Thuyet minh dhh 2023 luong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ THUYẾT MINH ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC HUẾ TÊN ĐỀ TÀI Nghiên cứu tối ưu hóa hệ thống biểu protein tái tổ hợp nấm men Saccharomyces cerevisiae LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU DHH2023-01-210 LOẠI HÌNH NGHIÊN CỨU Tự nhiên X Kỹ thuật & Công nghệ MÃ SỐ Xã hội Nông nghiệp Nhân văn Y dược Cơ Ứng dụng Triển khai X tháng Từ tháng năm 2023 đến tháng 12 năm 2024 THỜI GIAN THỰC HIỆN: CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI Tên quan: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Họ tên thủ trưởng CQ chủ trì đề tài: PGS TS Võ Thanh Tùng Địa chỉ: 77 Nguyễn Huệ, Thành phố Huế Điện thoại: 0234 3823290 Fax: 0234 3824901 E-mail: CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Họ tên: Nguyễn Ngọc Lương Năm sinh: Chức danh, học vị: TS- GV Địa chỉ: 16 Nguyễn Hữu Thọ Điện thoại: 0912743155 E-mail: luongnguyenbio@hueuni.edu.vn NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA ĐỀ TÀI Đơn vị công tác, lĩnh vực TT Họ tên chuyên môn Nội dung nghiên cứu giao Lê Thị Hà Thanh (TS) Khoa Sinh học, Đại học Khoa học, Đại học HuếVi sinh học, Sinh học phân tử Sàng lọc promoter trình tự hoạt hóa ngược dịng nấm men S cerevisiae Nguyễn Hồng Bách (TS) Bộ môn Vi Sinh, Đại học Y Dược, Đại học Huế-Vi sinh học, Sinh học phân tử Sàng lọc terminator nấm men S cerevisiae Hoàng Dương Thu Hương (Ths) Khoa Sinh học, Đại học Khoa học, Đại học HuếVi sinh học, Sinh học phân tử Sàng lọc trình tự dẫn nấm men S cerevisiae, ni cấy thu sinh khối Ngô Thị Bảo Châu (Ths) Khoa Sinh học, Đại học Khoa học, Đại học HuếVi sinh học Sàng lọc trình tự dẫn nấm men S cerevisiae, nuôi cấy thu sinh khối Chữ ký Nguyễn Hoàng Tuệ (KS) Khoa Sinh học, Đại học Khoa học, Đại học HuếSinh học phân tử Tạo dòng biến nạp phân tích biểu Huỳnh Thị Thu Hà (KS) Khoa Sinh học, Đại học Khoa học, Đại học HuếSinh học phân tử Tạo dòng biến nạp phân tích biểu ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Tên đơn vị nước Nội dung nghiên cứu phối hợp Họ tên người đại diện 10 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 10.1 Trên giới (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài giới, liệt kê tài liệu trích dẫn tổng quan) Tổng quan tình hình nghiên cứu yếu tố điều hòa biểu nấm men Saccharomyces cerevisiae: 1.1 Protein phát huỳnh quang xanh tăng cường: Năm 1962, Shimomura Osamu cộng phát tồn loại protein có khả phát ánh sáng xanh lục loài sứa Aequorea victoria Protein đặt tên GFP (Green Fluorescent Protein) Trong thời gian dài bị chìm vào quên lãng, Chalfie nhóm nghiên cứu bắt đầu sử dụng GFP làm protein thị để nghiên cứu biểu gen nhằm thay cho gen thị thường dùng vào thời điểm beta-galactosidase, luciferase hay chloramphenicol acetyltransferase Tuy nhiên ban đầu ưu GFP so với protein nói chưa rõ ràng Đột phát xuất Cormack tìm biến thể GFP có cường độ phát sáng tăng gấp nhiều lần, gọi eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) Roger Tsien bắt đầu nghiên cứu chế phát sáng GFP tạo thêm số biến thể khác từ GFP có khả phát màu sắc khác Sự xuất eGFP tạo sóng ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng sinh học vào cuối thập kỷ 1990 đầu thập kỷ 2000 Năm 1999, nhóm nhà khoa học Nga tìm thấy thêm sáu protein có khả phát huỳnh quang tương tự GFP từ loài san hơ khu vực Thái Bình Dương-Ấn Độ Dương, số có protein phát huỳnh quang đỏ đặt tên DsRed (san hô Discosoma) Tương tự eGFP, sau người ta tìm thấy biến thể DsRed có cường độ sáng gập nhiều lần Roger Tsien cộng tạo biến thể màu có cường độ huỳnh quang cao nhiều lần so với biến thể gốc, DsRed cải tạo thành mCherry Những cống hiến Tsien nghiên cứu protein phát huỳnh quang dẫn đến việc ông Shinomura Osamu, Chalfie đồng nhận giải Nobel Hóa học vào năm 2008 Ngày protein phát huỳnh quang có nhiều ứng dụng nghiên cứu thực tiễn Phổ biến việc sử dụng chúng làm thị nghiên cứu biểu gen, đặc biệt dùng để sàng lọc đánh giá yếu tố điều hòa biểu gen enhancer, promoter, terminator v.v Bên cạnh protein phát huỳnh quang cịn sử dụng để theo dõi nghiên cứu trình nội bào, bao gồm trình bình thường lẫn trình bệnh lý ví dụ ung thư di Các protein phát huỳnh quang ưa chuộng sử dụng làm biosensor để nghiên cứu ô nhiễm kim loại độc tố môi trường, giám sát thay đổi điều kiện mơi trường ví dụ pH 1.2 Yếu tố điều hòa biểu nấm men S cerevisiae Như nói trên, ứng dụng phổ biến protein phát huỳnh quang làm thị báo cáo để đánh giá số yếu tố điều hòa biểu gen nhằm tìm yếu tố có tiềm thương mại hóa: ví dụ promoter, activator, enhancer, terminator trình tự dẫn signal peptide Đã có nhiều nghiên cứu giới sử dụng eGFP, mCherry thị báo cáo để khảo sát đánh giá yếu tố điều hòa biểu gen nói Lanza cs sử dụng eGFP làm protein báo cáo để nghiên cứu thuật toán tối ưu mã ba nấm men S cerevisiae Nhóm nghiên cứu Hal S Alper dùng eGFP để sàng lọc promoter nội sinh GPD, Gal1, với yếu tố hoạt hóa ngược dịng GFP/eGFP Alper cộng dùng để nghiên cứu phát triển promoter terminator nhân tạo nhằm phục vụ mục đích cải tiến đường chuyển hóa thứ cấp (metabolic engineering) nấm men Trong thời gian đó, nhóm nghiên cứu Huimin Zhao sàng lọc promoter nội sinh nấm men sử dụng GFP làm gen báo cáo Các nghiên cứu promoter nhìn chung lấy hai promoter phổ biến làm đối chứng: GPD làm đối chứng cho nhóm promoter thường trực (constitutive) Gal1 làm đối chứng cho nhóm promoter cảm ứng (inducible) Cho đến chưa có promoter phiên mã mạnh hai promoter nói Bên cạnh promoter có khả ảnh hưởng đến mức độ biểu gen, terminator chứng minh ảnh hưởng lớn khơng Nhóm nghiên cứu Alper xác định số terminator có khả làm tăng biểu gen điều khiển loại promoter Tương tự, Yoichiro Ito cs sàng lọc năm terminator xác định terminator làm tăng đáng kể biểu protein phát huỳnh quang Không dừng lại việc sàng lọc terminator, Kathleen A Curran cs phát triển terminator nhân tạo ngắn có khả điều chỉnh mức độ biểu gen tinh tế Những terminator cần thiết lĩnh vực cải tiến đường chuyển hóa thứ cấp Đối với mục đích sản xuất protein tái tổ hợp nấm men, protein biểu dạng tiết thường có lợi protein biểu nội bào giúp q trình thu hồi tinh chế dễ dàng Để protein tiết mơi trường, cần có trình tự dẫn (signal peptide) đầu N protein Hai nhóm trình tự dẫn thường sử dụng nhóm trình tự dẫn "pre" có chiều dài khoảng từ 18-22 axit amin (a.a) nhóm trình tự dẫn "prepro" có chiều dài 80 a.a Các trình tự prepro cho hiệu trình tự pre "dẫn dắt" protein đích từ lưới nội sinh chất đến máy Golgi (phần pre), sau phần pro dẫn dắt protein từ máy Golgi tế bào chất Hiện số trình tự prepro phổ biến dẫn xuất trình tự alpha mating factor prepro Để cải tiến hiệu "dẫn dắt" trình tự prepro, có nhiều nhà khoa học tiến hành sàng lọc biến thể tìm biến thể có hiệu suất tiết tăng từ vài đến vài trăm lần Ví dụ Rakestraw cs sử dụng tiến hóa định hướng (directed evolution) để tăng hiệu tiết trình tự prepro Trong John M Clements cs lại phát triển trình tự prepro tổng hợp có hiệu tiết tốt Gần đây, Pablo Aza cs phát triển thêm biến thể prepro để tăng thêm hiệu tiết Tuy nhiên hạn chế lớn trình tự dẫn đề cập chúng kiểm tra vài đối tượng mà nhóm nghiên cứu lựa chọn Thật đáng ngạc nhiên khơng có nghiên cứu nói sử dụng eGFP/GFP làm gen báo cáo Mức độ biểu gen nấm men phu thuộc vào số yếu tố điều hòa biểu khác Hai yếu tố quan tâm nhiều trình tự Kozak trình tự gây hiệu ứng "cầu nối" (ramping effect) Trình tự Kozak giúp ribosome dễ dàng xác định vị trí mã mở đầu, ảnh hưởng lớn đến tốc độ dịch mã Trong trình tự ramp giúp ribosome dàn mRNA để tránh tình trạng tắc nghẽn dịch mã Bên cạnh nhiều nghiên cứu trình tự 5' khơng dịch mã ngược dịng (5' UTR) ảnh hưởng đến biểu protein nấm men Ví dụ Shlomi Dvir cs xác định nguyên lý vùng 5' UTR chứa ATG (mã mở đầu) không khung đọc với mã mở đầu thật gen khiến tốc độ dịch mã bị giảm (có khả ribosome dễ nhầm lẫn ATG giả thật) Dựa kỹ thuật deep learning, Josh T Cuperus nghiên cứu đặc điểm 5' UTR Kozak để đưa trình tự 5' UTR thiết kế theo quy luật mà họ khám phá Những trình tự kiểm chứng thực nghiệm cho kết tốt Đối với hiệu dịch mã, Manasvi Verma cs nhận định a.a thứ đến thứ (tức sau trình tự Kozak) có vai trị cầu nối tạm để ribosome dàn mRNA mà khơng gây cản trở Và nhóm nghiên cứu xác định trình tự ramp cụ thể có khả làm tăng biểu E coli Tuy nhiên kết luận nhóm nghiên cứu chưa kiểm chứng nấm men Nấm men S cerevisiae vật chủ ưa chuộng để biểu protein tái tổ hợp, có nhiều loại enzyme ứng dụng công nghiệp số vaccine tiêm chủng đại trà Bên cạnh đó, ngày vi sinh vật cịn có nhiều ứng dụng quan trọng khác Một ứng dụng quan trọng biến nấm men thành nhà máy sản xuất thuốc thông qua cải tiến đường chuyển hóa thứ cấp Để làm điều này, cần có công cụ điều biến biểu gen tinh tế để điều chỉnh xác đường chuyển hóa cho sản phẩm mong muốn sản xuất nhiều Do việc tìm kiếm trình tự điều hòa biểu gen nhu cầu quan trọng, vừa có ý nghĩa nghiên cứu bản, vừa có ứng dụng thực tiễn Dựa thành tựu cơng trình cơng bố tác giả ngồi nước, chúng tơi xác định điểm cần phải làm sáng tỏ thêm để có cơng cụ biểu gen nấm men phục vụ cho đời sống Tài liệu tham khảo: eGFP/GFP/mCherry: Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and properties of Aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan Aequorea Journal of cellular and comparative physiology 59:223-239 Roger H, Andrew BC, Roger YT (1995) Improved green fluorescence Nature 373:663-664 Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S (1996) FACS optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) Gene 173 (1):33-38 Mikhail VM, Arkady FF, Yulii AL, Aleksandr PS, Andrey GZ, Mikhail LM, Sergey AL (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species Nature biotechnology 17(10):969-73 Nathan CS, Robert EC, Paul AS, Ben NGG, Amy EP, Roger YT (2004) Improved monomeric red, orang and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp red fluorescent protein Nature biotechnology 22(12): 1567-72 Ứng dụng protein phát huỳnh quang sàng lọc yếu tố điều hòa nấm men: John B, Rishi G, Ben R, Hal SP (2012) Controlling promoter strength and regulation in Saccharomyces cerevisiae using synthetic hybrid promoters Biotechnology and Bioengineering 109(11):2884-95 Yoichiro I, Mamoru Y, Akinori I, Chie I, Kenro T, Takao K, Takashi M (2013) Characterization of five terminator regions that increase the protein yield of a transgene in Saccharomyces cerevisiae Journal of Biotechnology 168(4):486-92 Kathleen AC, Ashty SK, Akash G, Hal SA (2013) Use of expression-enhancing terminatorsin Saccharomyces cerevisiae to increase mRNA half-life and improve gene expression control for metabolic engineering applications Metabolic engineering 88-97 Mamoru Y, Yoichiro I, Reiko K, Chie I, Satoshi K, Akinori I, Hisao M, Takashi M (2013) A Genome-Wide Activity Assessment of Terminator Regions in Saccharomyces cerevisiae Provides a ″Terminatome″ Toolbox ACS Synthetic Biology 2(6):337-47 Heidi R, Hal SA (2015) The development and characterization of synthetic minimal yeast promoters Nature Communications 6:7810 Jing L, Qiang L, Wen JS, Mario AM (2017) Nucleotides upstream of the Kozak sequence strongly influence gene expression in the yeast S cerevisiae Journal of Biological Engineering 11:25 Li PX, Ping PL, Zhu BD, Fei YF, Xue LZ (2021) Fine‑tuning the expression of pathway gene in yeast using a regulatory library formed by fusing a synthetic minimal promoter with different Kozak variants Microbial Cell Factories 20(1):148 Sàng lọc trình tự dẫn nấm men (không sử dụng protein phát huỳnh quang): John MC, Graham HC, Mikhael JP, Mark RE (1991) Secretion of human epidermal growth factor from Saccharomyces cerevisiae using synthetic leader sequences Gene 106(2):267-71 Andy JR, Stephen LS, Andrea P, Eugene A, Dane KW (2009) Directed Evolution of a Secretory Leader for the Improved Expression of Heterologous Proteins and Full-Length Antibodies in Saccharomyces cerevisiae Biotechnology and bioengineering 103(6):1192-201 Pablo A, Gonzalo M, Felipe de S, Susana C (2021) Design of an improved universal signal peptide based on the α‑factor mating secretion signal for enzyme production in yeast Cellular and molecular life science 78(7):3691-3707 10.2 Trong nước (phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu liên quan đến đề tài nước, liệt kê tài liệu trích dẫn tổng quan) Ở Việt Nam, protein phát huỳnh quang xanh GFP đỏ DsRed nghiên cứu cho số mục đích khác Ví dụ nhóm nghiên cứu Nguyễn Đức Hồng sử dụng GFP để đánh giá hiệu dung hợp đuôi His-Taq đầu C đầu N B subtilis Trong nhóm nghiên cứu Trần Văn Tuấn lại sử dụng GFP DsRed để đánh giá hiệu chuyển gen vào nấm sợi phương pháp A tumefaciens Gần Bùi Thị Hương nghiên cứu mức độ phá hủy n-alkanol đến tế bào E coli thông qua đánh giá đáp ứng stress promoter σE điều khiển phiên mã phiên khác GFP Bên cạnh đó, số nghiên cứu khác Nguyễn Hải Hà cs, Nguyễn Thị Nha Trang cs lại thử nghiệm biểu GFP eGFP tế bào động vật có vú chủng E coli khác Nhìn chung, hướng ứng dụng GFP nghiên cứu nước hạn chế Chưa có nhiều nghiên cứu sử dụng protein phát huỳnh quang để làm gen báo cáo đánh giá mức độ biểu protein Và có ứng dụng protein phát huỳnh quang vào lĩnh vực khác chẩn đốn mơi trường Tài liệu tham khảo: Hà NH, Hiền LTT, Hải NV (2009) Biểu protein phát huỳnh quang xanh (GFP) tế bào động vật có vú ni cấy Tạp chí Cơng nghệ sinh học 7(3): 313-318 Nam NH, Trang PTP, Thước TL, Hoàng NĐ (2014) Khảo sát biểu GFP dung hợp với His-Tag đầu N đầu C sử dụng plasmid pHT253 pHT254 Bacillus subtilis Tạp chí Phát triển KH&CN 17(4):5-11 Quỳnh HN, Khuyến NT, Phương TT, Tuấn TV (2017) Biểu protein phát huỳnh quang GFP DsRed chủng nấm sợi Aspergillus oryzae VS1 sử dụng phương pháp chuyển gen Agrobacterium tumefaciens Tạp chí Sinh học 39(2):199-209 Huong BT (2022) n-ankanol stress induced cell envelope injury of σE promoter in E coli Academia journal of Biology 44(2) Trang NTN, Ha HTT, Thao NP, Tho DTA, Trang CT, Thanh LTH, Tue NH, Loc NH, Luong NN (2022) Expression of a synthetic gene encoding the enhanced green fluorescent protein in various Escherichia coli strains Vietnam journal of Biotechnology 20(2) 10.3 Danh mục công trình cơng bố thuộc lĩnh vực đề tài chủ nhiệm thành viên tham gia đề tài (định dạng kiểu APA: “Họ tên tác giả (năm) Tên cơng trình Thơng tin xuất bản) Phung Thi Bich Hoa, Nguyen Hoang Tue, Le Thi Thu Huyen, Luc Hoang Linh, Nguyen Thanh Nhan, Nguyen Quang Duc Tien, Nguyen Ngoc Luong, Nguyen Xuan Huy, Nguyen Hoang Loc (2022) Overexpression of 42 kDa chitinase genes from Trichoderma asperellum SH16 in peanut (Arachis hypogaea) Journal of crop improvement Nguyen Thi Nha Trang, Huynh Thi Thu Ha, Nguyen Phuong Thao, Duong Thi Anh Tho, Cao Thi Trang, Le thi Ha Thanh, Nguyen Hoang Tue, Nguyen Hoang Loc, Nguyen Ngoc Luong (2022) Expression of a synthetic gene encoding the enhanced green fluorescent protein in various Escherichia coli strains Vietnam journal of Biotechnology 20(2):359-368 Nguyen Ngoc Luong, Nguyen Quang Duc Tien, Phung Thi Bich Hoa, Nguyen Hoang Tue, Mai Thi Thu Hien, Nguyen Hoang Loc, Nguyen Xuan Huy (2021) Optimizing the production of a functional type A recombinant endochitinase from Trichoderma asperellum in Escherichia coli Journal of Experimental and Agricultural Sciences 9(6):871-880 Nguyen Ngoc Luong, Nguyen Quang Duc Tien, Nguyen Xuan Huy, Le Quang Man, Nguyen Hoang Tue, Duong Duc Hoang Sinh, Dang Van Thanh, Duong Thi Kim Chi, Phung Thi Bich Hoa, Nguyen Hoang Loc (2021) Expression of 42 kDa chitinase of Trichoderma asperellum (Ta-CHI42) from a synthetic gene in Escherichia coli FEMS Microbiology Letters 368(16):fnab110 Nguyen Quang Duc Tien, Phung Thi Bich Hoa, Nguyen Hoang Tue, Dang Van Thanh, Hoang Anh Thi, Nguyen Ngoc Luong, Nguyen Xuan Huy, Nguyen Hoang Loc (2021) Transient expression of chi42 genes from Trichoderma asperellum in Nicotiana benthamiana by agroinfiltration International Journal of Agriculture and Biology 26(1):177-184 So KumKang, Chun Jeesun, Nguyen Ngoc Luong, Seo Hee Won, Kim Dae Hyuk (2021) Expression of an immunocomplex consisting of Fc fragment fused with a consensus dengue envelope domain III in Saccharomyces cerevisiae Biotechnology letters 43(9): 1895-1904 Jyotiranjan Bal, Chung Hee Young, Nguyen Ngoc Luong, Park Ji Sang, Jang Yong Suk, Kim Dae Hyuk (2018) Evaluation of cell-surface displayed synthetic consensus dengue EDIII cells as a potent oral vaccine candidate Microbial cell factories 17(1):1-13 Jyotiranjan Bal, Nguyen Ngoc Luong, Park Ji Sang, Song Ki Duk, Jang Yong Suk, Kim Dae Hyuk (2018) Comparative immunogenicity of preparations of yeast-derived dengue oral vaccine candidate Microbial cell factories 17(1):1-14 Nguyen Ngoc Luong, Phan Thi Minh Phuong (2018) Sản xuất kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên vỏ miền III virus dengue tuýp chuột nhắt trắng dịng balb/c Tạp chí khoa học Đại học Huế 127(1B) 10 Nguyen Ngoc Luong, So Kum Kang, Kim Jung Mi, Kim Sae Hae, Jang Yong Suk, Yang Moon Sik, Kim Dae Hyuk (2015) Expression and characterization of an M cell-specific ligandfused dengue virus tetravalent epitope using Saccharomyces cerevisiae Journal of Bioscience and Bioengineering 119(1):19-27 11 SỰ CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nấm men S cerevisiae vật chủ ưa chuộng biểu protein tái tổ hợp Nó vật chủ dùng sản xuất vaccine viêm gan B sử dụng rộng rãi toàn giới Và vật chủ khảo sát để dùng cho sản xuất vaccine bại liệt hệ (vaccine VLP) Tuy nhiên hạn chế biểu protein chủng nấm men mức độ biểu thường không cao E coli, chưa có nhiều lựa chọn thương mại có khả đảm bảo hiệu biểu đủ cao loại vật chủ để tạo điều kiện cho thương mại hóa sản phẩm Các nhà khoa học nỗ lực việc giải đáp quy luật ảnh hưởng đến điều hòa biểu nấm men này, số kết xác nhận nhiều cơng trình, bao gồm lựa chọn promoter, terminator trình tự dẫn (signal peptide) Tuy nhiên chưa có đánh giá so sánh kết hợp nhiều thành nghiên cứu để tìm cơng thức tối ưu cho sản xuất protein tái tổ hợp chủng nấm men Hiện phịng thí nghiệm CNSH chúng tơi có hướng phát triển chủng nấm men thành thể mang vaccine đa để phát triển vaccine đường uống Bên cạnh đó, chúng tơi định hướng nghiên cứu sản xuất kháng nguyên sử dụng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm vật chủ Để làm điều đó, cần chuẩn bị tối ưu điều kiện biểu vật chủ Đây sở để chọn đề tài nghiên cứu 12 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 12.1 Mục tiêu tổng thể Mục tiêu đề tài là: xác định tổ hợp enhancer/activator với promoter, terminator signal peptide cho hiệu suất biểu nội bào ngoại bào cao nấm men S cerevisiae 12.2 Các mục tiêu cụ thể Để đạt hai mục tiêu nêu trên, cần phải đạt mục tiêu cụ thể sau: - Biểu nội bào nấm men S cerevisiae: + Xác định tổ hợp activator/enhancer +promoter + terminator có khả làm tăng biểu eGFP/mCherry điều khiển promoter GPD/Gal1 S cerevisiae - Biểu ngoại bào: + Xác định tổ hợp activator/enhancer/promoter/signal peptide/terminator có khả làm tăng biểu tiết ngoại bào eGFP/mCherry điều khiển promoter GPD/Gal1 S cerevisiae Mục tiêu phụ bao gồm sản xuất kháng thể đa dòng chuột kháng eGFP/mCherry kháng nguyên tinh khiết eGFP/mCherry để làm chứng dương 13 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 13.1 Đối tượng nghiên cứu Đề tài nghiên cứu trình tự điều hịa biểu nấm men S cerevisiae, bao gồm activator/enhancer, promoter, trình tự Kozak, signal peptide, trình tự ramp terminator, sử dụng protein phát huỳnh quang xanh (eGFP) đỏ (mCherry) làm gen báo cáo nhằm xác định combo tối ưu yếu tố điều hòa cho sản lượng biểu protein tái tổ hợp (protein phát huỳnh quang) cao 13.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung xác định combo yếu tố điều hòa cho hiệu biểu protein phát huỳnh quang nội bào ngoại bào tốt Đề tài không hướng đến kiểm tra liệu combo có hoạt động tốt protein đích khác hay khơng Phần lớn nội dung đề tài thực phịng thí nghiệm CNSH Bộ mơn CNSH, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế Một số nội dung thực Bệnh viện TW Huế (FACS) số sở nghiên cứu nước (Confocal) Thời gian thực đề tài năm (1/2023-12/2024) 14 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Nội dung công việc trình bày theo mục tiêu sau: Công việc 1: Chuẩn bị nguyên vật liệu Ở nội dung này, cần chuẩn bị nguyên vật liệu plasmid, gene eGFP, promoter, terminator, trình tự ramp, trình tự Kozak v.v Các trình tự tạo dòng thiết kế đưa vào plasmid biểu nội bào nấm men S cerevisiae chủng 2805/a7 Đồng thời cần chuẩn bị eGFP biểu E coli để làm chứng dương phục vụ cho việc sản xuất kháng thể kháng eGFP Sản xuất kháng thể kháng eGFP từ chuột để phục vụ cho thí nghiệm Western blot Sau chuẩn bị xong plasmid tái tổ hợp, tiến hành hóa biến nạp plasmid vào chủng nấm men sàng lọc để tìm 3-5 chủng nấm men cho cấu trúc biểu Quá trình sàng lọc tiến hành Western blot FACS Công việc 2: Khảo sát, sàng lọc xác định yếu tố điều hịa có khả làm tăng biểu eGFP nội bào S cerevisiae Tiến hành so sánh biểu nội bào eGFP chủng nấm men biến nạp plasmid mang trình tự điều hịa khác nhằm tìm combo enhancer + promoter + terminator cho kết biểu cao Quá trình sàng lọc tiến hành kỹ thuật FACS xác nhận Western blot Công việc 3: Khảo sát, sàng lọc xác định yếu tố điều hịa có khả làm tăng biểu eGFP ngoại bào S cerevisiae Tiến hành so sánh biểu ngoại bào eGFP chủng nấm men biến nạp plasmid mang trình tự điều hịa khác nhằm tìm combo enhancer + promoter + signal peptide + terminator cho kết biểu ngoại bào cao nhất, vào có tỉ lệ protein tiết cao (protein ngoại bào/protein nội bào) Nội dung tóm tắt sơ đồ đây: 15 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15.1 Cách tiếp cận (nếu có) Để sàng lọc nhiều yếu tố điều hòa lúc, cách tiếp cận sàng lọc yếu tố, tức giữ nguyên yếu tố điều hòa lại trình sàng lọc yếu tố điều hịa Ví dụ sàng lọc enhancer, promoter terminator giữ nguyên xác định enhancer mạnh Sau enhancer giữ lại để sàng lọc promoter Cuối tổ hợp enhancer/promoter tốt dùng để sàng lọc terminator Cách tiếp cận logic cho việc sàng lọc nhiều yếu tố điều hòa lúc 15.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp sử dụng đề tài bao gồm: - Phương pháp sinh học phân tử: kỹ thuật tạo dòng PCR, kỹ thuật nối gen OE-PCR, hóa biến nạp vào E coli nấm men S cerevisiae, Western blot, trắc lưu tế bào FACS - Phương pháp hóa sinh: kiểm tra nồng độ protein phương pháp Bradford - Phương pháp vi sinh: nuôi cấy tế bào thu sinh khối, nuôi lưu trữ tế bào, quan sát chụp ảnh tế bào vi sinh vật kính hiển vi - Phương pháp Tin sinh: thiết kế vector, thiết kế mồi - Phương pháp thống kê sinh học: t-Test, Anova 16 TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TT Nội dung, công việc thực Sản phẩm Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Người thực Cơng việc 1.1: Tạo dịng (từ gDNA nấm men) xác nhận trình tự trình tự enhancer, terminator signal peptide sử dụng đề tài Enhancer, terminator, signal peptide có trình tự xác 1/1/2023 - 1/4/2023 Nguyễn Ngọc Lương, Lê Thị Hà Thanh, Nguyễn Hoàng Bách,Nguyễn Hoàng Tuệ, Huỳnh Thị Thu Hà, Nguyễn Hồng Tuệ Cơng việc 1.2: Nếu cần thiết phải sửa đổi trình tự (ví dụ terminator/signal peptide) tiến hành tạo đột biến điểm cần thiết kỹ thuật OE-PCR Enhancer, terminator, signal peptide có trình tự xác 1/1/2023 - 1/6/2023 Lê Thị Hà Thanh, Nguyễn Hoàng Bách, Huỳnh Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Tuệ Cơng việc 1.3: Tạo dịng trình tự điều hịa vào vector biểu thích hợp, vector episomal yEp, lưu giữ (stock) vector tái tổ hợp Vector tái tổ hợp mang yếu tố điều hịa mong muốn 1/4/2023 - 1/8/2023 Nguyễn Hồng Bách, Huỳnh Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Tuệ Cơng việc 1.4: Tạo dịng eGFP vào vector biểu E coli tiến hành thu tinh chế kháng nguyên để sản xuất kháng thể đa dòng chuột Kháng nguyên tinh khiết 1/3/2023 - 1/8/2023 Nguyễn Ngọc Lương, Huỳnh Thị Thu Hà, Ngô Thị Bảo Châu Cơng việc 1.5: Sản xuất kháng thể đa dịng chuột kháng eGFP Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên 1/6/2023 - 1/9/2023 Nguyễn Ngọc Lương, Huỳnh Thị Thu Hà Công việc 1.6: Biến nạp vector tái tổ hợp nói vào nấm men Chủng nấm men tái tổ hợp mang plasmid tái tổ hợp chứa yếu tố điều hịa mong muốn Tìm enhancer/activator mong muốn 1/8/2023 - 1/9/2023 Lê Thị Hà Thanh, Huỳnh Thị Thu Hà, Nguyễn Hồng Tuệ Cơng việc 2.1: So sánh biểu eGFP nội bào chủng nấm men điều khiển enhancer khác Tìm enhancer cho biểu eGFP nội bào tốt 1/10/2023 1/1/2024 Lê Thị Hà Thanh, Huỳnh Thị Thu Hà, Ngơ Thị Bảo Châu, Hồng Dương Thu Hương Công việc 2.1: So sánh biểu eGFP nội bào chủng nấm men điều khiển terminator khác Tìm terminator cho biểu eGFP nội bào tốt 1/1/2024 - 1/3/2024 Nguyễn Hồng Bách, Huỳnh Thị Thu Hà, Ngơ Thị Bảo Châu, Hồng Dương Thu Hương Cơng việc 3.1: So sánh biểu ngoại bào eGFP chủng nấm men điều khiển signal peptide khác Tìm signal peptide cho biểu eGFP ngoại bào tốt 1/10/2023 1/1/2024 Lê Thị Hà Thanh, Huỳnh Thị Thu Hà, Nguyễn Hồng Tuệ 10 Cơng việc 3.2: So sánh biểu bào eGFP chủng nấm men điều khiển terminator khác Tìm terminator cho biểu eGFP ngoại bào tốt 1/1/2024 - 1/3/2024 Nguyễn Hoàng Bách, Huỳnh Thị Thu Hà, Ngơ Thị Bảo Châu, Hồng Dương Thu Hương 11 Viết gửi báo nước Hai (gửi đăng) 1/4/2024 - 1/5/2024 Nguyễn Ngọc Lương, Lê Thị Hà Thanh, Nguyễn Hoàng Bách 12 Viết gửi báo quốc tế SCISCIE thuộc danh mục Web of Science Một (gửi đăng) 1/4/2024 - 1/6/2024 13 Viết báo cáo tổng kết Báo cáo tổng kết 1/10/2024 1/12/2024 17 SẢN PHẨM DỰ KIẾN CỦA ĐỀ TÀI (Các mục có dấu * sản phẩm bắt buộc) 10 Nguyễn Ngọc Lương, Lê Thị Hà Thanh, Nguyễn Hoàng Bách STT Tên sản phẩm Số lượng Yêu cầu chất lượng 17.1 Sản phẩm khoa học (bài báo, sách…) Bài báo đăng tạp chí nước* Tạp chí Khoa học Đại học Huế Tạp chí Khoa học Công nghệ Trường Đại học Khoa học Huế Bài báo đăng tạp chí quốc tế 01 báo tạp chí WoS (SCIE) Scopus (Q1, Q2) 17.2 Sản phẩm đào tạo Luận văn thạc sĩ* Chuyên đề nghiên cứu sinh* Có nội dung liên quan đến đề tài chấm đạt trở lên Hỗ trợ Luận án tiến sĩ Khác 17.3 Sản phẩm ứng dụng Plasmid tái tổ hợp biểu nội bào S cerevisiae Mang promoter, terminator trình tự điều hịa khác giúp biểu nội bào mạnh S cerevisiae Plasmid tái tổ hợp biểu ngoại bào mạnh S cerevisiae Plasmid mang promoter, signal peptide, terminator yếu tố điều hòa khác giúp biểu ngoại bào mạnh S cerevisiae 17.4 Sản phẩm khác 18 PHƯƠNG THỨC CHUYỂN GIAO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA CHỈ ỨNG DỤNG Kết đề tài tiền đề để phát triển vaccine đường uống Covid-19 sử dụng nấm men S cerevisiae L plantarium phịng thí nghiệm CNSH Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Huế, Đại học Huế Như đơn vị thụ hưởng trực tiếp quan trọng đề tài phịng thí nghiệm CNSH Tuy nhiên lâu dài, nhắm đến nhiều đối tác khác để chuyển giao công nghệ, bao gồm công ty CNSH Nanogen, cơng ty Vabiotech Livespo 19 KINH PHÍ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VÀ NGUỒN KINH PHÍ Tổng kinh phí: 160 triệu đồng, đó: Kinh phí KHCN ĐHH: 160 triệu đồng Nguồn kinh phí khác: triệu đồng Nhu cầu kinh phí năm: Năm 1: 80 triệu đồng, Năm 2: 80 triệu đồng Dự trù kinh phí theo mục chi (phù hợp với nội dung nghiên cứu): Đơn vị tính: nghìn đồng Bảng tổng hợp dự tốn kinh phí đề tài T T Tổng kinh phí (nghìn đồng) 73248 Khoản chi Chi tiền công lao động trực tiếp 11 Tỷ lệ (%) 45.78 Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH 73248 10 Chi mua vật tư, nguyên, nhiên, vật liệu Chi sửa chữa, mua sắm tài sản cố định Chi hội thảo khoa học, cơng tác phí phục vụ hoạt động nghiên cứu Chi trả dịch vụ thuê phục vụ hoạt động nghiên cứu Chi điều tra, khảo sát thu thập số liệu Chi văn phòng phẩm, thông tin liên lạc, in ấn phuc vụ hoạt động nghiên cứu Chi họp hội đồng đánh giá cấp sở Chi quản lý chung (5%) Chi khác Tổng cộng = Ngày…tháng…năm…… Cơ quan chủ trì 34760 21.73 34760 6000 3.75 6000 32380 20.24 32380 1962 1.23 1962 3650 8000 2.28 5.00 3650 8000 160000 100.00 160000 Ngày…tháng…năm…… Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) Nguyễn Ngọc Lương Ngày…tháng…năm…… Cơ quan chủ quản duyệt GIÁM ĐỐC ĐẠI HỌC HUẾ 12 Khoản Chi tiền công lao động trực tiếp TT Nội dung chi Số người thực Hệ số tiền công Số ngày công Lương sở (nghìn đồng) Tổng kinh phí (nghìn đồng) Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khấc ĐHH 1.1 Dự tốn theo nội dung cơng việc Nghiên cứu tổng quan (xây dựng thuyết minh, báo cáo tổng quan vấn đề nghiên cứu) Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Đánh giá thực trạng vấn đề nghiên cứu Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Thu thập thông tin, tài liệu, liệu; xử lý số liệu, phân tích thơng tin, tài liệu, liệu Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Nội dung nghiên cứu chuyên môn Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Tiến hành thí nghiệm, thử nghiệm, thực nghiệm, khảo nghiệm, chế tạo, sản xuất; nghiên cứu, hồn thiện quy trình cơng nghệ Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Đề xuất giải pháp, kiến nghị, sáng chế, giải pháp hữu ích, sản phẩm, chế phẩm, mơ hình, ấn phẩm khoa học đề xuất khác Chủ nhiệm đề tài 5111 5111 0.42 1490 1877 1877 0.26 1490 2324 2324 0.17 0.10 1 1490 1490 760 149 760 149 0.42 1490 0.26 1490 0.17 0.10 1490 1490 0.42 1490 0.26 1490 0.17 0.10 1490 1490 63698 63698 0.42 25 1490 15645 15645 0.26 20 1490 15496 15496 0.17 0.10 35 40 1490 1490 26597 5960 26597 5960 0.42 1490 0.26 1490 0.17 0.10 1490 1490 0.42 1490 13 Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Tổng kết, đánh giá(Báo cáo thống kê, báo cáo tóm tắt báo cáo tổng hợp) Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Tổng (1)= 0.26 1490 0.17 0.10 1490 1490 4440 4440 0.42 1490 626 626 0.26 1490 1550 1550 0.17 0.10 1490 1490 1520 745 73248 1520 745 73248 0.42 29 1490 18148 0.26 25 1490 19370 0.17 0.10 38 46 1490 1490 28876 6854 73248 73248 40 1 1 1 1 Đơn giá (nghìn đồng) 100 3820 1620 2140 2360 1240 3780 3500 7460 Thành tiền (nghìn đồng) 4000 3820 1620 2140 2360 1240 3780 3500 Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH 4000 3820 1620 2140 2360 1240 3780 3500 7460 7460 2420 4840 34760 4840 34760 1.2 Dự toán theo thành viên đề tài Chủ nhiệm đề tài Thành viên thực chính, thư ký khoa học Thành viên đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ Tổng (1)= Khoản Chi mua vật tư, nguyên, nhiên, vật liệu T T Khoản chi Mồi Phusion DNA Polymerase kit Enzyme cắt hạn chế BamHI Enzyme cắt hạn chế SalI Enzyme cắt hạn chế PaeI Enzyme cắt hạn chế EcoRI DNA ladder (1kb plus) Protein ladder (prestained) Agarose phân tử 10 DNA stain solution Tổng (2) = Đơn vị tính Cặp Kit Kit Kit Kit Kit Kit Kit Chai 500g Lọ ml Số lượng Khoản Chi sửa chữa, mua sắm tài sản cố định T T Khoản chi Đơn vị tính Số lượng Đơn giá (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH Tổng (3) = Khoản Chi hội thảo khoa học, cơng tác phí phục vụ hoạt động nghiên cứu 4.1 Chi hội thảo khoa học T T Số buổi Nội dung chi 14 Định mức chi (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN ĐHH Khác Chủ trì Thư ký Báo cáo viên trình bày hội thảo Báo cáo đặt hàng khơng trình bày Thành viên tham dự hội thảo Cộng (4.1) = 4.1 Chi cơng tác phí T T Số người Nội dung chi Chi phí cán đề tài tham dự hội nghị nước Cộng (4.1) = Mức chi (nghìn đồng) 3000 Thành tiền (nghìn đồng) 6000 6000 Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH 6000 6000 Thành tiền (nghìn đồng) Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH Khoản Chi trả dịch vụ thuê phục vụ hoạt động nghiên cứu T T Khoản chi Giải trình tự DNA Chạy FACS Kính hiển vi đồng tiêu Tổng hợp gene Tổng (5) = Đơn vị tính 40 Đơn giá (nghìn đồng) 180 20 400 800 6590 Số lượng Chiều/l ượt Lượt Lượt Gen 7200 7200 8000 4000 13180 32380 8000 4000 13180 32380 Khoản Chi điều tra, khảo sát, thu thập số liệu T T Khoản chi Đơn vị tính Số lượng Đơn giá (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH Đơn giá (nghìn đồng) 450 28 Thành tiền (nghìn đồng) 1800 16 90 56 1962 Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH 1800 16 90 56 1962 Mức chi (nghìn đồng) Thành tiền (nghìn đồng) 2650 500 1800 150 200 1000 Nguồn kinh phí (nghìn đồng) KHCN Khác ĐHH 2650 500 1800 150 200 1000 Tổng (6) = Khoản Chi văn phịng phẩm, thơng tin liên lạc, in ấn T T Khoản chi Đơn vị tính In ấn (thuyết minh, báo cáo giữa/cuối kỳ) Bì khóa Bút bi Pin Tổng (7) = Lượt Bộ Cái Gói Số lượng 4 10 Khoản Chi họp hội đồng đánh giá cấp sở TT 8.1 8.2 Số người Nội dung chi Chi họp hội đồng Chủ tịch Hội đồng Thư ký ủy viên hội đồng Thư ký hành Đại biểu mời tham dự Chi viết nhận xét đánh giá 15 500 300 150 100 Nhận xét phản biện Nhận xét ủy viên Tổng (8) = 16 250 100 500 500 3650 500 500 3650