10 Tcn 719-2006.Doc

10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc10 Tcn 719-2006.Doc

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN 10TCN TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 719-2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH NEWCASTLE 10 TCN 719 – 2006 Hà Nội - 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 719 – 2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH NEWCASTLE ngày (Ban hành kèm theo Quyết định số QĐ/BNN-KHCN tháng năm 2006 Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn) Phạm vi áp dụng Quy trình được áp dụng để chẩn đoán bệnh Newcastle gia cầm tại phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật Khái niệm Bệnh Newcastle bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh gà mọi lứa tuổi Gà có những triệu chứng về hơ hấp, tiêu hố thần kinh, tỷ lệ ốm chết cao Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế Virus Newcastle thuộc họ Paramyxoviridae phân nhóm PMV–1 Lấy mẫu, bảo quản gửi bệnh phẩm 3.1 Lấy mẫu - Lấy mẫu vào thời kỳ đầu ổ dịch Lấy sau vật chết hoặc mổ khám - Mẫu bệnh phẩm não (đầu gà), phủ tạng (gan, lách, thận, phổi) hoặc dùng tăm bơng ngốy giếng tự nhiên như: Hầu họng, khí quản, hậu môn - Các mẫu bệnh phẩm được lấy vô trùng đựng lọ hoặc túi nilon sạch 10 TCN 719 – 2006 - Nếu gà bệnh hoặc xác gà mới chết phải gửi từ đến Đàn gà bị bệnh nên gửi thêm số mẫu huyết (từ 10 mẫu đến 20 mẫu) để kiểm tra kháng thể Newcastle đàn 3.2 Bảo quản gửi bệnh phẩm - Mẫu bệnh phẩm phải được bao gói cẩn thận tránh ô nhiễm môi trường xung quanh - Bảo quản vận chuyển điều kiện lạnh từ 20C đến 80C - Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng xét nghiệm sớm tốt, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm Thiết bị - dụng cụ - nguyên liệu 4.1 Thiết bị - Tủ lạnh thường - Tủ ấm 370C - Tủ sấy từ 1000C đến 2000C - Tủ ấp trứng - Nồi hấp ướt - Máy ly tâm từ 2000 vòng/phút đến 6000 vòng/phút 4.2 Dụng cụ - Pipet khắc độ 1ml, ml, 10 ml - ống hút Pasteur - Micropipet từ l đến 200 l - Micropipet kênh (dùng pha loãng) từ 1l đến 50 l - Đầu típ 200 l - ống lấy máu 10 ml - Lọ chắt huyết ml - Bơm tiêm thuỷ tinh ml, ml, ml - Bộ cối chày sứ có đường kính cm - Dụng cụ dao, kéo, panh, kẹp 4.3 Nguyên liệu - Bông, cồn - Muối NaCl - Kháng sinh: Peniciline, Streptomicyne, Kanamicyne - Tri-Natrium citrate- C6H5Na3O7.2H2O (Chất chống đông) - Nước cất - Kháng nguyên chuẩn Newcastle - Kháng huyết chuẩn Newcastle Phương pháp chẩn đoán Sơ đồ chẩn oan bờnh Newcastle Kiểm tra lâm sàng Đặc điểm dịch tƠ häc LÊy mÉu bƯnh phÈm Ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ (HI) Ph©n lËp virus (-) (+) 10 TCN 719 2006 Giám định (HI) Kết luận bệnh 5.1 c điểm dịch tễ học - Bệnh Newcastle bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan cho gà mọi lứa tuổi - Có tỷ lệ ốm chết cao 5.2 Kiểm tra triệu chứng – bệnh tích 5.2.1 Triệu chứng KLuËn: - ủ rũ, ít vận động, nhắm mắt, uống nhiều nước, mào tím tái - Khó thở, ho, ngáp, lắc đầu, dịch nhớt chảy từ mũi, miệng, diều căng đầy - Giảm đẻ, trứng biến dạng, vỏ xù xì hoặc thiếu canxi - Phân lỏng, màu trắng xanh, dính bết vào lông quanh giếng huyệt - Gà bị bệnh sau ngày đến ngày xuất triệu chứng thần kinh: Vẹo cổ, bước vòng tròn, liệt chân cánh 5.2.2 Bệnh tích Tuỳ theo thể bệnh có thể thấy nhiều hoặc những bệnh tích đặc trưng sau: - Thanh khí quản đọng dịch nhầy xuất huyết - Phổi xuất huyết lấm tấm - Niêm mạc miệng, thực quản có điểm xuất huyết - Niêm mạc giữa dạ dày tuyến dạ dày (cuống mề) có điểm xuất huyết - Niêm mạc ruột viêm, xuất huyết, có nốt loét hình cúc áo Manh tràng xuất huyết Trực tràng, hậu môn viêm loét, xuất huyết - Buồng trứng xuất huyết, trứng non vỡ xoang bụng gây viêm phúc mạc 5.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm: 5.3.1 Phát kháng nguyên: Virus gây bệnh Xử lý bệnh phẩm 10 TCN 719 – 2006 Não hoặc phủ tạng được nghiền cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch 1:10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH 7,2) có kháng sinh (Penicillin 2000UI/ml, Streptomycin 2mg/ml) Nếu bệnh phẩm tăm bơng ngốy lỡ huyệt hoặc phân thì dùng kháng sinh đặc gấp lần Để tủ lạnh 40C giờ Ly tâm từ 1500 vòng/phút đến 2000 vòng/phút 15 phút, lấy nước để tiêm phôi trứng 5.3.1.1 Phân lập virus: 5.3.1.1.1.Tiêm trứng gà có phôi Dùng trứng gà có phôi từ ngày tuổi đến 11 ngày tuổi, lấy từ trại gà sạch bệnh - Soi trứng, chọn phôi khoẻ - Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ phôi đến phôi - Sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70% - Dùi vị trí tiêm phía buồng - Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm rồi tiêm 0,2ml vào xoang niệu mô - Gắn kín giếng tiêm bằng keo dán - ấp tiếp tủ ấm từ 37 0C đến 380C Ngày soi trứng lần, loại bỏ phôi chết trước 24 giờ Theo dõi từ ngày đến ngày - Các trứng có phôi chết hoặc gần chết để vào tủ lạnh 0C Phôi nhiễm virus Newcastle cường độc thường chết từ 24 giờ đến 60 giờ - Sau ngày đến ngày trứng không chết được để tủ lạnh 40C giết phôi 5.3.1.1.2.Thu hoạch nước trứng Trứng chết trứng sống sau để tủ lạnh 0C được mổ khám, kiểm tra bệnh tích thu hoạch nước trứng - Mổ trứng điều kiện vô trùng, sát trùng vỏ trứng bằng cồn 70% - Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô - Hút nước trứng vào lọ vô trùng, bảo quản nhiệt độ 40C để kiểm tra - Kiểm tra bệnh tích: phôi có xuất huyết lấm tấm da đầu, thân, chân, cánh 5.3.1.1.3 Kiểm tra virus Kiểm tra nước trứng thu hoạch bằng phản ứng HA Tiến hành: Phản ứng ngưng kết hồng cầu gà - HA (Xem phụ lục 2): Đánh giá kết quả: - Nếu phản ứng HA dương tính, xác định có virus gây bệnh - Nếu phản ứng HA âm tính, phôi chết, có xuất huyết cần tiêm truyền lần để xác định tiếp nguyên nhân gây bệnh 5.3.1.2 Giám định virus Giám định virus phân lập được bằng phản ứng HI với kháng huyết chuẩn Newcastle Tiến hành: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà - HI (Xem phụ lục 3) Đánh giá kết quả: - Nếu phản ứng HI dương tính, kết luận virus phân lập virus Newcastle - Nếu phản ứng HI âm tính, cần kiểm tra tiếp với kháng huyết số virus có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu gà (ví dụ: kháng huyết Cúm, EDS…) 5.3.1.3 Xác định tính độc lực virus Newcastle (tuỳ theo yêu cầu chẩn đoán) Virus Newcastle có nhóm độc lực: - Nhóm độc lực cao (Velogenic): Gây xuất huyết đường tiêu hoá, có tỷ lệ chết cao - Nhóm độc lực vừa (Mesogenic): Có triệu chứng hô hấp, có triệu chứng thần kinh, tỷ lệ chết thấp 10 TCN 719 – 2006 - Nhóm độc lực yếu (Lentogenic): Gây nhiễm đường hô hấp thể nhẹ Xác định tính độc lực chúng bằng chỉ số: MDT - ICPI – IVPI (Xem phụ lục - - 6) 5.3.2 Phát kháng thể: Phản ứng HI phát kháng thể Newcastle có mẫu huyết kiểm tra mắc bệnh tự nhiên hoặc được tiêm vacxin - Mẫu bệnh phẩm: Là huyết kiểm tra - Nguyên liệu: + Kháng nguyên Newcastle chuẩn + Mẫu huyết kiểm tra + Nước sinh lý 0,85% + Hồng cầu gà 1% - Tiến hành: + Phản ứng HA: Xác định hiệu giá kháng nguyên Newcastle (xem phụ lục 2) + Pha đơn vị HA: dùng cho phản ứng HI (Xem phụ lục 3.1) + Phản ứng HI: Xem phụ lục - Đánh giá kết quả: Nếu gà chưa được tiêm phòng có hiệu giá kháng thể lớn hoặc bằng 1/8 kết luận gà bị nhiễm virus Newcastle Kết luận Dựa vào: Dịch tễ học Triệu chứng lâm sàng Kết quả xét nghiệm Các đàn gia cầm có diễn biến dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng đã nêu mục 5.1; 5.2 5.3 phân lập có kết quả dương tính virus Newcastle hoặc có kháng thể Newcastle cao so với hiệu giá kháng thể vacxin thì kết luận gà mắc bệnh Newcastle KT BỘ TRƯỞNG THỨ TRƯỞNG Bùi Bá Bổng 10 TCN 719 – 2006 Phụ lục Chuẩn bị huyễn dịch hồng cầu gà 1% 1.1 Gà lấy máu gà trống đã trưởng thành, khoẻ mạnh, chưa tiêm phòng Newcastle 1.2 Ni gà ch̀ng an tồn, dùng để lấy máu thường xuyên 1.3 Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoặc tim) bằng cồn 70% 1.4 Dùng bơm tiêm từ 5ml đến 10ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông (Natri xitrat 4%, Alserver…) rồi hút lấy máu gà Cho máu vào ống nghiệm 1.5 Rửa hồng cầu: Cho nước sinh lý (NaCl 0,85%) vào ống lấy máu, lượng gấp đôi lượng máu ống, lắc đều Ly tâm từ 1.500 vòng/phút đến 2.000 vòng/phút, 10 phút, đổ bỏ huyết tương Rửa từ lần đến lần Sau lần ly tâm cuối, bỏ nước trên, lấy hồng cầu để pha 1.6 Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% Ví dụ: ml hồng cầu 99 ml nước sinh lý 1.7 Bảo quản huyễn dịch hồng cầu nhiệt độ từ C đến 80 C Hồng cầu sau pha có thể dùng tuần (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ) Hồng cầu không dùng hết, cần cho nước sinh lý vào bảo quản Khi cần, ly tâm lại để dùng Phụ lục Kỹ thuật làm phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA – Haemagglutination test) 2.1 Nguyên liệu - Hồng cầu gà 1% - Nước trứng thu hoạch ( hoặc kháng nguyên Newcastle): đối chứng dương 10 TCN 719 – 2006 - Nước sinh lý - Mẫu cần xét nghiệm Các Giếng bước N.liệu Nước sinh lý Pha (l) loãng Kháng KN nguyên (l) Hồng cầu (l) Cho hồng Độ pha cầu loãng KN 10 11 12 đối chứng hồng cầu 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1 1 1 1 1 16 32 64 128 256 512 1024 2048 2.2 Phản ứng HA: Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U 2.3 Trình tự tiến hành phản ứng HA - Cho nước sinh lý vào mỗi giếng 25 l từ giếng đến giếng 12 - Cho kháng nguyên cần kiểm tra vào giếng (25 l) - Pha loãng kháng nguyên: trộn đều kháng nguyên với nước sinh lý giếng 1, hút 25 l chuyển sang giếng trộn đều, hút 25 l chuyển sang giếng trộn đều, tiếp tục làm vậy đến giếng 11, đổ bỏ 25 l - Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 l, lắc nhẹ phút Để đĩa phản ứng nhiệt độ phòng Sau 15 – 30 phút đọc kết quả - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Có hạt ngưng kết lấm chấm + Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn Hiệu giá ngưng kết được tính độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất ngưng kết hoàn toàn Ví dụ: 1/256 giếng cuối cùng còn có ngưng kết 2.4 Nhận định kết quả - Nếu HA dương tính: Kết luận có virus gây bệnh Để xác định virus Newcastle cần phải làm phản ứng HI với kháng huyết dương tính chuẩn Newcastle - Nếu phản ứng HA âm tính: Có thể bệnh phẩm không có mặt virus Newcastle hoặc lượng virus ít Vì vậy, cần tiêm phôi trứng lần nữa Phụ lục Kỹ thuật làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI – Heamagglutination Inhibition test) 3.1 Nguyên liệu - Nước muối sinh lý 0,85% - Hồng cầu gà 1% - Huyết kiểm tra (hoặc kháng huyết chuẩn Newcastle) - Kháng nguyên chuẩn Newcastle (hoặc nước trứng thu hoạch): 10 TCN 719 – 2006 Kháng nguyên dùng cho phản ứng HI được pha đơn vị HA Ví dụ: HA bằng 1/256, 4HA bằng 1/64 Kháng nguyên pha đơn vị HA cần phải chuẩn để phản ứng HI có kết quả chính xác Cách pha: Ví dụ: 4HA bằng 1/64 Pha 4HA gồm phần KN 63 phần nước sinh lý Kiểm tra kháng nguyên HA đã pha: Tiến hành phản ứng HA kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, vậy kháng nguyên pha đạt Nếu ngưng kết đến giếng thứ (hoặc hơn) kháng nguyên pha đặc Nếu ngưng kết chỉ giếng đầu tiên kháng nguyên pha loãng Dựa vào kết quả đó để bổ xung thêm kháng nguyên hoặc nước sinh lý để có kháng nguyên 4HA chuẩn (Pha vào lọ vaccine 2ml nước muối sinh lý 2-8 độ C Thì HAU khoảng giếng 9-8 vì 1/128 hay 1/64 lấy từ lọ vaccine đã pha ml nước muối sinh lý pha tỉ lệ khác kết quả khác 3.2 Phản ứng HI: Dùng đĩa ngưng kết 96 giếng, đáy chữ U 3.3 Trình tự tiến hành phản ứng: - Cho nước sinh lý vào mỗi giếng 25 l từ giếng đến giếng 12 - Cho huyết cần kiểm tra vào giếng ( 25 l ) - Pha loãng huyết thanh: Trộn đều huyết với nước sinh lý giếng 1, rồi hút 25 l chuyển sang giếng trộn đều, hút 25 l chuyển sang giếng tiếp tục làm vậy đến giếng 11, đổ bỏ 25 l - Cho kháng nguyên đơn vị HA vào giếng từ đến 11, mỗi giếng 25 l - Lắc nhẹ, để 30 phút nhiệt độ phòng - Cho hồng cầu: Mỗi giếng 25 l, lắc nhẹ phút Để đĩa phản ứng nhiệt độ phòng Sau 15-30 phút đọc kết quả - Đọc kết quả: + Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên kháng thể tương ứng + Phản ứng âm tính: Có hạt ngưng kết lấm tấm Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể phản ứng Giếng Các bước Pha loãng HT Cho KN 10 11 12 đối chứng hồng cầu 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 N.liệu Nước sinh lý (l) Huyết NCX HA Newcastle (l) Lắc nhẹ, để 30 phút nhiệt độ phòng Cho H.cầu Hồng cầu (l) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 10 TCN 719 – 2006 Độ pha loãng HT 1 1 1 1 1 16 32 64 128 256 512 1024 2048 3.4 Nhận định kết quả: * Mẫu huyết kiểm tra kháng thể: - Hiệu giá kháng thể mẫu huyết kiểm tra được tính độ pha loãng cao nhất còn có tượng ức chế ngưng kết - Những gà chưa được chủng vacxin có kháng thể lớn hoặc bằng1/8 (3log2) thì mẫu đó được coi nhiễm virus Newcastle * Mẫu kháng nguyên (nước trứng giám định virus phân lập) Nếu có tượng ức chế ngưng kết với kháng huyết chuẩn Newcastle chứng tỏ viru-s phân lập virus Newcastle Phụ lục Phương pháp xác định thời gian gây chết phôi trung bình ( MDT – Mean Dead Time ) Chủng virus phân lập (nước trứng) được pha loãng từ 10-1 – 10-9 - Tiêm mỗi nồng độ cho phôi gà từ ngày tuổi đến 10 ngày tuổi với liều 0,1 ml/ phôi - Đối chứng: phôi không tiêm Trứng được đem ấp tiếp 370C - Soi trứng ngày lần ngày, ghi giờ số phôi chết Ví dụ bảng sau: Độ pha loãng Số trứng tiêm -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 Đ.chứng 5 5 5 5 5 Tổng số phôi chết Thời gian phôi chết (giờ) 24 36 2 48 2 60 1 72 1 84 96 100 5 5 10 TCN 719 – 2006 - MDT: thời gian trung bình được tính bằng giờ cho liều tối thiểu gây chết 100% số phôi Ví dụ bảng ta có: (1 x 36) + (2 x 48) + (2 x 60) MDT = = 50,4 giờ - Liều gây chết phôi tối thiểu độ pha loãng cao nhất virus gây chết 100% số phôi - Nhận định kết quả: Dựa vào kết quả MDT để phân loại virus Newcastle: Nhóm Velogenic: MDT nhỏ 60 giờ Nhóm Mesogenic: MDT lớn 61 giờ nhỏ 90 giờ Nhóm Lentogenic: MDT lớn 90 giờ Phụ lục Phương pháp xác định chỉ số độc lực não gà (ICPI – Intracerebral Pathogenicity Index) Chủng Virus phân lập (nước trứng) được pha nồng độ 10-1(1/10) tiêm vào não 10 gà ngày tuổi, với liều 0,05 ml/con Gà được theo dõi ngày liền, ghi lại những biểu sức khoẻ: ốm, chết, bình thường Biểu bệnh được tính bằng điểm: + Chết: điểm + ốm: điểm + Bình thường: điểm Ví dụ: Ngày Số chết Số ốm Số bình thường 1 B Cách tính: = 10 10 10 10 10 10 68 A 80 Điểm Tổng số điểm 136 B 140 140 = A Cộng dồn = 1,75 80 10 10 TCN 719 – 2006 Chỉ số ICPI chỉ số độc lực virus được đánh sau: Nhóm Velogenic từ đến Nhóm Mesogenic lớn hoặc bằng 0,5 Nhóm Lentogenic bằng Phụ lục Phương pháp xác định chỉ số độc lực tiêm tĩnh mạch gà tuần tuổi (IVPI – Intravenous Pathogenicity Index) Chủng virus phân lập (nước trứng) được pha với nước sinh lý vô trùng thành huyễn dịch 10-1 (1:10), tiêm 0,1 ml vào tĩnh mạch cho 10 gà tuần tuổi lấy từ đàn gà sạch bệnh Gà được theo dõi 10 ngày liền, ghi lại tình trạng sức khoẻ đánh giá theo qui định: + Bình thường: điểm + ốm: điểm + Liệt: điểm + Chết: điểm Ví dụ: Ngày Số chết Số liệt Số ốm Số bình thường 2 3 2 80 10 10 10 10 10 B Cộng dồn 86 A 100 Điểm Tổng số điểm 258 12 B 275 275 11 10 TCN 719 – 2006 Cách tính: = = = 1,75 A 100 Chỉ số ICPI chỉ số độc lực virus được đánh sau: Nhóm Velogenic từ 1,5 đến 3,0 Nhóm Mesogenic bằng Nhóm Lentogenic bằng 11 Serology Introduction The presence of antibodies to Newcastle disease virus in chickens is detected by serological testing The results of these tests are used for three purposes To assess the efficacy of Newcastle disease vaccine in laboratory and field trials To assess the level of Newcastle disease virus antibodies in the field Serum known to contain antibodies to Newcastle disease virus is used to confirm the presence of Newcastle disease virus in a test sample of allantoic fluid Such a sample would be obtained during the isolation of virulent Newcastle disease virus See Section 15 There are two assays commonly used to carry out serological testing for Newcastle disease virus antibodies Haemagglutination inhibition (HI) test The HI test is a convenient and commonly used assay that requires cheap reagents and is read by eye ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) This is a colourimetric assay and requires the use of a sophisticated instrument to read the optical density of the reactions ELISA kits for Newcastle disease virus antibody detection are prepared and sold commercially Detailed instructions are supplied with the kits They are usually quite expensive In this manual a protocol for the HI test based on the test described by Allan and Gough will be used for serological testing (Allan and Gough, 1974 a.) Preparation of serum Serum samples are collected for testing for the presence of antibodies to Newcastle disease virus Blood is collected as described in Section The blood forms a clot in the syringe in a few minutes Once the blood clots, the syringes of blood can be kept with the needle upright to prevent serum filling the needle cap The serum will separate from the clot within a few hours at room temperature or in approximately hours at 37°C Storage at 37°C will help the serum separate from the clot Materials   Syringes with blood samples Sterile glass Pasteur pipettes 12 10 TCN 719 – 2006    Microfuge tubes Storage tubes (1.8 mL Nunc cryotubes are ideal but microfuge tubes are a cheaper alternative.) Sharps container and discard bag for biological waste Method Remove the plunger from the syringe Transfer the serum to a microfuge tube by pouring or using a glass Pasteur pipette Dispose of needles, syringes, clots and pipettes in appropriate containers Often the serum will contain red blood cells Centrifuge for 30 seconds in a microfuge centrifuge or allow to settle under gravity overnight at 4°C to pellet the cells Do not freeze the samples at this step Freezing will lyse the red blood cells Transfer clear serum to a second tube Remember to label each tube after the transfer of the serum This ensures the serology results can be applied to individual birds and groups Storage of Serum Store ampoules of serum at -20°C Storage at 4°C is acceptable for a short period, up to weeks Notes on serum samples Samples collected in the field may end up at room temperature overnight and often not separate well It has been noted at the John Francis Virology Laboratory that in some samples the serum does not separate from the clot In these cases, the whole clot is centrifuged This usually results in a small amount of serum separating It is important that the serum samples are clear Pink samples contain lysed red blood cells When pink samples are tested observe both test and control samples carefully to determine effect of the colour on the results of the test Pink coloured samples can affect results of an ELISA, which is a colourimetric assay An overview of the Haemagglutination Inhibition (HI) test Antibody response to the haemagglutinin protein in the Newcastle disease virus envelope can be measured by the HI test When serum containing these antibodies is mixed with Newcastle disease virus, the antibodies bind to the haemagglutinin protein in the envelope of the virus This blocks the haemagglutinin protein from binding with the receptor site on chicken red blood cells 13 10 TCN 719 – 2006 Thus the haemagglutination reaction between the virus and the red blood cells is inhibited By performing two-fold serial dilutions on the serum prior to testing, the concentration of the serum antibodies can be expressed as an HI titre to the log base Standardization of the HI test It is important that there is correlation between the results of tests carried out by different technicians and in different laboratories For this reason HI tests should be standardized both within a laboratory and between laboratories Standardization is achieved by following a standard protocol This will include: Using a standard HA units of Newcastle disease virus antigen Using standard positive anti-serum and negative serum Including a serum control for each test serum to detect the presence of non-specific agglutinins Using a standard percent dilution of red blood cells The use of control serum in the HI test Positive and negative control sera are tested to avoid errors in the interpretation of the results of the HI test Inconsistencies in the results of the HI test may be caused by variations in reagents and procedures Examples of possible variations include: The source and exact percentage by volume of the red blood cells The exact amount of antigen used in the HI test Accuracy of dilutions Temperature Time allowed for the antibody/antigen reactions to occur Quality of test serum samples (haemolysed serum samples may be responsible for non-specific reactions) Two standard sera are used A standard negative control serum known to contain no antibodies to the Newcastle disease virus It has no HI titre and does not agglutinate chicken red blood cells 14 10 TCN 719 – 2006 A standard positive control serum also known as a standard anti-serum The HI titre of the antiserum will have been established by repeated titration Variability in HI titres of standard positive serum It is sometimes observed that the standard HI titre of the standard anti-serum tested on the same day with the same antigen preparation and protocol may vary A difference in HI titre of one dilution that is one log base (21) can be regarded as due to random errors and an inherent variability in biological responses However if the titre of the standard positive serum differs by more than one dilution or log base 2, then the test is invalidated In this case, fresh antigen must be prepared and tested and the HI test repeated Three categories of standard sera International standard reference serum Certain laboratories prepare reference serum to a very high standard Standard reference Anti-Newcastle disease serum is available for purchase It is used as a reference serum in the preparation of national and laboratory standard sera The National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) in the United Kingdom can supply an international standard reference serum The potency of the international reference serum has been determined by the supplier and is expressed in International Units (IU) per ampoule of freeze-dried serum Contact Email enquiries@nibsc.ac.uk Tel 44 (0) 1707 654753 Fax 44 (0) 1707 646730 Website http://www.nibsc.ac.uk National standard serum is prepared by a national laboratory and distributed to collaborating laboratories as required This serum is prepared by mixing sera with known HI titres A series of HI tests are carried out to establish the HI titre of the national standard This is compared with the HI titre of the international standard reference serum if available The national standard serum is then stored in multiple aliquots and distributed to collaborating laboratories within a country Laboratory standard serum is prepared by some laboratories in order to conserve supplies of national standard serum The laboratory standard is prepared by mixing serum samples with known HI titres Comparative HI testing of the laboratory standard and the national standard is used to establish the HI titre of the laboratory standard Preparation of national and laboratory standard sera Each laboratory will require a supply of negative and positive control serum in order to carry out HI tests on serum samples Collection of HI negative serum Collect serum from chickens that have had no exposure to Newcastle disease virus The serum should show no inhibition of viral haemagglutination activity when tested by the HI test It is often difficult to find serum without any HI activity In this case use serum with low HI titres of 21 Collection of HI positive serum 15 10 TCN 719 – 2006 There may be stored serum that is suitable for this purpose If not, vaccinate several chickens with I-2 Newcastle disease vaccine Two weeks after the primary vaccination, give a booster vaccination Two weeks later, take a serum sample from each chicken and test the HI titre Collect extra serum from chickens with a titre of 25 or above The volume of blood collected from each chicken depends on the size of the chicken Pool all the serum samples with HI titres of 25 or above and test the HI titre of the pooled serum Comparative HI testing of international reference and national standard sera Information supplied by NIBSC in 2001 indicated their international standard reference contained 320 IU per ampoule The serum can be reconstituted in PBS A suitable volume of PBS would be mL, which would give IU in the 25 µL test sample Refer to instructions provided by the manufacturer Use the standard HI test described in this section to determine the titre of the international reference standard and the national standard Test both samples in triplicate on the same microwell plate Carry out a series of at least three tests on different days Once the HI titre of the international standard serum and the national standard serum have been established, prepare a series of two-fold dilutions of the serum that are spread around the endpoint used to establish the HI titres Titrate the dilutions that range from complete inhibition to no inhibition as an additional check on the HI titres The results of testing these dilutions will confirm the HI titre of the undiluted serum Example of confirming HI titre of standard samples by testing a series of dilutions of the sample Repeated testing of the pooled serum established the HI titre at 25 Prepare 1/8, 1/16, 1/32 and 1/64 dilutions of the pooled serum Test each dilution for HI titre Confirmatory results: The results tabled confirm that the HI titre of the serum used to prepare the dilutions had a titre of 25 Table 3: Results confirming HI titre of serum = 25 Serum dilution HI titre 1/8 22 1/16 21 1/32 - ve 1/64 - ve 16 10 TCN 719 – 2006 The test results will give a HI titre for both the International reference serum and the national laboratory serum being tested The HI titre for IU of the International reference serum can be used to determine the number of IU in the national reference serum Example The standard HI test of 25 µL of the international reference serum containing IU and has a HI titre of (23) The national serum tested HI titre of 64 (26) How many IU does the national serum contain? IU in a sample with a HI titre of How many (?) IU in a sample with a HI titre of 64 Note: Not all laboratories use the same protocol for testing HI titre and IU are independent of the test system used Serological results of samples expressed in IU should give equivalent results when tested by different systems By comparing the HI titre of the standard national serum with the HI titre of the international reference serum enables you to express the results of HI tests in IU However it is not very often that you will be required to express the results of HI testing in IU Most publications of Newcastle disease serology results describe the assay used and express HI titres to log base Preparing a laboratory standard serum Each laboratory should receive a national standard serum from a central laboratory The HI titre and activity in International units of the serum will have been determined by rigorous testing as described above To conserve the supply of national standard serum some laboratories will decide to prepare a secondary laboratory standard serum Collect positive serum as described above Do comparative testing of the laboratory and national standards Test each sample in triplicate on the same microwell plate Repeat several times and analyze HI titres for both samples Record the HI titre for the laboratory standard Store mL aliquots of the laboratory standard at -20°C This standard is used every time the HI test is carried out and should always show the same HI titre when tested with the HA units of antigen Preparing a national standard serum without an international reference serum Many laboratories will not be able to obtain an international reference serum with which to compare their national standard serum In this case, more rigorous HI testing of the pooled HI positive serum samples will be required to establish the HI titre of the standard serum It is suggested that the 17 10 TCN 719 – 2006 serum is tested up to ten times Use freshly prepared HA units of antigen for each test and carry out the test on different days if possible The results will be a range of HI titres The most frequently occurring titre can be considered the HI titre of the standard serum All future HI tests carried out on the standard serum should give this titre Storage of standard serum Once the positive and negative standard sera have been tested, aliquots can be prepared, labeled and stored frozen Storage at -70°C is optimal (but -20°C is adequate) Do not thaw and refreeze the samples frequently Representative samples should be thawed and tested to confirm that there is no loss of titre in the storage process Preparation of Newcastle disease virus antigen for use in HI tests Antigen is prepared by inoculating embryonated eggs with a sample of Newcastle disease virus and harvesting the allantoic fluid four days later Part of the first batch of I-2 Newcastle disease vaccine prepared from the I-2 working seed can be set aside for storage as antigen A volume of 50 mL to 100 mL is adequate for a large number of tests Centrifuge the sample at 200 g to clarify and remove any contaminating red blood cells Store the antigen in one mL aliquots at -20°C See Sections and Preparation of 4HA units of Newcastle disease virus antigen The standard amount of Newcastle disease virus used in the haemagglutination inhibition (HI) test is 4HA units It is necessary to prepare and test a suspension of Newcastle disease virus containing 4HA units in order to carry out the HI test This involves a series of following steps Titrate the stored suspension of virus to be used as the antigen in the HI test See Section 10 Calculate the HA titre Calculate the dilution factor required to produce HA units A simple way is to divide the HA titre by Apply the dilution factor and dilute the original suspension of antigen in PBS to produce an adequate volume of 4HA antigen to carry out the HI test Allow 2.5 mL for each microwell plate Titrate the diluted (4HA) suspension of virus This is a back titration to check the diluted antigen contains HA units Read HA titre It should equal 4HA units If not adjust the dilution and titrate again Use the 4HA unit dilution of antigen in an HI test to test the standard positive and negative serum The HI titre of the laboratory standard positive serum should equal the predetermined titre Interpretation The results of the back titration of the diluted antigen and the HI titre of the standard positive are both used to confirm the antigen has been diluted to a concentration equivalent to the standard HA units If the HI titre of the positive control serum is less than the standard titre, the antigen is too concentrated Prepare a new dilution and test again 18 10 TCN 719 – 2006 Conversely if the HI titre of the positive control serum is too high the antigen is too dilute Prepare a new dilution and test again Worked example Preparation of 4HA units of antigen for HI test in 10 microwell plates: The HA titre of the antigen was tested according to the protocol described above The HA titre = 128 Calculation of dilution factor to prepare HA units: 128/4 = 32 Calculation of volume of 4HA unit dilution of antigen required: Allow 2.5 mL per plate; total volume required = 10 × 2.5 mL = 25 mL Apply dilution factor = 25 mL/32 = 0.781 mL = 781 µL Preparation of the diluted antigen: mix 781 µL of original virus suspension with 24.219 mL of diluent PBS is a suitable diluent Note: In this case it would be easiest to prepare 32 mL of the 4HA antigen This would use mL of the original suspension diluted in 31 mL of PBS Haemagglutination inhibition Materials          Thawed serum samples in racks V-bottom microwell plates and covers PBS percent washed red blood cells V-bottom reagent trough 25 µL single and multichannel pipettes and tips Microwell plate recording sheet Newcastle disease virus antigen diluted to HA units per 25 µL Standard positive and negative serum Method Fill in recording sheets to record how samples will be dispensed into microwell plates Calculate the number of plates required and number each plate Dispense 25 µL of PBS into each well of the plates Shake each serum sample and dispense 25 µL into the first well and the last (control) well of a row of a microwell plate 19