Thông tin tài liệu
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ MẠNH DŨNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG 2’-FUCOSYLLACTOSE VÀ LACTON-NEOTETRAOSE TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2021 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ MẠNH DŨNG Mã sinh viên: 1601145 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG 2’-FUCOSYLLACTOSE VÀ LACTON-NEOTETRAOSE TRONG THỰC PHẨM BỔ SUNG BẰNG LC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Cao Công Khánh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia HÀ NỘI - 2021 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Cao Công Khánh– người thầy trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ nhiệt tình anh chị Khoa Nghiên cứu phát triển - Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc, DS Vũ Thị Thanh An thầy giáo Bộ mơn Hóa Phân tích Độc chất trình em thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Khoa Nghiên cứu phát triển - Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Và cuối em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình bạn bè người ln động viên, giúp đỡ em q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2021 Sinh viên Ngô Mạnh Dũng MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .2 Thực phẩm bổ sung dạng sữa Tổng quan HMOs 1.2.1 Cấu trúc thành phần 1.2.2 Tác dụng HMOs 1.2.3 Tổng quan chất phân tích 2’-FL LNnT Tổng quan phương pháp LC-MS/MS 12 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Đối tượng nghiên cứu 15 Nguyên liệu thiết bị 15 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 15 2.2.3 Chất chuẩn 16 Nội dung nghiên cứu 16 Thẩm định phương pháp 17 2.4.1 Độ đặc hiệu 17 2.4.2 Khoảng tuyến tính, khoảng xác định 17 2.4.3 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 18 2.4.4 Độ lặp lại độ tái lặp nội 18 2.4.5 Độ 18 Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng 18 Phương pháp xử lý số liệu 18 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19 Xây dựng phương pháp phân tích .19 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 19 3.1.2 Khảo sát, tối ưu điều kiện xử lý mẫu 21 Thẩm định phương pháp 23 Kết phân tích mẫu thực tế 29 Bàn luận 30 3.4.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30 3.4.2 Xây dựng phương pháp phân tích LC-MS/MS 30 3.4.3 Thẩm định phương pháp 31 3.4.4 Ứng dụng 31 PHỤ LỤC .38 PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC MẪU ĐƯỢC PHÂN TÍCH BẰNG LC-MS/MS 39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh hàm lượng chất dinh dưỡng HMOs sữa mẹ sữa bò[30] .3 Bảng 1.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HMOs 10 Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích 17 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS để phân tích 2’-FL, LNnT 19 Bảng 3.2 Gradient dung môi nồng độ 20 Bảng 3.3 Kết hiệu xuất thu hồi sau quy trình kháo sát dung mơi chiết mẫu 22 Bảng 3.4 Độ đặc hiệu 2’-FL, LNnT 26 Bảng 3.5 Kết giới hạn phát - Giới hạn định lượng 27 Bảng 3.6.Kết độ lặp lại 2’-FL, LNnT TPBS dạng bột 28 Bảng 3.7.Kết độ tái lặp nội 2’-FL, LNnT TPBS dạng bột 28 Bảng 3.8 Kết độ thu hồi 2’-FL, LNnT TPBS dạng bột 29 Bảng 3.9 Kết phân tích hàm lượng HMOs mẫu thực tế 29 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 a - Các tiểu đơn vị cấu trúc nên HMOs Hình 1.2 Liên kết hình thành HMOs từ 05 monosaccharide .5 Hình 1.3 Cấu trúc 2’-FL Hình 1.4 Cấu trúc LNnT Hình 1.5 Cấu tạo thiết bị khối phổ 13 Hình 3.1 Sắc ký đồ tổng TIC dung dịch chuẩn mix chất 2’-FL, LNnT phân tích hai cột HILIC amid 20 Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hiệu suất thu hồi dung mơi chiết mẫu 22 Hình 3.3 Quy trình chiết làm mẫu 23 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thực, mẫu trắng thêm chuẩn 2’-FL 24 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thực, mẫu trắng thêm chuẩn LNnT .25 Hình 3.5 Đường chuẩn 2’-FL 27 Hình 3.6 Đường chuẩn LNnT 27 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AOAC Association of Official Analytical Collaboration Hiệp hội hợp tác phân tích thức CE Collision energy Năng lượng va chạm DP Declustering potential Thế phân mảnh ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử GC Gas chromatography Sắc ký khí High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ hai lần LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Qualification Giới hạn định lượng Mass spectrometry Khối phổ Human Milk Oligosaccharides Oligosaccharide sữa mẹ R Recovery Hiệu suất thu hồi RI Refractive Index Khúc xạ RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chệch chuẩn tương đối SMPR Standard Method Performance Requirements Yêu cầu hiệu phương pháp chuẩn HPLC LC-MS/MS MS HMOs TPBVSK TPBS Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Thực phẩm bổ sung Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ĐẶT VẤN ĐỀ Trong sống đại, thực phẩm bổ sung (TPBS) dạng sữa sử dụng phổ biến, xuất gia đình ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe người sử dụng, đặc biệt trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Nhờ phát triển khoa học kĩ thuật, TPBS dạng sữa ngày cải thiện cách bổ sung thành phần dinh dưỡng, thiết yếu để đạt công thức gần với sữa mẹ nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng vừa đáp ứng mục tiêu hoàn thiện miễn dịch trẻ nhỏ Vào cuối kỉ XIX, số nhà khoa học phân tích phát nhóm oligosaccharid có mặt sữa mẹ, đặc biệt sữa non, thường gọi oligosaccharid từ sữa mẹ (HMOs) Kể từ nhiều nghiên cứu tác dụng HMOs làm tăng cường hệ thống miễn dịch, hoạt động chất kháng khuẩn tự nhiên, prebiotic người Với tiềm lớn chức sinh lý thế, nhà sản xuất sữa nghiên cứu đưa thêm nhiều loại HMOs với nhiều hàm lượng khác vào thành phần TPBS dạng sữa Tuy nhiên, nguy gian lận thương mại TPBS dạng sữa hữu mà Việt Nam chưa có phương pháp phân tích xác định hàm lượng HMOs Để góp phần hồn thiện quy trình phân tích, đảm bảo chất lượng cho thực phẩm bổ sung chứa HMOs, với hai chất có tỷ lệ lớn 2'-fucosyllactose Lacto-Nneotetraose phân tích, nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài: “Xác định hàm lượng 2’-fucosyllactose lacto-N-neotetraose thực phẩm bổ sung sắc ký lỏng hiệu cao.” với mục đích sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 2'-fucosyllactose Lacto- N -neotetraose thực phẩm bổ sung mẫu sữa bột theo yêu cầu AOAC Áp dụng phương pháp để phân tích hàm lượng 2'-fucosyllactose Lacto- N -neotetraose số thực phẩm bổ sung thị trường Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Thực phẩm bổ sung dạng sữa Theo định nghĩa Bộ Y tế, “Thực phẩm bổ sung” thực phẩm thông thường bổ sung vi chất dinh dưỡng, bao gồm: Các vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzyme, probiotic chất có hoạt tính sinh học khác [3] Thực phẩm bổ sung bao gồm cả: Thực phẩm tăng cường vi chất dinh dưỡng; Thực phẩm làm giàu vi chất; Thức ăn công thức cho trẻ em phụ nữ mang thai Một loại thực phẩm bổ sung phổ biến phải kể đến sữa Sữa loại thức uống dinh dưỡng phổ biến coi mặt hàng thiết yếu sống Ở Việt Nam, phát triển ngành công nghiệp sữa ngày lớn với vô số mặt hàng đa dạng chế biến từ sữa sữa tươi, sữa bột, sữa trùng, sữa hoàn nguyên Theo tập đoàn nghiên cứu thị trường Euromonitor International, sản lượng tiêu thụ sữa sản phẩm từ sữa Việt Nam đạt 1.76 triệu (+8.6%) năm 2020 [4] Với điều kiện kinh tế phát triển với nhu cầu bổ sung dinh dưỡng trọng sau đại dịch Covid-2019, sữa lựa chọn hàng đầu cho lứa tuổi đặc biệt trẻ sơ sinh quan tâm Theo nhận định Euromonitor, người tiêu dùng Việt Nam ngày am hiểu an toàn, dinh dưỡng thực phẩm dần trở nên khắt khe sản phẩm sữa dành cho trẻ sơ sinh phải có dưỡng chất cao cấp sản phẩm truyền thống trước Với nhu cầu tiềm lớn thế, hãng sản xuất sữa liên tục nghiên cứu sản phẩm sữa mang tính đột phá dành riêng cho trẻ sơ sinh, thu hẹp khoảng cách với sữa mẹ tự nhiên Lịch sử ngành dinh dưỡng nhi toàn cầu chứng kiến hai cách mạng lớn cột mốc bổ sung sắt (1959) Docosa Hexaenoic Acid (DHA) (2014) vào sữa cơng thức Tiếp nối hai thành tựu đó, với phát triển công nghệ khoa học, nhà khoa học đưa thêm chất chiếm tỉ lệ hàm lượng cao nhóm Human Milk Oligosaccharides (HMOs) 2’-fucosyllactose (2’-FL) vào sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh Nhận thấy tiềm lớn chức HMOs tăng cường hệ thống miễn dịch trẻ, hoạt động chất kháng khuẩn tự nhiên, nhiều tác dụng có lợi phát triển miễn dịch nên hãng sản xuất sữa Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC MẪU ĐƯỢC PHÂN TÍCH BẰNG LC-MS/MS 1.1 Sắc ký đồ độ lặp lại 1.2 Sắc ký đồ LOD 39 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH LC-MS/MS Bảng 1: Độ lặp lại độ tái lặp nội 2’-FL LNnT Nền mẫu ST T mẫ u Khối lượng cân (g) 2FL 10 11 12 0,4721 0,4723 0,5015 0,5124 0,5105 0,5010 0,4952 0,5020 0,5111 0,5099 0,5001 0,4999 Thể tích định mức (mL) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 59 LNn T 10 11 12 0,4721 0,4723 0,5015 0,5124 0,5105 0,5010 0,4952 0,5020 0,5111 0,5099 0,5001 0,4999 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Hệ số pha lỗng Tín hiệu 1 1 1 1 1 1 535,92 546,48 569,50 581,50 591,82 594,19 558,11 594,23 623,30 603,89 551,39 586,08 RSDR (n=12) 312,48 362,00 383,29 404,83 389,75 389,98 391,70 390,57 404,93 383,28 361,67 311,48 RSDR (n=12) Trun Nồng Hàm g độ RSD lượng bình (ng/mL (%) (µg/g) (mg/g ) ) 4108 435 4185 443 4354 434 0,44 1,69 4443 434 4518 443 4536 453 41 431 4536 452 4750 465 0,45 3,45 4607 452 4221 422 4476 448 2,68% 740 86,2 834 88,4 875 87,3 0,09 1,36 916 89,5 887 87,0 888 88,7 891 90,1 889 88,6 916 89,7 0,09 2,92 875 85,9 834 83,4 738 88,6 2,14 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng Kết độ thu hồi 2’FL LNnT Nền mẫu 2-FL Sữa bột level LNnT sữa bột level 2-FL sữa bột level LNnT sữa bột level Khối Cspk V Thể Hệ lượng (µg/mL) spk tích số cân (mL) định pha (g, ml) mức lỗng (ml) 5,0125 1054 50 5,0026 1054 50 5,0014 1054 50 5,0039 1054 50 5,0096 1054 50 5,0034 1054 50 5,0125 725 50 5,0026 725 50 5,0014 725 50 5,0039 725 50 5,0096 725 50 5,0034 725 50 5,0049 1544 0,2 50 5,0101 1544 0,2 50 5,0851 1544 0,2 50 5,0089 1544 0,2 50 5,0092 1544 0,2 50 5,0036 1544 0,2 50 5,0049 1029 0,2 50 5,0101 1029 0,2 50 5,0851 1029 0,2 50 5,0089 1029 0,2 50 5,0092 1029 0,2 50 5,0036 1029 0,2 50 Tín hiệu Nồng độ (ng/ml) 2899,0 56,0 2529,8 2689,7 2989,9 2501,4 7462,6 7642,5 7740,3 7559,9 7370,9 7428,3 830,4 740,92 840,41 1004,0 913,42 887,96 2028,4 1941,4 2142,7 2162,1 1950,7 2012,7 21471,6 20420,5 18758,9 19933,9 22139,5 18549,7 14392,5 14735,9 14922,6 14578,3 14217,4 143,0 61,49 5613,98 6345,09 7547,10 6881,56 6694,48 4016,17 3850,09 4234,56 41,55 3867,95 3986,21 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Hàm lượng (µg/g) Hiệu suất (%) 214,2 102 203,7 99,9 187,1 98,9 198,8 101 220,8 101 185,0 98,8 143,6 99 147,0 101,6 148,9 102,9 145,4 101 141,8 98,0 142,9 98,8 62,6 102 56,0 101 63,3 102 75,3 99,4 68,6 101 66,8 101 40,1 100 38,4 99,0 42,2 102 42,6 98,8 38,6 98,9 39,8 97,8 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nghiên cứu khoa học Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide từ sữa mẹ (HMOs) thực phẩm bổ sung kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Nguyễn Thị Hồng Ngọc1*, Mạc Thị Thanh Hoa1, Trần Hùng Sơn1, Ngô Mạnh Dũng2 Cao Công Khánh1, Vũ Thị Thanh An1, Phạm Thị Thanh Hà2, Lê Thị Hồng Hảo1 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Hà Nội, Việt Nam Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 25/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 19/3/2021) Tóm tắt Kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần ứng dụng nhằm nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng số oligosaccharide từ sữa mẹ (Human Milk Oligosaccharides - HMOs) gồm 2’-Fucosyllactose (2’-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT), 3’-Siallylactose (3’-SL) 6’-Siallylactose (6’-SL) thực phẩm bổ sung dạng bột dạng lỏng Hệ pha động sử dụng gồm kênh: kênh A (dung dịch acid formic 0,1%) kênh B (acetonitril) kết nối với cột phân tích HILIC (1,7 μm; 2,1 × 150 mm) thơng qua detector khối phổ cho thời gian phân tích ngắn, 10 phút xác định đồng thời 05 chất thuộc nhóm HMOs Phương pháp thẩm định cho thấy độ xác cao, nhanh, hiệu áp dụng vào phân tích mẫu thị trường cho thấy khả ứng dụng cao thực tế Giới hạn phát giới hạn định lượng cho chất 2’-FL, LNnT, LNT, 3’-SL, 6’-SL tương ứng 4,0 mg/kg 10,0 mg/kg Khoảng tuyến tính phương pháp nằm khoảng từ 0,4 - 40 Mg/mL Các thông số thẩm định khác bao gồm độ (R% 98,8 - 103 %); độ xác (RSD% 1,69 - 5,54 %) đáp ứng theo yêu cầu AOAC Quy trình áp dụng vào thực tế phân tích 25 mẫu thực phẩm bổ sung (TPBS) thị trường cho kết tổng HMOs mẫu TPBS dạng bột khoảng 0,1 - 0,3 g/100g TPBS dạng lỏng khoảng 0,01 - 0,03 g/100mL Từ khóa: 2’-Fucosyllactose (2’-FL), Lacto-N-neotetraose (LNnT), Lacto-N-tetraose (LNT), 3’-Siallylactose (3’-SL), 6’-Siallylactose (6’-SL); HMOs; Thực phẩm bổ sung; HPLC; LC-MS/MS I ĐẶT VẤN ĐỀ Oligosaccharide từ sữa mẹ (Human Milk Oligosaccharide - HMOs) nhóm sinh khối dồi thứ ba sau đường sữa lipid, đạt từ đến 20 g/L sữa mẹ [1] Có tới 1% HMOs hấp thu đường tiêu hóa tìm thấy tuần hồn tồn thân Sự đa dạng phong phú có người khơng thấy động vật có vú khác Hàm lượng HMOs phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: giai đoạn tiết sữa, chế độ dinh dưỡng người mẹ, khuynh hướng di truyền chí khu vực địa lý - thổ nhưỡng môi trường kinh tế xã hội Mặc dù HMOs cấu tạo từ 05 loại monosacaride bản, độ phức tạp cấu trúc HMOS sữa mẹ phong phú đa dạng Hiện nay, 200 loại oligosaccharide khác mặt cấu trúc tìm thấy, có 19 chất thuộc nhóm HMOs mô tả Tel: 0975565542 * Email: hngoc1710@gmail.com Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 73 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide xác định cấu trúc Năm loại monosaccharide hình thành cấu trúc HMOs gồm có glucose (Glc), galactose (Gal), N-Acetyl-Glucosamine (GlcNAc), furcose (Fuc) acid sialic (Neu5Ac) [2-3] Hình Dựa cấu trúc cấu tạo, HMOs xem prebiotic với tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm Tác dụng HMOs sức khỏe phát triển trẻ nhỏ mô tả tổng quát hoạt tính prebiotic, hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, hỗ trợ phát triển đường tiêu hóa… [3-4] Do đó, thị trường xuất nhiều sản phẩm bổ sung chất thuộc nhóm HMOs công thức bào chế Tuy nhiên, Việt Nam chưa có phương pháp phân tích xác định hàm lượng HMOs bổ sung vào sản phẩm thực phẩm bổ sung Vì vậy, việc phát triển phương pháp phân tích để kiểm sốt sản phẩm thị trường điều cần thiết Hình Liên kết hình thành HMOs từ 05 monosaccharide [2] Cho đến nay, có nhiều nghiên cứu xác định chất thuộc nhóm HMOs mẫu khác với kỹ thuật đa dạng Các kỹ thuật liệt kê như: kỹ thuật sắc ký mỏng (TLC), đo góc quay cực, sắc ký lỏng kết hợp với nhiều loại detector khác [10-12] Trong kỹ thuật sắc ký mỏng đo góc quay cực chủ yếu sử dụng để xác định độ tinh khiết nguyên liệu, không áp dụng cho dạng thành phẩm bán thành phẩm Kỹ thuật sắc ký lỏng với nhiều loại detector khác sử dụng rộng rãi để xác định thành phần thành phẩm bán thành phẩm Các hình thức phát định lượng đa dạng từ phân tích trực tiếp RI [5], ELSD [6], HPAEC [7-9] MS/MS Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 74 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo [10] đến phân tích gián tiếp PDA FLD [7] Các phương pháp nêu sử dụng hóa chất thiết bị thơng thường để tiến hành phân tích, hầu hết phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Việt Nam Phương pháp HPLC với detector FLD đơn giản có khả ứng dụng rộng q trình phân tích cần sử dụng dẫn xuất tạo huỳnh quang, có thêm phần sai số ảnh hưởng hiệu suất dẫn xuất Trong đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần phương pháp cho độ nhạy tốt nhất, đồng thời có triển vọng để phát triển phân tích đồng thời nhiều chất nhóm HMOs trực tiếp phân tích mà khơng cần thêm bước dẫn xuất Nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa q trình phân tích 05 chất thuộc nhóm HMOs gồm Glc, Gal, GlcNAc, Fuc Neu5Ac thiết bị LC-MS/MS Trong đó, dung mơi chiết số bước làm khảo sát để loại bỏ tối đa ảnh hưởng mẫu đến trình phân tích Các điều kiện phân tích tối ưu hóa tự động thiết bị LC-MS/MS để thu liệu mảnh phổ phân tích Phương pháp thẩm định để xác nhận giá trị sử dụng áp dụng thử nghiệm thực tế để phân tích mẫu TPBS thu mua thị trường II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.1.1 Thiết bị dụng cụ Thiết bị sử dụng q trình phân tích hệ thống sắc ký lỏng Acquity kết nối với khối phổ tứ cực Xevo TQD hang Waters, Mỹ Cột phân tích mẫu cột XBridge HILIC (3,5 μm, 2,1 mm × 150 mm) chất silica cột BEH Glycan Amide (1,7 μm, 2,1 × 150 mm) Ngồi ra, nghiên cứu sử dụng số thiết bị phụ trợ dụng cụ thơng thường khác phịng thí nghiệm 2.1.2 Hóa chất, chất chuẩn: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm: Chuẩn 2’- fucosyllactose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, 3’-sialylactose, 6’-sialylactose Carbosynth với độ tinh khiết ≥ 98,0 % Một số hóa chất khác sử dụng q trình phân tích xứ lý mẫu: Nước cất hai lần khử ion, methanol, chloroform, acetonitri, bột làm C18, bột carbon graphit - Agilent, Mỹ, K4Fe(CN)6.3H2O (tinh khiết phân tích), Zn(CH3COO)2 (tinh khiết phân tích), acid trichloroacetat (tinh khiết phân tích) 2.2 Mẫu nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: 25 thực phẩm bổ sung (TPBS) có chứa HMOs lấy ngẫu nhiên thị trường Hà Nội, cụ thể bao gồm 15 mẫu TPBS dạng bột 10 mẫu TPBS dạng lỏng - Lựa chọn mẫu trắng: áp dụng quy trình phân tích lựa chọn tiến hành phân tích số mẫu TPBS khơng chứa thành phần cung cấp HMOs Chọn mẫu trắng mẫu khơng có tín hiệu trùng với thời gian lưu chất phân tích mẫu chuẩn 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát xây dựng quy trình phân tích * Khảo sát tối ưu hóa q trình phân tích khối phổ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 75 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide - Để tối ưu hóa điều kiện phân tích khối phổ, dung dịch chuẩn 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL chuẩn bị nồng độ µg/mLvà tiến hành tối ưu hóa tự động thiết bị Xevo TQD hãng Waters để thu điều kiện mảnh phổ chất phân tích - Đối với trình tách sắc ký, loại cột lựa chọn khảo sát gồm: Cột BEH Glycan Amide (1,7 μm, 2,1 × 150 mm) cột HILIC (3,5 μm, 2,1 × 150 mm) chất silica, dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm chất 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL phân tích với hệ pha động bao gồm kênh A: acid formic 0,1% kênh B: acetonitril * Khảo sát quy trình chiết làm mẫu: Mẫu sau cân với lượng thích hợp (2 – g) vào ống ly tâm 50 mL, thêm chuẩn mức nồng độ µg/mL, bổ sung thêm 40 mL dung môi thuốc thử chiết mẫu; hệ dung môi thuốc thử khảo sát bao gồm: (1) thuốc thử Cazzer, (2) acid trichloroacetat 1% nước, (3) hệ dung môi chloroform : methanol (3:1, v/v), (4) dung môi methanol 100% Sau chiết, mẫu ly tâm định mức vừa đủ 50 mL dịch chiết phân tích LC-MS/ MS để đánh giá độ thu hồi Đối với quy trình làm sạch, sau lựa chọn dung mơi chiết thích hợp, hút xác 1,0 mL dịch chiết khảo sát làm loại bột SPE khác nhau: bột carbon graphit bột C18 Ly tâm 13.000 vịng/phút, lấy phần dịch trong, phân tích LC-MS/MS đánh giá độ thu hổi 2.3.2 Thẩm định phương pháp Phương pháp thẩm định theo yêu cầu AOAC với thông số mẫu TPBS dạng lỏng dạng bột, bao gồm độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ thu hồi, giới hạn phát giới hạn định lượng 2.3.3 Phân tích mẫu thực tế Sau q trình khảo sát điều kiện phân tích, quy trình áp dụng để phân tích chất HMOs 25 mẫu TPBS thu thập III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Dựa số tài liệu tham khảo [5-8] tính chất phân cực nhóm HMOs [1], 02 loại cột HILIC cột Amide lựa chọn để khảo sát điều kiện tách sắc ký lỏng chất phân tích Ngồi ra, mẫu TPBS dạng lỏng dạng bột thường chứa hàm lượng lớn protein, lipid, vitamin, khoáng chất, bước chiết làm mẫu trước phân tích LC-MS/MS cần thiết 3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký Qua tham khảo tài liệu [7-8], [10] kết hợp với tiến hành khảo sát, điều kiện sắc ký để xác định đồng thời HMOs lựa chọn sau: - Cột HILIC (3,5 μm; 2,1 × 150 mm) cột BEH Glycan amide (1,7 μm; 2,1 mm × 150 mm) trước cột bảo vệ amide BEH (1,7 μm; 2,1 mm × 50 mm) - Pha động: acetonitril: acid formic - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 76 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo - Thể tích tiêm mẫu: 10 µL - Chương trình gradient (như Bảng 1) Bảng Chương trình gradient phân tích HMOs Thời gian (min) 0,0 2,0 2,5 7,5 8,0 10,0 Kênh A (acid formic 0,1%) 40 40 80 80 40 40 Kênh B (acetonitril) 60 60 20 20 60 60 Kết sắc ký khảo sát khả phân tách chất phân tích sử dụng cột HILIC Amide thể Hình Kết cho thấy, sắc ký đồ tổng (TIC) dung dịch chuẩn phân tích cột HILIC cho thời gian lưu, thời gian phân tích khả tách tốt so với cột amide Validation_std _3 1: MRM of 27 Channels ESTIC 7.85e5 3.83 HILIC % 100 3.62 20201114-std 100 1.00 2.00 3.00 3.94 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 0.86 9.00 MRM of 22 Channels ESTIC 7.91e5 Amide 0.89 % 0.82 0.75 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Time Hình Sắc ký đồ tổng TIC dung dịch chuẩn hỗn hợp chất 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL 3.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Các mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp 05 chất gồm: 2’-FL, LNT, LNnN, 3’- SL, 6’-SL nồng độ µg/mL Sau tiến hành khảo sát điều kiện chiết mẫu sử dụng 04 dung dịch chiết khảo sát gồm: thuốc thử Carrez, dung dịch TCA 1%, methanol, CHCl3: MeOH (3 : 1,v/v) Kết độ thu hồi trình bày Bảng Bảng Kết hiệu suất thu hồi sau quy trình kháo sát dung môi chiết mẫu Dung môi 2-FL LNT LNnT 3-SL 6-SL Carrez 84,7% 87,7% 93,9% 94,3% 94,9% TCA 1% 95,5% 93,5% 99,1% 91,0% 92,7% CHCl3 : MeOH 99,0% 98,8% 98,0% 98,8% 99,6% MeOH 88,5% 93,7% 90,1% 99,4% 92,1% Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 77 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide Bảng cho thấy với dung môi hỗn hợp CHCl3 : MeOH (3 : 1,v/v) hiệu suất thu hồi cao nên hỗn hợp dung môi CHCl3 : MeOH (3 : 1, v/v) lựa chọn cho bước khảo sát 3.3 Khảo sát điều kiện làm Các dịch chiết mẫu thu sau trình xử lý với hỗn hợp CHCl3: MeOH (3:1, v/v) tiếp tục làm 0,15 g bột C18 0,15 g than hoạt tính để loại bỏ thành phần cịn lại vi khoáng, chất tạo hương, chất tạo màu, Kết thu Hình Hình Kết hiệu suất thu hồi sau trình làm Kết khảo sát Hình cho thấy, sau làm với bột than hoạt tính, hiệu suất thu hồi giảm xuống đồng thời dịch làm màu so với mẫu làm bột C18 Chính thế, bột làm C18 lựa chọn để làm sau trình tách chiết trước tiến hành phân tích thiết bị LC-MS/MS Như vậy, sau bước khảo sát, quy trình phần tích số HMOs (2’-FL, LNT, LNnT, 3’SL, 6’SL) gồm bước sau: cân xác 2-5 g mẫu vào ống ly tâm 50 mL, thêm khoảng 35 mL dung môi chiết CHCl3: MeOH (3:1, v/v), lắc ngang 30 phút; Ly tâm lấy dịch trong, định mức vừa đủ 50 mL; lắc lọc qua giấy lọc thu dịch lọc; hút xác mL dịch lọc vào ống d-SPE chứa sẵn 0,15 g bột làm C18, lắc vortex phút, ly tâm 13.000 vòng/phút phút; thu dịch vào lọ đựng mẫu phân tích thiết bị LC-MS/MS 3.4 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 3.4.1 Độ đặc hiệu Tiến hành phân tích theo điều kiện sắc ký lựa chọn với mẫu dung dịch chuẩn nồng độ µg/mL, mẫu trắng mẫu trắng có thêm chuẩn Kết thu cho thấy, thời gian lưu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu thêm chuẩn giống với mẫu chuẩn, sắc đồ mẫu trắng khơng xuất píc khoảng thời gian lưu chất phân tích mẫu chuẩn Hình Dựa số mảnh mẹ mảnh chất phân tích, số điểm IP thu Bảng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 78 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES487.16 > 324.982 2.686e+004 2FL 3.65 5485.71 26862.00 100 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 100 % % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES487.16 > 204.91 4.074e+004 2FL 3.64 8513.50 40743.00 100 F2:MRM of 10 channels,ES706.223 > 112.854 5.733e+004 LNT 3.59 11758.06 57333.00 100 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 9.00 F2:MRM of 10 channels,ES706.096 > 178.907 1.030e+005 LNnT 3.59 21212.60 18759.34 100 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 9.00 F1:MRM of 27 channels,ES632.057 > 290.002 3.845e+005 3-SL 3.84 79635.72 39718.08 100 8.00 % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F2:MRM of 10 channels,ES706.096 > 381.929 8.371e+004 LNnT 3.59 17151.25 83710.00 100 % 0 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 % F2:MRM of 10 channels,ES706.223 > 178.902 7.530e+004 LNT 3.59 15576.53 75298.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES632.057 > 86.788 3.617e+005 3-SL 3.84 75216.32 3600.87 100 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 1.00 2.00 Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 F1:MRM of 27 channels,ES632.121 > 289.941 4.983e+005 6-SL 3.84 105255.28 3842.33 100 3.00 % Validation_std _1 Smooth(Mn,5x5) std Mix L25-L1 F1:MRM of 27 channels,ES632.121 > 86.854 3.315e+005 6-SL 3.84 69730.66 7980.94 100 % 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 Hình Một số sắc kí đồ kết đánh giá độ đặc hiệu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Bảng Độ đặc hiệu 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Chất phân tích 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’-SL Mảnh mẹ Mảnh 487,2 487,2 706,2 706,2 706,9 706,9 632,0 632,0 632,1 632,1 325,0* 205,0 178,9* 112,8 178,9* 381,9 290,0* 86,7 298,9* 86,8 Số điểm IP 4 4 Tỷ lệ ion mẫu thêm chuẩn 0,57 Tỷ lệ ion mẫu chuẩn 0,52 0,82 0,76 0,77 0,75 0,87 0,89 0,90 0,92 Kết Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 79 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide *: Mảnh định lượng : Tỷ lệ ion = mảnh định tính/ mảnh định lượng a 3.4.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Dựa tỷ số tín hiệu/nhiễu dung dịch thêm chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng HMOs thu Bảng Bảng Kết giới hạn phát - Giới hạn định lượng Nền mẫu TPBS dạng bột TPBS dạng lỏng Chất phân tích LOD (mg/kg) LOQ (mg/kg) 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’SL 2’-FL LNT LNnT 3’-SL 6’SL 4,00 2,00 2,00 2,00 2,00 4,00 2,00 2,00 2,00 2,00 10,0 5,00 5,00 5,00 5,00 10,0 5,00 5,00 5,00 5,00 3.4.3 Độ lặp lại độ tái lập nội Thực phân tích mẫu thực chứa 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL Phân tích lặp lại 06 lần để xác định độ lặp lại 10 lần kiểm nghiệm viên để tính độ tái lập hai kiểm nghiệm viên hai ngày khác Kết phân tích độ tái lập nội phương pháp trình bày Bảng Bảng Kết phân tích độ tái lập nội Chất phân tích Hàm lượng Mức yêu cầu Kết Kết luận 2’-FL 0,1% ≤ 8,0% 2,68 Đạt LNT 100 mg/kg ≤ 6,0% 3,97 Đạt LNnT 100 mg/kg ≤ 6,0% 2,14 Đạt 3’-SL 0,1 % ≤ 8,0% 3,89 Đạt 6’-SL 0,1 % ≤ 8,0% 4,19 Đạt Kết thẩm định cho thấy phương pháp có độ lặp tốt: RSD đạt đáp ứng yêu cầu AOAC [7] 3.4.4 Độ thu hồi Độ thu hồi đánh giá thêm chuẩn 02 mức hàm lượng 0,1 g/100 g (hoặc 0,1 g/100 mL) và 100 mg/kg (100 mg/L) 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL vào mẫu TPBS (dạng bột, dạng lỏng) Kết độ thu hồi tóm tắt Bảng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 80 Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo Bảng Kết đánh giá độ thu hồi TPBS dạng bột dạng lỏng Nền mẫu Chất phân tích Mức yêu cầu Kết 2’-FL 95 - 105% 98,8 - 102% LNT 95 - 105% 98,2 - 102% 95 - 105% 98,0 - 103% 3’-SL 95 - 105% 97,5 - 103% 6’-SL 95 - 105% 96,8 - 102% 2’-FL 90 - 107% 99,4 - 102% LNT 90 - 107% 97,6 - 102% 90 - 107% 97,8 - 102% 3’-SL 90 - 107% 97,8 - 103% 6’-SL 90 - 107% 96,4 - 102% 2’-FL 95 - 105% 98,0 - 101% LNT 95 - 105% 100 - 102% 95 - 105% 97,0 - 102% 3’-SL 95 - 105% 98,7 - 103% 6’-SL 95 - 105% 96,2 - 102% 2’-FL 90 - 107% 96,9 - 103% LNT 90 - 107% 97,3 - 101% 90 - 107% 97,8 - 103% 3’-SL 90 - 107% 97,9 - 102% 6’-SL 90 - 107% 95,5 - 102% LNnT TPBS dạng bột LNnT LNnT TPBS dạng lỏng Mức hàm lượng thêm chuẩn LNnT 0,1 g/100 g 100 mg/kg 0,1 g/100 mL 100 mg/L Kết thẩm định cho thấy độ thu hồi đạt theo yêu cầu AOAC 3.4.5 Kết phân tích mẫu thực tế Sau thẩm định đạt yêu cầu AOAC, quy trình phân tích áp dụng để phân tích hàm lượng 05 HMOs 25 mẫu bao gồm 15 mẫu TPBS dạng bột 10 mẫu TPBS dạng lỏng Các mẫu lựa chọn mẫu có cơng bố nhãn chứa thành phần HMOs 2’-FL Kết phân tích trình bày Bảng Bảng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 81 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng số oligosaccharide Bảng Kết phân tích 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu dạng bột Ký hiệu mẫu SB-1 SB-2 SB-3 SB-4 SB-5 SB-6 SB-7 SB-8 SB-9 SB-10 SB-11 SB-12 SB-13 SB-14 SB-15 Hàm lượng Hàm lượng 2’-FL (mg/100g) LNT (mg/100g) 120 115 256 275 162 109 152 147 159 296 243 158 255 201 162 23,0 25,1 14,8 19,8 10,1 36,1 14,9 41,1 22,5 - Hàm lượng LNnT (mg/100g) Hàm lượng 3’SL (mg/100g) Hàm lượng 6’SL (mg/100g) 0,15 0,29 0,95 - 0,85 0,63 0,15 0,54 0,15 - 0,23 0,25 0,62 0,45 0,11 - Ghi chú: “-“: Không phát Bảng Kết phân tích 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL mẫu dạng lỏng Ký hiệu mẫu Hàm lượng 2’-FL (mg/L) Hàm lượng LNT (mg/L) Hàm lượng LNnT (mg/L) Hàm lượng 3’SL (mg/L) Hàm lượng 6’SL (mg/L) SL-1 SL-2 SL-3 SL-4 SL-5 SL-6 SL-7 SL-8 SL-9 SL-10 22,1 15,5 21,1 25,7 23,4 19,2 13,8 21,7 29,6 21,5 1,01 1,12 0,98 1,05 - - - - Ghi chú: “-“: Không phát Như thấy, thị trường, sản phẩm TPBS có bổ sung HMOs công bố nhãn chủ yếu tập trung vào 02 loại HMOs 2’-FL LNT; HMOs 3’-SL 6’-SL không xuất mẫu thực chiếm tỷ lệ nhỏ Tổng hàm lượng HMOs bổ sung vào TPBS dạng bột khoảng 0,1 - 0,3 g/100g, hàm lượng giảm gần 10 lần TPBS dạng lỏng với hàm lượng khoảng 0,01- 0,03 g/100mL Các kết phân tích cho thấy, với sản phẩm có công bố thành phần 2’- FL, Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 82 Tạp chí Kiểm nghiệm An tồn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Mạc Thị Thanh Hoa, Trần Hùng Sơn, Lê Thị Hồng Hảo hàm lượng phân tích phù hợp với công bố nhãn sản phẩm, sản phẩm công bố tổng lượng HMOs đạt từ 85% trở lên so với công bố nhãn Tuy nhiên, chưa có mức hàm lượng khuyến cáo chất nhóm HMOs TPBS, việc kiểm sốt chất lượng cịn gặp nhiều khó khăn IV KẾT LUẬN Phương pháp định lượng đồng thời 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL LC-MS/MS mẫu thực phẩm bổ sung xây dựng thẩm định Phương pháp thẩm định độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chụm, độ đúng, độ không đảm bảo đo Kết phân tích thực tế cho thấy hầu hết mẫu phân tích có kết phù hợp với công bố nhãn nhà sản xuất với hàm lượng 05 chất phân tích khoảng 0,1- 0,3 g/100g TPBS dạng bột, 0,01-0,03 g/100mL với TPPBS dạng lỏng Phương pháp xây dựng đạt yêu cầu để áp dụng phân tích hàm lượng 2’-FL, LNT, LNnT, 3’-SL, 6’SL thực phẩm bổ sung, tiến hành phân tích phịng thử nghiệm có hệ thống LC-MS/ MS phương pháp thường quy TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] American pregnance association, “Breastfeeding Overview” [Online] Availble: https:// americanpregnancy.org/healthy-pregnancy/breastfeeding/breastfeeding-overviewcopy-70904/ [Aceessed 02/19/2020] [2] M H Monaco, J Kim, and S M Donovan, “Human Milk: Composition and Nutritional Value,” Encyclopedia of Food and Health, vol 2016, pp 357-362, 2016 [3] M Li, “Human milk oligosaccharides shorten rotavirus-induced diarrhea and modulate piglet mucosal immunity and colonic microbiota,” ISME Journal, vol 8, no 8, pp 16091620, 2004 [4] A L Morrow, G M Ruiz-Palacios, X Jiang, and D S Newburg, “Human-milk glycans that inhibit pathogen binding protect breast-feeding infants against infectious diarrhea,” Journal of Nutrition, vol 135, no 5, pp 1304-130, 2005 [5] S S Leeuwen, “Challenges and Pitfalls in Human Milk Oligosaccharide Analysis,” Nutrients, vol 11, no 11, pp 2684, 2019 [6] A S Christensen, S H Skov, S E Lendal, and B H Hornshoj, “Quantifying the human milk oligosaccharides 2’-fucosyllactose and 3-fucosyllactose in different food applications by high-performance liquid chromatography with refractive index detection,” Journal of Food Science, vol 85, no 2, pp 332-339, 2010 [7] S Austin, D Cuany, J Michaud, B Diehl, and Begoña Casado, “Determination of 2′-Fucosyllactose and Lacto-N-neotetraose in Infant Formula,” Molecules, vol 23, no 10, pp 2650, 2010 [8] S S van Leeuwen, “Challenges and Pitfalls in Human Milk Oligosaccharide Analysis,” Nutrients, vol 11, no 11, pp 2684, 2019 [9] T R I Cataldi, C Campa, and G E De Benedetto, “Carbohydrate analysis by highperformance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection: The potential is still growing,” Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol 368, no 8, pp 739– 758, 2000 [10] Y Bao, C Chen, and D S Newburg, “Quantification of neutral human milk oligosaccharides by graphitic carbon high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry”, Analytical Biochemistry, vol 433, no 1, pp 28–35, 2013 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn Tạp chí Kiểm nghiệm An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 83 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn
Ngày đăng: 22/08/2023, 01:36
Xem thêm:
