.3 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp chất khángsinhcủavi nấmbiển 22 1.2.3.1 Ảnhhưởngcủathờigianlên men 22 1.2.3.2 Ảnhhưởngcủa nồngđộmuối .24 1.2.3.3 ẢnhhưởngcủapH .26 1.2.3.4 Ảnhhưởngcủanhiệtđộ 27 1.2.3.5 Ảnhhưởngcủa nguồncarbonvànitơ 28 1.3 Nghiêncứuphânlậpvàxácđịnhcấutrúchóahọcchấtchuyểnhóa thứcấptừvinấmbiển 29 1.3.1 Phânlậpchấtchuyểnhóathứ cấptừ vi nấmbiển .29 1.3.2 Xácđịnhcấutrúchóahọcchấtchuyển hóathứ cấptừ vi nấmbiển .31 1.4 Xuhướngnghiêncứucáchoạtchấtsinhhọctừ vinấmbiểntrênthếgiới vàởViệtNam .32 CHƯƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 37 2.1 Vậtliệuvàmôitrườngnghiêncứu .37 2.2 Phươngphápnghiêncứu 39 2.2.1 Phânlậpvinấmbiển .39 2.2.2 ĐánhgiáhoạttínhkhángVSVkiểmđịnhcủacácchủngvinấmbiển 39 2.2.3 Phântíchcặnchiếtcủacácchủngvi nấmcóhoạt tínhkhángsinhcao 39 2.2.4 Xácđịnhđặcđiểmhìnhtháivàphânloạivinấm biển 40 2.2.5 Xácđịnhđiều kiệnlênmenrắnthíchhợpchosinhtổnghợp chấtkháng sinhcủavinấmbiển 42 2.2.6 Phântáchcáchợpchấtchuyểnhóathứcấptừvinấmbiển 42 2.2.6.1 Phântách cáchợpchấttừchủngvinấmA.flocculosus 01NT.1.1.5 43 2.2.6.2 Phântách cáchợpchấttừchủngvinấmAspergillussp.01NT.1.12.3 43 2.2.6.3 Phântáchcáchợpchấttừ chủngvinấmP.chrysogenum045-357-2 44 2.2.7 Xácđịnhcấutrúchóahọccủacáchợpchấtchuyểnhóathứcấptừvinấmbiển 44 2.2.8 Xác địnhhoạt tínhsinhhọccủacáchợpchấtchuyểnhóathứcấptừvi nấmbiển 45 2.2.8.1 Xácđịnh hoạttínhkháng VSVkiểmđịnh 45 2.2.8.2 Xácđịnh hoạttínhgâyđộctếbào 45 2.2.8.3 Xácđịnh hoạttínhchốngoxyhóa 46 2.2.8.4 Xácđịnhhoạttínhbảovệtếbàothầnkinh 47 2.2.9 Xửlýsốliệu nghiêncứu .47 2.2.10 Sơđồnghiêncứutổngquáttrongluậnán 48 CHƯƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU 49 3.1 Phânlập vàsànglọchoạttínhkhángVSVkiểm định củavinấm biển 49 3.1.1 Sốlượngchủng vinấmbiểnthunhậntheođịađiểmvànguồn phânlập 49 3.1.2 Đặcđiểmhìnhtháicủa vinấmbiển 50 3.1.3 HoạttínhkhángVSVkiểm địnhcủavinấmbiển 58 3.2 Phântíchcặnchiếtthơvàxácđịnhđặcđiểmphânloạicủa08chủng vinấm biểntuyểnchọn 62 3.2.1 Phântíchcặnchiếtthơcủa08chủngvi nấmbiểntuyểnchọn 62 3.2.2 Xácđịnhđặcđiểmhìnhtháivàphânloại08chủngvinấmbiểntuyểnchọn 64 3.3 Xác định điều kiện lên men rắn thích hợp cho sinh tổng hợp chất khángsinhcủa 03chủngvinấmbiểntuyển chọn 71 3.3.1 Khảosátthờigianlênmen .71 3.3.2 Khảosátnồngđộmuốibiển .73 3.3.3 KhảosátpHbanđầu .76 3.4 Tách chiết, tinh xác định cấu trúc hợp chất chuyển hóa thứcấptừchủngvinấmbiểntuyểnchọn 78 3.4.1 Táchchiết,tinhsạchvàxácđịnhcấutrúccáchợpchấttừchủngvinấm A.flocculosus01NT.1.1.5 .78 3.4.2 Táchchiết,tinhsạchvàxácđịnhcấutrúccáchợpchấttừchủngvinấm Aspergillussp.01NT.1.12.3 89 3.4.3 Táchchiết,tinhsạchvàxácđịnhcấutrúccáchợpchấttừchủngvinấm P.chrysogenum045-357-2 94 3.5 Xácđịnhhoạttínhsinhhọccủa14hợpchấtchuyểnhóathứcấptừ03 chủngvi nấm biểntuyểnchọn .97 3.5.1 XácđịnhhoạttínhkhángVSVkiểmđịnh 97 3.5.2 Xácđịnhhoạttínhgâyđộctếbào 100 3.5.3 Xácđịnhhoạttínhchốngoxyhóa 100 3.5.4 Xácđịnhhoạttínhbảovệtếbàothầnkinh 102 CHƯƠNG4.THẢO LUẬNKẾTQUẢ .103 4.1 Hình thái hoạt tính kháng VSV kiểm định vi nấm biển miềnTrungViệtNam 103 4.2 Đặc tính chủng vi nấmbiển có tiềm sinh tổng hợp hoạtchất sinh học 105 4.3 Điềukiệnlênmenrắnthíchhợpchosinhtổnghợpchấtkhángsinhcủa vinấmbiển 107 4.4 Cáchợpchấtchuyểnhóathứcấptừ03chủngvinấmbiểntuyểnchọn.110 4.5 Hoạt tính sinh học 14 hợp chất thu nhận từ 03 chủng vi nấm biểntuyểnchọn 115 4.5.1 HoạttínhkhángVSVkiểm định 115 4.5.2 Hoạttínhgâyđộctếbào,chống oxyhóavàbảo vệtếbàothầnkinh 116 KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ .119 DANHMỤCCƠNGTRÌNHCỦATÁC GIẢ 121 TÀILIỆU THAMKHẢO 123 DANHMỤCCÁCPHỤLỤC 150 DANHMỤCCÁCKÝHIỆU VÀCHỮVIẾTTẮT Chữviếtt ACHN A-549 ADN ATCC BGCs BGC-823 CFU CC CLSI COSY DPPH DU-145 ESI-MS 13 C-NMR H1N1 H3N2 HeLa HCT-15 HCT-116 HL-60 HMBC H-NMR HPLC HSQC TiếngAnh TiếngViệt Renalcarcinomacells Adenocarcinomichumanalveolar basalepithelialcells AcidDeoxyribonucleic AmericanTypeCultureCollection Biosyntheticgeneclusters Gastricadenocarcinomacellline ColonyFormingUnits Chromatographycolumn TheClinical&Laboratory StandardsInstitute Correlation spectroscopy Tếbàoungthư biểumôthận Tếbàoungthưphổi 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Prostaticcarcinomacellline Electronsprayionzationmass spectroscopy 13 C-Nuclearmagneticresonance spectroscopy InfluenzaA virussubtypeH1N1 InfluenzaA virussubtypeH N HeLacellline Humancoloncancercellline Humancoloncancercellline Humanleukemiccellline Heteronuclearmultiple bond correlation H-Nuclearmagneticresonance spectroscopy Highperformanceliquid chromatography Heteronuclearsinglequantum coherence Axitdeoxyribonucleic Bảotànggiốngchuẩn HoaKỳ Nhómgensinhtổnghợp Tếbàoungthưdạdày Đơnvịhìnhthành khuẩnlạc Sắckýcộtthường ViệnTiêuchuẩnLâmsàngvà Xétngiệm Phổtươngtác haichiềuđồng hạtnhân Tếbàoungthư tuyếntiềnliệt Phổkhốilượngphun mùđiện tử Phổcộng hưởngtừhạtnhân carbon13 Viruscúm AH N Viruscúm AH N Tếbàoungthư cổtửcung Tếbàoungthưđạitràng Tếbàoungthư đạitràng Tếbàoungthưbạch cầu Phổtươngtác đaliên kếthai chiềudịnhân Phổcộng hưởngtừhạtnhân proton Sắckýlỏngcaoáp Phổtươngtáchaichiềudịhạt nhân Chữviếtt HT-29 TiếngAnh Colorectaladenocarcinoma cell line IR Infraredspectroscopy ITS Internaltranscribedspacer K-562 Humanleukemiccellline LF Liquidfermentation M-CSF Macrophagecolonystimulating factor MCF-7 Humanbreastcarcinomacellline MDA-MB- Humanbreastcarcinoma cellline 231 MHB MuellerHintonBroth MIC Minimuminhibitoryconcentration MRSA Methicillin-resistant Staphylococcusaureus MS Massspectroscopy NCI-H23 Humanlungcancercellline NCI-H460 Humanlungcancercellline Neuro2a Neuralcellline NOESY Nuclearoverhausereffect spectroscopy NMR Nuclearmagneticresonance NUGC-3 Gastricadenocarcinomac e l l line OSMAC One-Strain-Many-Compounds PC-3 Prostaticcarcinomacellline RAW264.7 Leukemiacellline rDNA RibosomalDNA RIdetector RefractiveIndexdetector ROESY Rotatingframenuclearoverhauser effectspectroscopy ROS Reactiveoxygenspecies RYE Riceyeastextractmedium SmF Submerged fermentation TiếngViệt Tếbàoungthưđạitrựctràng Phổhấpphụhồng ngoại Vùngđượcphiênmãnộibộ Tếbàoungthưbạch cầu Lênmenlỏng Nhântốkíchthíchđạithực bào Tếbàoungthưvú Tếbàoungthư biểumơtuyến vú MơitrườngcanhMuellerHinton Nồngđộứcchếtốithiểu Staphylococcusaureuskháng methicillin Phổkhối Tếbàoungthư biểumôphổi Tếbàoungthưphổi Tếbàothần kinh PhổNOESY Cộnghưởng từhạtnhân Tếbàoungthưbiểumôdạdày Mộtchủng–Nhiềuhợpchất Tếbàoungthư tuyếntiềnliệt Tếbàoungthưbạchcầu ADNribosom Đầudịkhúcxạ PhổROESY Gốcoxytựdo Mơitrườnggạovàdịchchiết nấmmen Lênmenchìm