Bùi nhật lệ phân tích dữ liệu microarray để đánh giá sự thay đổi biểu hiện mrna của gen mest và một số gen liên quan đến quá trình tăng sinh mỡ trên chuột ở một số điều kiện khác nhau luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI NHẬT LỆ PHÂN TÍCH DỮ LIỆU MICROARRAY ĐỂ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN MEST VÀ MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH MỠ TRÊN CHUỘT Ở MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÙI NHẬT LỆ PHÂN TÍCH DỮ LIỆU MICROARRAY ĐỂ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI BIỂU HIỆN mRNA CỦA GEN MEST VÀ MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH MỠ TRÊN CHUỘT Ở MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN KHÁC NHAU LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 8720208 Người hướng dẫn khoa học: TS Chu Đình Tới PGS.TS Phùng Thanh Hương HÀ NỘI 2023 LỜI CẢM ƠN Tôi cảm thấy may mắn tự hào q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp thạc sĩ giúp trưởng thành mà cịn giúp tơi nhận thân đón nhận nhiều tình cảm giúp đỡ chân thành Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Phùng Thanh Hương, Trưởng Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy mà ngưỡng mộ, người ln hết lịng giúp đỡ định hướng cho từ ngày Tôi xin chân thành cảm ơn TS Chu Đình Tới, Trưởng Khoa Các khoa học ứng dụng, Trường Quốc tế, ĐHQGHN người trực tiếp đồng hành hỗ trợ thời gian vừa qua, hoạt động nghiên cứu khoa học nói chung thời gian thực đề tài nói riêng Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đề tài mã số 106.02.2019.314 (Cho TS Chu Đình Tới) Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn HVCH Vũ Thị Huệ, HVCH Nguyễn Thị Yến Vy, sinh viên Phạm Chung Anh, Trường Quốc tế, ĐHQGHN người bạn cổ vũ giúp đỡ nhiều để vượt qua khó khăn q trình học tập công tác Xin cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô Trường Quốc tế, ĐHQGHN tạo điều kiện để cân công việc nhà trường việc học thân Trân trọng cảm ơn tới thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Phòng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Cảm ơn gia đình bạn bè động viên bên cạnh ủng hộ Xin gửi lời cảm ơn tới Chương trình học bổng đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ nước Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF), tài trợ tơi học tập nghiên cứu q trình học thạc sĩ Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2023 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Công nghệ microarray nghiên cứu mức độ biểu gen 1.1.1 Chip microarray 1.1.2 Quy trình kỹ thuật 1.2 Đại cương mô mỡ 10 1.2.1 Các loại mơ mỡ vai trị chúng 10 1.2.2 Ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ độ tuổi khác lên mức độ biểu mRNA gen mô mỡ 13 1.3 Sự biểu mRNA gen MEST mô mỡ 14 1.3.1 Vài nét gen MEST 14 1.3.2 Một số kết nghiên cứu biểu gen MEST mô mỡ điều kiện khác 16 1.3.3 Các nghiên cứu biểu gen MEST sử dụng liệu microarray 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp tiền xử lý liệu microarray 20 2.3.2 Phương pháp phân tích thay đổi biểu gen 22 2.3.3 Phương pháp xác định vị trí vai trị gen MEST số gen liên quan đến tăng sinh mỡ đường tín hiệu 24 2.3.4 Các cơng cụ sử dụng phân tích 27 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 Phân tích thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST mô mỡ điều kiện khác từ liệu microarray 28 3.1.1 Kết tiền xử lý liệu 28 3.1.2 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST thay đổi độ tuổi 30 3.1.3 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST thay đổi nhiệt độ môi trường 36 3.2 Vị trí vai trò gen MEST số gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ đường tín hiệu 43 3.2.1 Các gen có thay đổi mức độ biểu thay đổi độ tuổi nhiệt độ môi trường 43 3.2.2 Vị trí vai trị MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ đường tín hiệu biết 47 CHƯƠNG BÀN LUẬN 56 4.1 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ thay đổi độ tuổi 56 4.2 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ thay đổi nhiệt độ môi trường 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT TỪ VIẾT VẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT BAT Brown adipose tisue Mô mỡ màu nâu BrAT Brite adipose tissue Mô mỡ màu be cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic FC Foldchange FDR False discovery rate GO Gene Ontology Bản thể gen HF High fat Giàu chất béo KEGG Genomes Mesoderm specific transcript mRNA Messenger ribonucleic acid qRT-PCR SCD1 SFRP5 giả Kyoto Encyclopedia of Genes and MEST PET/CT Tỉ lệ phát dương tính Positron Emission Tomography Computed Tomography Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RNA thông tin Chụp cắt lớp position Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase chép ngược Stearoyl-CoA desaturase Serum Secreted Frizzled-Related Protein STD Standard diet UCP1 Uncoupling protein WAT White adipose tissue Chế độ ăn tiêu chuẩn Mô mỡ màu trắng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh minh họa chip microarray nghiên cứu mức độ biểu gen chuột công ty Agilent Hình 1.2 Quy trình kỹ thuật công nghệ DNA microarray [10] Hình 1.3 Hình minh họa kết thu từ thí nghiệm microarray [14] Hình 1.4 Sự phân bố WAT BAT thể người chuột (Paulus and Bauwens 2023) 11 Hình 1.5 Biểu marker mơ mỡ phân loại theo chức năng, độ tuổi 14 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2 Biểu đồ phân tán liệu microarray [2] 22 Hình 2.3 Biểu đồ heatmap biểu đồ dendrogram biểu diễn kết phân cụm gen theo nguyên lý cấp bậc (Franco and Vivo 2019) 25 Hình 3.1 Cấu trúc liệu trước sau xử lý 29 Hình 3.2 Biều đồ cột biểu diễn mức độ biểu mRNA gen MEST nhóm 10D_17C nhóm 21D_17C 30 Hình 3.3 Biều đồ cột biểu diễn mức độ biểu mRNA gen MEST nhóm 10D_29C nhóm 21D_29C 33 Hình 3.4 Biều đồ cột biểu diễn mức độ biểu mRNA gen MEST nhóm 10D_17C nhóm 10D_29C 36 Hình 3.5 Biều đồ cột biểu diễn mức độ biểu mRNA gen MEST nhóm 21D_17C nhóm 21D_29C 40 Hình 3.6 Biểu đồ volcano biểu diễn thay đổi mức độ biểu mRNA gen thay đổi độ tuổi 43 Hình 3.7 Biểu đồ volcano biểu diễn thay đổi mức độ biểu mRNA gen thay đổi nhiệt độ môi trường 45 Hình 3.8 Kết phân tích thể gen gen có thay đổi mức độ biểu mô mỡ thay đổi độ tuổi 48 Hình 3.9 Biểu đồ heatmap dendrogram gen MEST gen có thay đổi biểu liên quan đến tăng sinh mỡ 54 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số công cụ tin sinh học sử dụng phân tích liệu microarray 10 Bảng 2.1 Các công cụ sử dụng nghiên cứu………….…………………………28 Bảng 3.1 20 gen có thay đổi mức độ biểu lớn nhóm 10D_17C nhóm 21D_17C 31 Bảng 3.2 20 gen có thay đổi mức độ biểu gen lớn nhóm 10D_29C nhóm 21D_29C 34 Bảng 3.3 Các gen có thay đổi mức độ biểu thay đổi nhiệt độ môi trường chuột 10 ngày tuổi 38 Bảng 3.4 Các gen có thay đổi mức độ biểu thay đổi nhiệt độ môi trường chuột 21 ngày tuổi 41 Bảng 3.5 Các gen có thay đổi mức độ biểu gen có liên quan đến q trình tăng sinh mỡ 50 ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ microarray tiêu chuẩn vàng nghiên cứu thay đổi mức độ biểu gen điều kiện khác nhau, với khả phân tích hàng chục nghìn gen thí nghiệm [2] Việc khai thác liệu microarray mức độ biểu gen để tận dụng nguồn liệu khổng lồ sẵn có đánh giá vai trò gen mối tương quan với nhiều gen khác nhằm phát chế chưa biết trở thành xu hướng nghiên cứu gần giới Việt Nam [3] Gen Mesoderm specific transcript (MEST) cho có liên quan trực tiếp tăng sinh mô mỡ, đặc biệt mô mỡ trắng, MEST cịn coi marker tăng sinh mỡ Mức độ biểu gen MEST tăng lên trình phát triển mở rộng mô mỡ trắng chuột Cùng với gen Serum Secreted Frizzled-Related Protein (SFRP5), gen MEST dự đoán cịn sử dụng làm marker sinh học cho tế bào mỡ khỏe mạnh, biểu chúng khơng tiếp tục tăng chuột chuyển sang tình trạng béo phì bệnh lý [4, 5] Bên cạnh đó, MEST cho yếu tố điều hịa giảm q trình biệt hóa tế bào mỡ, lựa chọn MEST đích tác dụng phát triển thuốc liệu pháp điều trị khác nỗ lực kiểm sốt tình trạng béo phì bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa hướng tiềm tương lai [6] Chính vậy, việc hiểu rõ thay đổi biểu gen MEST gen liên quan điều kiện khác làm rõ đường tín hiệu sinh tổng hợp mơ mỡ vơ cần thiết Trên giới ghi nhận số nghiên cứu liệu microarray, tác giả khảo sát báo cáo đặc điểm biểu mRNA gen liên quan đến mô mỡ tiếp xúc với môi trường lạnh, thay đổi độ tuổi, nhiên kết nhiều tranh cãi [1, 7] Nhất gen MEST, tính đến thời điểm chưa có nhiều nghiên cứu từ microarray giới nói chung Việt Nam nói riêng quan tâm đến phân tích gen Do chúng tơi tiến hành đề tài “Phân tích liệu microarray để đánh giá thay đổi biểu mRNA gen MEST số gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ chuột số điều kiện khác nhau” với hai mục tiêu sau: Phân tích thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST mô mỡ điều kiện khác từ liệu microarray Xác định vị trí vai trị gen MEST số gen liên quan đến q trình tăng sinh mỡ đường tín hiệu Hình 3.9 Biểu đồ heatmap dendrogram gen MEST gen có thay đổi biểu liên quan đến tăng sinh mỡ Giải thích: Giá trị mức độ biểu gen ánh xạ thành gradient màu sắc heatmap, màu xanh da trời thể mức độ biểu thấp, màu vàng thể mức độ biểu trung bình màu đỏ thể mức độ biểu cao Trục x tên 32 mẫu thí nghiệm, trục y 42 gen quan tâm Gen có mức độ biểu cao gen Gdpd2 mẫu mô mỡ chuột 21 ngày tuổi nuôi điều kiện 17℃ Bên cạnh đó, mức độ biểu gen thấp tập trung vào số mẫu mô mỡ chuột nuôi 29℃ độ tuổi Heatmap xếp 54 theo thứ tự giảm dần giá trị trung bình gen tất mẫu Điều cho phép gen có mức độ biểu tương tự nhóm lại với thành cụm Nhìn chung biểu gen gen MEST mức độ trung bình so sánh với mức độ biểu gen lại Sự thay đổi mức độ biểu gen MEST mẫu có tương đồng với cụm gen bao gồm 13 gen sau: Hmgcs1, Lpgat1, Acaca, Cyp11a1, Gdpd2, Pla2g5, Hmgcs2, B4galnt1, Acap1, B3gnt5, Cyp4f18, Ptpn22, Pla2g2d Tiếp tục phân tích KEGG với gen MEST 13 gen có thay đổi biểu mRNA tương tự gen MEST, chúng tơi nhận thấy có 8/13 gen liên quan đến đường trao đổi chất với giá trị p-value < 0,05 55 CHƯƠNG BÀN LUẬN Là gen có biểu cao mơ mỡ, đặc biệt mô mỡ trắng, gen MEST cho có liên quan đến q trình tăng sinh tế bào mỡ mở rộng mơ mỡ, từ gợi ý marker sinh học đích điều trị cho tình trạng béo phì [3] Tuy nhiên nhà nghiên cứu chưa trả lời câu hỏi chế xác cho ảnh hưởng gen MEST lên phát triển mơ mỡ Đã có số mơ hình nghiên cứu mức độ biểu mRNA gen MEST tăng lên chuột nuôi chế độ ăn giàu chất béo, nhiên chưa có nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng yếu tố khác Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ thay đổi điều kiện độ tuổi chuột hay điều kiện nhiệt độ môi trường 4.1 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ thay đổi độ tuổi Trong nghiên cứu chúng tôi, biểu gen MEST mô mỡ vùng đùi chuột cao giai đoạn 10 ngày tuổi, giảm mạnh tới khoảng 60 lần chuột giai đoạn 21 ngày tuổi Kết tương đồng với kết nghiên cứu Chu cộng (2017) nghiên cứu số tác giả cho marker tăng sinh mỡ MEST, BMP3, SFRP5 hay CAV1, có biểu cao giai đoạn sinh, giảm mạnh theo thời gian chuột trưởng thành [1, 40] Các gen tăng biểu trở lại chuột phơi nhiễm với yếu tố gây béo phì, ví dụ chế độ ăn giàu chất béo Gen MEST biểu cao giai đoạn sơ sinh gen có vai trị quan trọng phát triển phơi q trình biệt hóa mơ, với vai trị quan trọng q trình trao đổi chất cung cấp lượng cho sinh trưởng Do mức độ biểu gen MEST giảm dần mơ q trình biệt hóa mơ hoàn tất theo thời gian sinh trưởng chuột [47] Đối với mô mỡ, sụt giảm mức độ biểu gen MEST từ giai đoạn sơ sinh đến giai đoạn cai sữa sau giai đoạn trưởng thành cịn giải thích số lý khác Thứ thay đổi lớn tỷ lệ mô mỡ thể Giai đoạn sơ sinh giai đoạn mô mỡ phát triển nhanh chóng 56 nhất, giảm dần trưởng thành, nhu cầu biểu gen liên quan đến phát triển mơ mỡ MEST giảm dần Thứ hai thay đổi hormone ảnh hưởng đến mô mỡ Một số hormone insulin, glucocorticoid adrenalin giữ vai trị phát triển hoạt động mô mỡ Sự thay đổi nồng độ hormon theo độ tuổi ảnh hưởng đến việc điều tiết biểu MEST mô mỡ Thứ ba thay đổi tốc độ trao đổi chất mô mỡ Trao đổi chất mô mỡ cao thời kỳ sơ sinh (8-10 ngày) cai sữa (khoảng tuần tuổi = 21 ngày tuổi), phát triển mơ mỡ cần nhanh chóng diễn Khi tốc độ trao đổi chất giảm tuổi trưởng thành, biểu gen liên quan đến trao đổi chất MEST giảm xuống [48] Bên cạnh chức chuyển hóa, mơ mỡ cịn chứa phức hợp tế bào thần kinh, miễn dịch có chức nội tiết quan trọng, với số cytokin adiponectin, leptin hay chất ức chế trình hoạt hóa plasminogen-1,…[49] Trong nghiên cứu chúng tơi xác định 839 gen có thay đổi mức độ biểu mRNA thay đổi độ tuổi, chủ yếu gen liên quan đến phát triển hệ miễn dịch, bao gồm trình feedback âm, tăng sinh tế bào bạch cầu, trình kết dính bạch cầu, q trình tăng sinh biệt hóa tế bào lympho, q trình điều hịa hoạt động tế bào T,… Điều phần chứng minh phát triển mạnh mẽ mô mỡ thời kỳ phát triển từ sơ sinh đến trưởng thành chuột Kết phân tích thể gen cho thấy có 41 gen có thay đổi mức độ biểu gen chuột độ tuổi khác liên quan tới q trình điều hịa oxy hóa acid béo, q trình chuyển hóa acid béo, q trình điều hịa sinh tổng hợp lipid, đáp ứng với lipid tế bào, trình chuyển hóa lipid Các q trình sinh học liên quan trực tiếp đến tăng sinh mỡ Cụ thể, q trình điều hịa oxy hóa acid béo quy định việc chuyển đổi acid béo Omega-3 Omega-6 thành prostaglandin, leukotrien thromboxan, hợp chất có vai trị việc kích thích tăng trưởng tế bào tăng sinh mơ mỡ Khi q trình oxy hóa acid béo điều tiết tăng lên, dẫn đến việc tiết nhiều hormone kích thích tăng trưởng, góp phần vào tích lũy lipid tăng sinh mơ mỡ [50] Q trình chuyển hóa acid béo bao gồm esterase acyltransferase, enzym chuyển đổi acid béo thành triglycerid phospholipid Khi enzym hoạt động mạnh hơn, dẫn đến việc tích lũy lipid tăng sinh mơ 57 mỡ Q trình điều hịa sinh tổng hợp lipid đáp ứng tế bào với lipid quy định việc sản xuất triglycerid, phospholipid, acetyl-CoA ester cholesterol, hợp chất cần thiết để tăng kích cỡ tế bào mỡ Khi tổng hợp lipid điều tiết tăng lên, dẫn đến việc tích lũy lipid tăng sinh mơ mỡ Cuối cùng, q trình chuyển hóa lipid cho phép giải phóng acid béo từ triglycerid tổng hợp chúng thành triglycerid [51] Sự thay đổi mức độ biểu gen tăng sinh mỡ này, phần lớn tăng mức độ biểu mRNA chuột tăng độ tuổi, nguyên nhân dẫn đến gia tăng hoạt động q trình sinh học, hồn thiện chức chuyển hóa chuột từ giai đoạn sơ sinh đến giai đoạn cai sữa cuối giai đoạn trưởng thành Trong số gen Acsm3, Cyp2e1, Slc27a2 họ gen Mup xuất lúc nhiều trình sinh học, mức độ biểu gen tăng từ 30 đến 60 lần chuột giai đoạn 21 ngày tuổi so với giai đoạn 10 ngày tuổi Đây gen nằm nhóm gen có tỉ lệ thay đổi mức độ biểu lớn thay đổi độ tuổi chuột Điều gợi ý nhu cầu lipid cấp thiết thể, trình tăng sinh mỡ trình có phát triển mạnh mẽ chuột từ sau giai đoạn sơ sinh giai đoạn trưởng thành Cụ thể, gen Acsm3 (Acetyl-CoA synthetase medium-chain-3) mã hóa cho protein Acsm3 tham gia vào trình chuyển đổi acid béo có độ dài trung bình thành acetylcoA, phân tử trung gian quan trọng chuyển hóa lipid, chuyển hóa glucose cân nội mơi Ngồi ra, chuột trưởng thành có nhu cầu lượng cao hoạt động vận động trao đổi chất tăng Protein Acsm3 cung cấp nguồn acetyl-CoA cho trao đổi glucose sử dụng acid béo làm nguồn lượng, biểu gen Acsm3 cần tăng để đáp ứng nhu cầu lượng cao Khi chuột trưởng thành, thể tăng kích cỡ phát triển mơ mỡ để tích lũy lượng dạng lipid dẫn đến nhu cầu lipid tăng lên Protein Acsm3 tham gia vào q trình chuyển hóa acid béo thành triglyceride, biểu gen Acsm3 tăng để hỗ trợ trình tích lũy lipid mỡ [52] Gen Cyp2e1 gen mã hóa cho enzym cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) chuột CYP2E1 enzym quan trọng q trình chuyển hóa phân huỷ hợp chất độc hại thể Sự tăng biểu gen Cyp2e1 chuột trưởng thành giải thích việc nhu cầu chuyển hóa hợp chất độc hại 58 tăng cao Khi chuột lớn lên, chúng có xu hướng tiếp xúc nhiều với mơi trường xung quanh thường phải chuyển hóa nhiều chất độc hại Do đó, gen Cyp2e1 kích hoạt để tạo nhiều enzym CYP2E1 để phục vụ cho q trình chuyển hóa phân huỷ chất [53] Bên cạnh đó, Cyp2e1 enzym CYP2E1 cịn đóng vai trị định q trình chuyển hóa chất béo thể Cụ thể, CYP2E1 cho enzym tham gia vào trình oxy hóa acid béo giúp tăng tỷ lệ chuyển hóa acid béo thành chất trung gian sinh lượng acetyl-CoA Do đó, tăng biểu gen Cyp2e1 liên quan đến tăng cường chuyển hóa tổng hợp lipid, đóng vai trị quan trọng q trình hình thành mơ mỡ [54] Gen Slc27a2 (cịn gọi FATP2) mã hóa cho loại protein vận chuyển acid béo qua màng tế bào tìm thấy chủ yếu mơ mỡ mô khác gan, bắp đại não Các nghiên cứu Slc27a2 đóng vai trị quan trọng q trình chuyển hóa axit béo tổng hợp lipid, ảnh hưởng đến tình trạng sức khỏe thể Biểu gen Slc27a2 thường tăng cao theo độ tuổi chuột trưởng thành Điều liên quan đến việc thể chuột trưởng thành cần nhiều chất béo để cung cấp lượng cho hoạt động sinh hoạt hàng ngày, đặc biệt mô bắp gan [7] Trong mơ hình thí nghiệm chuột C57BL/6J gây béo phì chế độ ăn giàu chất béo, Choi cộng (2015) cho chế độ ăn giàu chất béo làm giảm biểu gen điều khiển hệ thống chống oxy hóa Cyp2e1, gen liên quan đến trình hấp thu vận chuyển acid béo Slc27a2, gen liên quan đến q trình oxy hóa Acacb Acsm3 [55] Kết ngược lại với thay đổi mức độ biểu gen kể trình phát triển chuột từ 10 ngày tuổi đến 21 ngày tuổi Điều chứng tỏ chế độ ăn giàu chất béo có ảnh hưởng ngược lại với trình sinh học tự nhiên thể, đặc biệt trình liên quan đến chuyển hóa lipid tăng sinh mỡ Họ gen Mup (Major urinary protein) nhóm gen mã hóa cho protein chủ yếu tìm thấy nước tiểu động vật Tương đồng với kết nghiên cứu chúng tôi, Wu cộng (2015) biểu họ gen Mup tăng lên đáng kể chuột trưởng thành Điều giải thích thay đổi 59 chế điều khiển gen trình tăng trưởng phát triển mô mỡ [56] Gen Mup xác định gen mở rộng vùng kích hoạt gen (enhancer) cực mạnh mô mỡ chuột trưởng thành, khiến cho mRNA Mup sản xuất mức độ cao so với chuột non [56] Một số nghiên cứu cho thấy Mup ảnh hưởng đến việc phân bổ mơ mỡ thể, tăng cường biểu gen Mup dẫn đến giảm thiểu mô mỡ gan tăng mạnh mẽ mô mỡ thể, đặc biệt vùng bụng [57, 58] Gen MEST gen chưa nghiên cứu nhiều, chưa có thơng tin phân tích đường sinh học liệu KEGG Trong đó, từ biểu đồ heatmap nhận thấy đặc điểm biểu gen MEST 32 mẫu mơ mỡ thí nghiệm khác có nét tương đồng với đặc điểm biểu cụm gen bao gồm 13 gen: Hmgcs1, Lpgat1, Acaca, Cyp11a1, Gdpd2, Pla2g5, Hmgcs2, B4galnt1, Acap1, B3gnt5, Cyp4f18, Ptpn22, Pla2g2d 8/13 gen nằm đường trao đổi chất Điều gợi ý có có mặt gen MEST đường Tuy nhiên kết luận chưa rõ ràng cần thêm nghiên cứu sâu để tìm mối liên hệ xác MEST đường 4.2 Sự thay đổi mức độ biểu mRNA gen MEST gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ thay đổi nhiệt độ môi trường Phơi nhiễm với nhiệt độ thấp từ môi trường từ lâu coi biện pháp kích thích q trình sinh nhiệt để tăng tiêu hao lượng dư thừa, kích thích q trình biệt hóa mỡ nâu Trong nghiên cứu chuột thí nghiệm, Rosell cộng (2013) cho chuột phơi nhiễm với mức nhiệt 6℃, nhận thấy có thay đổi mức độ biểu mRNA gen liên quan đến chuyển hóa acid béo, sinh tổng hợp acid mật, gen hoạt hóa PPAR𝛼, p53 hay PI3K/AKT nghiên cứu Rosell cộng (2013) [5] Nghiên cứu gần Yuko cộng (2020) báo cáo tăng mức độ biểu gen UCP1, đại diện cho mức độ hoạt động mô mỡ nâu phơi nhiễm lạnh [59] Câu hỏi đặt liệu phơi nhiễm lạnh có ảnh hưởng đến biểu gen mô mỡ trắng hay khơng, có ngưỡng nhiệt độ 60 Trong nghiên cứu Rosell cộng (2015) chuột thí nghiệm phơi nhiễm mức nhiệt độ 6℃, 28℃, tác giả tìm thấy tăng biểu mô mỡ vùng bụng số gen liên quan đến đường chuyển hóa acid béo, propanoat, hay q trình kéo dài mạch acid béo chuột 6℃ [7] Tuy nhiên nghiên cứu chúng tôi, so sánh chuột ni 17℃ với nhóm 29℃, chúng tơi khơng tìm thấy thay đổi mức độ biểu gen liên quan đến tăng sinh mỡ Chúng khơng tìm thấy thay đổi mức độ biểu gen đại diện cho mỡ nâu UCP1 Điều mức nhiệt 17℃ chưa đủ thấp để kích hoạt thay đổi hoạt động gen mô mỡ Chúng tìm thấy 11 gen có thay đổi mức độ biểu có ý nghĩa thống kê thay đổi nhiệt độ môi trường, bao gồm: Cpa1, Krt71, C1qtnf3, Adamts18, Gsg1l, Copg2as2, Mup6, Gys2, Zbtb7c, 0610005C13Rik 8430408G22Rik Gen C1qtnf3 biết đến với chức giảm đường huyết chống viêm [60], thay đổi biểu gen nhiễm lạnh chế bảo vệ thể khỏi tổn thương Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu biểu gen kể Việc thay đổi biểu chúng liên quan đến thích nghi thể với môi trường lạnh bảo vệ tế bào khỏi tác động tiêu cực nhiệt độ thấp Dựa theo kết nghiên cứu chúng tôi, chưa tìm nhóm chức hay đường sinh học giải thích cho thay đổi đồng thời mức độ biểu gen gen Nhưng thay đổi biểu gợi ý tồn vai trò chưa chứng minh gen phát triển mô mỡ Điểm mạnh nghiên cứu thiết lập quy trình xử lý phân tích liệu microarray sử dụng câu lệnh ngôn ngữ lập trình R, dễ dàng việc thay đổi tham số phân tích khơng phí Bên cạnh việc phân tích gen mối tương quan với nhiều gen khác mang lại tranh tổng quát so với tập trung nghiên cứu gen cụ thể Dữ liệu microarray liệu khổng lồ, việc khai thác đặc điểm biểu gen khơng dừng lại riêng gen đó, mà khai thác thay đổi chúng mối quan hệ với hàng nghìn gen khác Vì việc khai thác liệu thứ cấp từ microarray hướng phù hợp bối cảnh Các kết nghiên 61 cứu bước đệm cho nghiên cứu thực nghiệm lớn Tuy nhiên nghiên cứu tồn số điểm hạn chế Do sử dụng liệu đầu vào liệu chia sẻ từ nhóm nghiên cứu khác, chúng tơi khơng kiểm sốt khơng thay đổi điều kiện thí nghiệm, dẫn đến số kết phân tích cịn hạn chế, có điều kiện chúng tơi chưa khảo sát Vì để có phân tích cụ thể điều kiện mong muốn, cần phải thiết kế thí nghiệm thực nghiệm để kiểm chứng kết nghiên cứu, mở rộng phân tích liệu nhiều nhóm điều kiện thay đổi 62 KẾT LUẬN + Nghiên cứu tiến hành xử lý liệu thô microarray thực bước phân tích R liệu biểu 31 275 gen 32 mẫu mô mỡ vùng đùi chuột thí nghiệm 10 ngày tuổi 21 ngày tuổi nuôi 17℃ 29℃ + Mức độ biểu mRNA gen Mest mô mỡ chuột 10 ngày tuổi cao gấp khoảng 40 đến 60 lần mức độ biểu chuột 21 ngày tuổi mức nhiệt độ môi trường (p-value hiệu chỉnh < 0,05) + Khơng có thay đổi có ý nghĩa thống kê mức độ biểu mRNA gen Mest chuột nuôi 17℃ 29℃ + Phát 839 gen có thay đổi mức độ biểu mRNA mô mỡ chuột thay đổi độ tuổi, từ phát 41 gen liên quan đến trình tăng sinh mỡ 36/41 gen tăng mức độ biểu mRNA mô mỡ chuột 21 ngày tuổi so với chuột 10 ngày tuổi + Phát 11 gen có thay đổi mức độ biểu mRNA mô mỡ chuột thay đổi nhiệt độ, bao gồm: Cpa1, Krt71, C1qtnf3, Adamts18, Gsg1l, Copg2as2, Mup6, Gys2, Zbtb7c, 0610005C13Rik 8430408G22Rik + Xây dựng cụm gen có đặc điểm biểu mRNA tương đồng bao gồm: gen MEST 13 gen: Hmgcs1, Lpgat1, Acaca, Cyp11a1, Gdpd2, Pla2g5, Hmgcs2, B4galnt1, Acap1, B3gnt5, Cyp4f18, Ptpn22, Pla2g2d liên quan đến trình tăng sinh mỡ KIẾN NGHỊ - Tiến hành thực nghiệm qRT-PCR điều kiện độ tuổi nhiệt độ chuột để kiểm chứng thay đổi mức độ biểu gen Mest số gen liên quan đến tăng sinh mỡ - Tiếp tục mở rộng khảo sát thay đổi mức độ biểu gen trên, điều kiện khác tích hợp với kết nghiên cứu có (ví dụ thay đổi khoảng nhiệt độ, khoảng độ tuổi, chế độ ăn) với liệu microarray tương tự 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 Chu, Dinh-Toi, et al (2017), "C57BL/6J mice as a polygenic developmental model of diet-induced obesity", Physiological Reports, 5(7), p e13093 Govindarajan, R., et al (2012), "Microarray and its applications"(09757406 (Electronic)) Shen, Yuntian, et al (2019), "Microarray Analysis of Gene Expression Provides New Insights Into Denervation-Induced Skeletal Muscle Atrophy", 10 Jura, Magdalena, et al (2016), "Mest and Sfrp5 are biomarkers for healthy adipose tissue", Biochimie, 124, pp 124-133 Voigt, Anja, et al (2015), "Identification of Mest/Peg1 gene expression as a predictive biomarker of adipose tissue expansion sensitive to dietary antiobesity interventions", Genes & Nutrition, 10(5), p 27 Kadota, Yoshito, et al (2022), "Mouse mesoderm-specific transcript inhibits adipogenic differentiation and induces trans-differentiation into hepatocyte-like cells in 3T3-L1 preadiocytes", BMC Research Notes, 15(1), p 164 Rosell, Meritxell, et al (2014), "Brown and white adipose tissues: intrinsic differences in gene expression and response to cold exposure in mice", American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 306(8), pp E945-E964 Buccitelli, Christopher and Selbach, Matthias (2020), "mRNAs, proteins and the emerging principles of gene expression control", Nature Reviews Genetics, 21(10), pp 630-644 Agapito, Giuseppe (2019), "Computer Tools to Analyze Microarray Data", in Bolón-Canedo, Verónica and Alonso-Betanzos, Amparo, Editors, Microarray Bioinformatics, Springer New York, New York, NY, pp 267282 Dufva, Martin (2009), "Introduction to Microarray Technology", in Dufva, Martin, Editor, DNA Microarrays for Biomedical Research: Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 1-22 McLachlan, Geoffrey J, Do, Kim-Anh, and Ambroise, Christophe (2005), "Analyzing microarray gene expression data" Nimse, S B., et al (2014), "Immobilization techniques for microarray: challenges and applications", Sensors (Basel)(1424-8220 (Electronic)) Oostlander, A E., Meijer, G A., and Ylstra, B (2004), "Microarray-based comparative genomic hybridization and its applications in human genetics", Clinical Genetics, 66(6), pp 488-495 Ramdas, Latha and Zhang, Wei (2006), "Microarray Image Scanning", in Taatjes, Douglas J and Mossman, Brooke T., Editors, Cell Imaging 64 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Techniques: Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 261273 Rueda, Luis (2018), Microarray image and data analysis: Theory and practice, CRC Press Quackenbush, John (2002), "Microarray data normalization and transformation", Nature Genetics, 32(4), pp 496-501 Koschmieder, André, et al (2012), "Tools for managing and analyzing microarray data", Briefings in Bioinformatics, 13(1), pp 46-60 Gentleman, Robert (2008), R programming for bioinformatics, CRC Press Pelizzola, Mattia, et al (2006), "AMDA: an R package for the automated microarray data analysis", BMC Bioinformatics, 7(1), p 335 Saeed, A I., et al (2003), "TM4: A Free, Open-Source System for Microarray Data Management and Analysis", BioTechniques, 34(2), pp 374-378 Ji, Hongkai, et al (2008), "An integrated software system for analyzing ChIP-chip and ChIP-seq data", Nature Biotechnology, 26(11), pp 12931300 Sharan, Roded, Maron-Katz, Adi, and Shamir, Ron (2003), "CLICK and EXPANDER: a system for clustering and visualizing gene expression data", Bioinformatics, 19(14), pp 1787-1799 Saldanha, Alok J (2004), "Java Treeview—extensible visualization of microarray data", Bioinformatics, 20(17), pp 3246-3248 Chu, Dinh-Toi and Gawronska-Kozak, Barbara (2017), "Brown and brite adipocytes: Same function, but different origin and response", Biochimie, 138, pp 102-105 Ikeda, Kenji, Maretich, Pema, and Kajimura, Shingo (2018), "The Common and Distinct Features of Brown and Beige Adipocytes", Trends in Endocrinology & Metabolism, 29(3), pp 191-200 Paulus, Andreas and Bauwens, Matthias (2023), "Chapter - Brown adipose tissue: metabolic role and non-invasive quantification in humans", in Lamb, Hildo J., Editor, Visceral and Ectopic Fat, Elsevier, pp 25-37 Gesta, Stephane, Tseng, Yu-Hua, and Kahn, C Ronald (2007), "Developmental Origin of Fat: Tracking Obesity to Its Source", Cell, 131(2), pp 242-256 Chu, Dinh-Toi and Tao, Yang (2017), "Human thermogenic adipocytes: a reflection on types of adipocyte, developmental origin, and potential application", Journal of Physiology and Biochemistry, 73(1), pp 1-4 Coelho, M., Oliveira T Fau - Fernandes, Ruben, and Fernandes, R., "Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ"(1734-1922 (Print)) Luo, Liping and Liu, Meilian (2016), "Adipose tissue in control of metabolism", Journal of Endocrinology, 231(3), pp R77-R99 65 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Fedorenko, Andriy, Lishko, Polina V, and Kirichok, Yuriy (2012), "Mechanism of Fatty-Acid-Dependent UCP1 Uncoupling in Brown Fat Mitochondria", Cell, 151(2), pp 400-413 Chu, Dinh-Toi, et al (2016), "Cell source, differentiation, functional stimulation, and potential application of human thermogenic adipocytes in vitro", Journal of Physiology and Biochemistry, 73(3), pp 315-321 Turner, Russell T., et al (2020), "Effects of Propranolol on Bone, White Adipose Tissue, and Bone Marrow Adipose Tissue in Mice Housed at Room Temperature or Thermoneutral Temperature", Frontiers in Endocrinology, 11 Chabowska-Kita, Agnieszka, et al (2015), "Low ambient temperature during early postnatal development fails to cause a permanent induction of brown adipocytes", The FASEB Journal, 29(8), pp 3238-3252 Soukas, A., et al., "Leptin-specific patterns of gene expression in white adipose tissue"(0890-9369 (Print)) Takahashi, Mayumi, Kamei, Yasutomi, and Ezaki, Osamu (2005), "Mest/Peg1 imprinted gene enlarges adipocytes and is a marker of adipocyte size", American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 288(1), pp E117-E124 Koza, Robert A., et al (2006), "Changes in Gene Expression Foreshadow Diet-Induced Obesity in Genetically Identical Mice", PLOS Genetics, 2(5), p e81 Nikonova, L., et al., "Mesoderm-specific transcript is associated with fat mass expansion in response to a positive energy balance"(1530-6860 (Electronic)) van Nguyen, Dinh, et al (2020), "Gene expression profiling in allopurinolinduced severe cutaneous adverse reactions in Vietnamese", Pharmacogenomics, 21(14), pp 985-994 Kozak, Leslie P., et al (2010), "The Early Nutritional Environment of Mice Determines the Capacity for Adipose Tissue Expansion by Modulating Genes of Caveolae Structure", PLOS ONE, 5(6), p e11015 Jaroslawska, Julia, et al (2015), "Npvf: Hypothalamic Biomarker of Ambient Temperature Independent of Nutritional Status", PLOS Genetics, 11(6), p e1005287 Kathleen Kerr, M and A Churchill, Gary (2001), "Statistical design and the analysis of gene expression microarray data", Genetics Research, 77(2), pp 123-128 Shakya, K., et al (2010), Comparison of Microarray Preprocessing Methods, Advances in Computational Biology, Springer New York, New York, NY, pp 139-147 Chen, J J., et al (2007), "Selection of differentially expressed genes in microarray data analysis", The Pharmacogenomics Journal, 7(3), pp 212220 66 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Franco, Manuel and Vivo, Juana-María (2019), "Cluster Analysis of Microarray Data", in Bolón-Canedo, Verónica and Alonso-Betanzos, Amparo, Editors, Microarray Bioinformatics, Springer New York, New York, NY, pp 153-183 Kanehisa, Minoru (2002), "The KEGG Database", ‘In Silico’ Simulation of Biological Processes, pp 91-103 Mayer, Wolfgang, et al (2000), "Expression of the imprinted genes MEST/Mest in human and murine placenta suggests a role in angiogenesis", Developmental Dynamics, 217(1), pp 1-10 Moreno-Mendez, Ericka, et al (2020), "Early-life programming of adipose tissue", Nutrition Research Reviews, 33(2), pp 244-259 Kershaw, Erin E and Flier, Jeffrey S (2004), "Adipose Tissue as an Endocrine Organ", The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 89(6), pp 2548-2556 Nakamura, Manabu T., Yudell, Barbara E., and Loor, Juan J (2014), "Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids", Progress in Lipid Research, 53, pp 124-144 Haczeyni, F., Bell-Anderson, K S., and Farrell, G C (2018), "Causes and mechanisms of adipocyte enlargement and adipose expansion", Obesity Reviews, 19(3), pp 406-420 Davis, McKale R., et al (2012), "Enhanced expression of lipogenic genes may contribute to hyperglycemia and alterations in plasma lipids in response to dietary iron deficiency", Genes & Nutrition, 7(3), pp 415-425 Zhang, Youbo, et al (2022), "Crosstalk between CYP2E1 and PPARα substrates and agonists modulate adipose browning and obesity", Acta Pharmaceutica Sinica B, 12(5), pp 2224-2238 Yoshinari, Kouichi, et al (2004), "Expression and Induction of Cytochromes P450 in Rat White Adipose Tissue", Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 311(1), p 147 Choi, Myung-Sook, et al (2015), "High-fat diet decreases energy expenditure and expression of genes controlling lipid metabolism, mitochondrial function and skeletal system development in the adipose tissue, along with increased expression of extracellular matrix remodelling- and inflammation-related genes", British Journal of Nutrition, 113(6), pp 867-877 Wu, Yu, et al (2008), "Differential screening identifies transcripts with depot-dependent expression in white adipose tissues", BMC Genomics, 9(1), p 397 Kim, Juhae, Choi, Alee, and Kwon, Young H (2020), Maternal Protein Restriction Altered Insulin Resistance and Inflammation-Associated Gene Expression in Adipose Tissue of Young Adult Mouse Offspring in Response to a High-Fat Diet, Nutrients, Editor^Editors 67 58 59 60 Giller, K., et al (2013), "Major urinary protein 5, a scent communication protein, is regulated by dietary restriction and subsequent re-feeding in mice", Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 280(1757), p 20130101 Okamatsu-Ogura, Yuko, et al (2020), "UCP1-dependent and UCP1independent metabolic changes induced by acute cold exposure in brown adipose tissue of mice", Metabolism, 113, p 154396 Murayama, Masanori A., et al (2014), "CTRP3 plays an important role in the development of collagen-induced arthritis in mice", Biochemical and Biophysical Research Communications, 443(1), pp 42-48 68