Nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn kiềng sắt đông lạnh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN IN VITRO TỪ TINH TRÙNG LỢN KIỀNG SẮT ĐÔNG LẠNH” Hà Nội, 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI LỢN IN VITRO TỪ TINH TRÙNG LỢN KIỀNG SẮT ĐÔNG LẠNH” Sinh viên thực : Đinh Thị Mỹ Duyên Lớp Giáo viên hƣớng dẫn : K62CNSHB : TS Nguyễn Thị Nhiên TS Nguyễn Khánh Vân Bộ môn : Công Nghệ Tế Bào Động Vật Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chƣa đƣợc sử dụng công bố luận văn, luận án vàcác cơng trình khoa học trƣớc Các thơng tin, trích dẫn đƣợc sử dụng khóa luận đƣợc ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Nếu không nhƣ nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài mình! Hà Nội, ngày 06 tháng 07 năm 2022 Sinh viên Đinh Thị Mỹ Duyên i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi, nơi em thực tập khóa luận tốt nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để em đƣợc học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp em nhận đƣợc hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Thị Nhiên TS Nguyễn Khánh Vân Em xin gửi tới thầy hƣớng dẫn lịng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ, động viên dìu dắt em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Khóa luận tốt nghiệp khó hồn thành không nhận đƣợc hỗ trợ Th.S Vũ Thị Thu Hƣơng; Th.S Quản Xuân Hữu; Th.S Phan Trung Hiếu; chị Phạm Thị Kim Yến; chị Nguyễn Thị Lệ Hƣơng; chị Hồng Thị Âu cán Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi Em trân trọng giúp đỡ quý báu Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên môn Công nghệ tế bào động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam bảo, hƣớng dẫn em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, ủng hộ, giúp đỡ em suốt trình thực tập tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TĨM TẮT KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa nghiên cứu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Buồng trứng trình hình thành tế bào trứng 2.1.1 Cấu tạo hoạt động buồng trứng 2.1.2 Cấu tạo hình thành tế bào trứng 2.2 Cấu tạo tinh trùng trình hình thành tinh trùng 2.2.1 Cấu tạo tinh trùng 2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng 10 2.3 Sự thành thục in vitro tế bào trứng lợn (IVM) 11 2.3.1 Sự thành thục nhân tế bào trứng 12 2.3.2 Sự thành thục tế bào chất 13 iii 2.3.3 Vai trò tế bào nang (tế bào cumulus) đến thành thục tế bào trứng 13 2.3.4 Vai trị mơi trƣờng ni thành thục in vitro tế bào trứng lợn 14 2.4 Quá trình thụ tinh ống nghiệm (thụ tinh in vitro) 16 2.4.1 Hoạt hóa tinh trùng in vitro 16 2.4.2 Thụ tinh ống nghiệm (in vitro) 18 2.5 Nuôi phôi ống nghiệm (in vitro) 19 2.5.1 Q trình phát triển phơi 19 2.5.2 Môi trƣờng nuôi phôi lợn in vitro 20 2.6 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 20 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tƣợng, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.4 Phƣơng pháp thu buồng trứng lợn từ lò mổ 22 3.3.1 Phƣơng pháp thu tế bào trứng từ buồng trứng lợn mò mổ …22 3.3.2 Phân loại tế bào trứng lợn sau thu 23 3.3.3 Phƣơng pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn 24 3.3.4 Phƣơng pháp đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro 25 3.3.5 Phƣơng pháp thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn 25 3.3.6 Phƣơng pháp nuôi phôi in vitro 26 3.3.7 Phƣơng pháp nhuộm Hoechst 33342 27 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Đánh giá chất lƣợng tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lợn lò mổ 28 iv 4.2 Đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ 30 4.3 Đánh giá khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh 34 4.3.1 Đánh giá khả xâm nhập vào tế bào trứng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau thụ tinh in vitro 34 4.3.2 Đánh giá khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Chất lƣợng tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ 28 Bảng 2: Đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ 31 Bảng 3: Khả xâm nhập vào phôi tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro 34 Bảng 4: Khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh 38 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Sơ đồ phát triển nang trứng (nguồn: Bearden Fuquay, 2000) Hình 2: Quá trình hình thành giao tử (Nguyễn Mộng Hùng,1993) Hình 3: Cấu tạo tinh trùng (trinhgiangloi.webflow.io) Hình 4: Sơ đồ trình hình thành giao tử đực ( istockphoto.com) 10 Hình 5: Trứng trình thành thục nhân ( Nguyễn Mộng Hùng, 1993) 12 Hình 6: Thu tế bào trứng lợn từ buồng trứng lị mổ phƣơng pháp cắt lát 23 Hình 7: Tế bào trứng đƣợc phân loại sau thu 24 Hình 8: Buồng trứng lợn thu từ lò mổ 29 Hình 9: Tế bào trứng lợn loại A, B 30 Hình 10: Tế bào trứng lợn thành thục in vitro với xuất thể cực thứ 32 Hình 11: Tế bào trứng lợn có tiền nhân (khơng thụ tinh) sau thụ tinh in vitro 35 Hình 12: Tế bào trứng lợn có hai tiền nhân (tế bào trứng đƣợc thụ tinh) sau thụ tinh in vitro 36 Hình 13: Tế bào trứng có nhiều hai tiền nhân (tế bào trứng bị đa tinh trùng) sau thụ tinh in vitro 37 Hình 14: Phơi nang lợn Landrace in vitro 39 Hình 15: Tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ phân chia ngày thứ sau thụ tinh in vitro 40 Hình 16: Phơi nang lợn in vitro đƣợc nhuộm với Hoechst 33342 để đếm tổng số tế bào/phôi nang 40 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ICSI: Intracytoplasmic sperm injection ICM: Inner cells mass ( Nút phôi) IVF: In vitro fertilization (Thụ tinh ống nghiệm) IVM: In vitro maturation (Nuôi thành thục ống nghiệm) IVC: In vitro culture (Ni cấy ống nghiệm) LH: Luteinizing hormone (hóc mơn gây rụng trứng) PBS: Phosphate buffer solution (Dung dịch đệm photphat) BSA: Bovine serum albumin ( Albumin huyết bò) FSH: Follicle stimulating hormone (Hormone kích thích nang trứng) viii Bảng 2: Đánh giá khả thành thục in vitro tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lị mổ Thơng số Số tế bào trứng ni Lần thành thục Số tế bào % số tế bào trứng sống trứng sống sau nuôi sau nuôi thành thục thành thục in vitro in vitro Số tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro % số tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro 264 187 70,83 154 58,33 315 298 94,60 221 70,16 311 274 88,10 194 62,38 360 264 73,33 212 58,89 249 204 81,93 160 64,26 345 282 81,74 207 60,00 Tổng 1844 1509 81,76 1148 62,34 Nguyên nhân tƣợng tế bào trứng chết sau nuôi thành thục in vitro tế bào trứng chúng tơi thu từ buồng trứng lị mổ, thời gian từ lúc thu buồng trứng lò mổ đến lúc kết thúc trình thu tế bào trứng thƣờng kéo dài 4-5 tiếng, điều ảnh hƣởng đến khả sống tế bào trứng Kết nuôi thành thục in vitro tế bào trứng lợn thấp nhiều so với Mariana cs (2015), Nguyễn Thị Thoa cs., (2009) Theo Mariana cs (2015); tỷ lệ thành thục in vitro tế bào trứng lợn thu từ buồng trứng lò mổ đạt > 90% Trong theo Nguyễn Thị Thoa cs., (2009); tỷ lệ tế bào trứng lợn thành thục in vitro sau nuôi thành thục đạt > 93% Nguyên nhân 31 giải thích cho khác chất lƣợng tế bào trứng sử dụng cho q trình ni thành thục in vitro; mơi trƣờng ni thành thục in vitro Hình 10: Tế bào trứng lợn thành thục in vitro với xuất thể cực thứ Theo Mariana cs (2015); tác giả sử dụng tế bào trứng loại A cho thí nghiệm ni thành thục in vitro Trong đó, chúng tơi sử dụng tế bào trứng loại B cho thí nghiệm ni thành thục in vitro Các tế bào trứng loại B có số lƣợng lớp tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng (> lớp tế bào cumulus) so với tế bào trứng loại A (> lớp tế bào cumulus) Tế bào cumulus đóng vai trị quan trọng trình thành thục nhân tế bào chất tế bào trứng Chúng có vai trị nhƣ cầu nối liên kết cung cấp 32 chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng nuôi vào tế bào trứng Do số lƣợng lớptế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng ảnh hƣởng đến khả thành thục in vitro tế bào trứng Môi trƣờng nuôi thành thục yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến khả thành thục in vitro tế bào trứng lợn sau nuôi thành thục in vitro Trong nghiên cứu này, sử dụng môi trƣờng POM có bổ sung EGF Theo Abeydeera cs (2000); ni tế bào trứng lợn mơi trƣờng POM có bổ sung EGF cho tỷ lệ tế bào trứng thành thục cao so với mơi trƣờng NCSU 37 có bổ sung FCS pFF Các tác giả cho việc bổ sung EGF vào môi trƣờng nuôi thành thục tế bào trứng lợn không chứa protein nhƣ POM nâng cao đƣợc hiệu q trình ni thành thục in vitro tế bào trứng lợn Nồng độ GSH nội bào có mối liên quan đến hồn thiện trình thành thục tế bào trứng; nồng độ cao GSH thị cho thấy tế bào trứng hồn thiện q trình thành thục Q trình tổng hợp GSH đƣợc gia tăng thông qua việc bổ sung cysteine vào môi trƣờng ni thành thục in vitro Các tác nhân kích thích sinh trƣởng (EGF) đƣợc bổ sung vào môi trƣờng ni thành thục phát huy tác dụng nhờ vào kích thích EGF q trình tổng hợp GSH tế bào trứng EGF cải thiện khả thành thục in vitro tế bào trứng nhƣ khả phát triển tế bào trứng sau nuôi thành thục in vitro (Abeydeera cs., 2000) Theo Prochazka cs (2000), EGF hỗ trợ cho trình thành thục nhân tế bào trứng đƣợc thu từ nang trứng có kích thƣớc < 4mm > 6mm; việc bổ sung EGF vào môi trƣờng nuôi thành thục in vitro tế bào trứng cải thiện khả thành thục in vitro tế bào trứng lợn 33 4.3 Đánh giá khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh 4.3.1 Đánh giá khả xâm nhập vào tế bào trứng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau thụ tinh in vitro Trong nghiên cứu này, đánh giá khả xâm nhập vào tế bào trứng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau thụ tinh in vitro dựa tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro.Phôi khơng có tinh trùng xâm nhập phơi có tiền nhân (Hình 11); phơi có tinh trùng xâm nhập phơi có từ hai tiền nhân trở lên sau thụ tinh in vitro (Hình 12; hình 13) Kết thể bảng Bảng 3: Khả xâm nhập vào phôi tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro Số phôi sử dụng làm IVF Lần Số tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro 154 Thơng số Số phơi có tinh trùng xâm nhập Số phơi có tinh trùng xâm nhập Có tiền nhân n, % n, % 15 (46,67) (33,33) (13,33) 221 23 14 (60,87) (34,78) (26,09) 194 19 13 (68,42) (36,84) (31,58) 212 21 11 (52,38) 10 (47,62) (4,76) 160 16 (56,25) (37,50) (18,75) 207 20 15 (75,00) 11 (55,00) (20,00) Có > tiền nhân n, % Tổng 1148 114 69 (60,52) 47 (41,22) 22 (19,29) (Chú thích: IVF thụ tinh ống nghiệm) Kết bảng cho thấy tỷ lệ phơi có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro đạt 60,52% tỷ lệ phơi có hai tiền nhân đạt 41,22%; phơi có nhiều hai tiền nhân đạt 19,29% Hiện tƣợng phơi có nhiều 34 hai tiền nhân sau thụ tinh tƣợng thƣờng gặp trình thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn Hiện tƣợng đƣợc gọi đa tinh trùng Tỷ lệ phơi có tinh trùng xâm nhập cao so với Nguyen Viet Linh cs (2018) Theo Nguyen Viet Linh cs (2018), tỷ lệ tế bào trứng có tinh trùng xâm nhập đạt 25,8% Tuy nhiên tỷ lệ phơi có tiền nhân chúng tơi thấp so với Nguyen Viet Linh cs (2018) (tƣơng ứng 41,23% so với 61,4%) Sự khác kết nghiên nguồn gốc nhƣ chất lƣợng tinh trùng sử dụng Trong nghiên cứu Nguyen Viet Linh cs (2018), tác giả sử dụng tinh trùng lợn Bản đông lạnh thu từ mào tinh hoàn Trong nghiên cứu sử dụng tinh trùng lợn Kiềng Sắt đông lạnh thu xuất tinh Tiền nhân Hình 11: Tế bào trứng lợn có tiền nhân (khơng thụ tinh) sau thụ tinh in vitro 35 Tiền nhân Hình 12: Tế bào trứng lợn có hai tiền nhân (tế bào trứng đƣợc thụ tinh) sau thụ tinh in vitro Hiện nay, quy trình tạo phơi lợn in vitro cịn nhiều hạn chế, tỷ lệ phát triển phôi lợn in vitro Một yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu tạo phơi lợn in vitro tƣợng đa tinh trùng xảy trình thụ tinh in vitro Nguyên nhân tƣợng đa tinh trùng bao gồm: nồng độ tinh trùng; tình trạng tế bào trứng thụ tinh (chƣa thành thục già quá) thời gian đồng nuôi cấy tế bào trứng lợn với tinh trùng thời gian đồng ni cấy tế bào trứng lợn với tinh trùng có ảnh hƣởng lớn đến tỷ lệ tế bào trứng đa tinh trùng sau thụ tinh in vitro (Romar cs., 2016) 36 Tiền nhân Hình 13: Tế bào trứng có nhiều hai tiền nhân (tế bào trứng bị đa tinh trùng) sau thụ tinh in vitro 4.3.2 Đánh giá khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh Sau thụ tinh in vitro, hợp tử giả định đƣợc chuyển sang nuôi môi trƣờng nuôi phôi lợn in vitro PZM3 Đối với môi trƣờng PZM3, tiến hành bổ sung 10% huyết thai bê vào cuối ngày thứ ngày thứ sau thụ tinh) Khả phân chia, phát triển đến phơi nang; tổng số phơi trung bình/phơi nang đƣợc thể bảng Chúng đánh giá khả phân chia dựa tỷ lệ phôi 2-4 tế bào ngày thứ (Hình 14), khả tạo phôi nang ngày thứ sau thụ tinh (Hình 15) Các phơi nang đƣợc đánh giá chất lƣợng cách nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst 33342 để xác định tổng số tế bào/phơi nang (Hình 16) Kết bảng cho thấy, tỷ lệ tế bào trứng phân chia, phôi nang đƣợc tạo từ tinh trùng lợn Kiềng Sắt tƣơng ứng đạt 61,26% 18,87% Tổng số phơi trung bình/phơi nang đạt 50,41% Trong nghiên cứu loại bỏ phần lớp tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng dung dịch 0.1% Hyaluronidase để lại 37 lớp tế bào cumulus bao xung quanh trƣớc đƣa tế bào trứng vào thụ tinh Theo Grupen Amstrong (2010), việc loại bỏ phần lớn để lại lớp tế bào cumulus bao xung quanh nâng cao hiệu thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn Cũng đồng quan điểm, Nguyen Viet Linh cs (2018) nhận thấy việc loại bỏ phần tế bào cumulus bao xung quanh tế bào trứng nâng cao hiệu thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn Bản Bảng 4: Khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh Thông số Số phôi sử dụng IVC Phân chia n, % Phôi nang n, % Lần 139 80 (57,55) 25 (17,98) Tổng số phơi trung bình/phơi nang % 49,98 198 122 (61,61) 36 (18,18) 51,25 175 102 (58,28) 33 (18,86) 50,02 191 121 (63,35) 42 (21,99) 53,01 144 94 (65,28) 26 (18,06) 48,89 187 115 (61,49) 34 (18,18) 49,31 Tổng 1034 634 (61,13) 196 (18,95) 50,41 (Chú thích: IVC ni cấy ống nghiệm) 38 Hình 14: Tế bào trứng lợn Landrace thu từ buồng trứng lò mổ phân chia ngày thứ sau thụ tinh in vitro Tỷ lệ tạo phôi nang mặt số liệu cao tỉ lệ phôi nang Nguyễn Thị Thoa cs., (2009) nhƣng thấp số phôi nang Nguyễn Thị Hƣơng (2010) Trong nghiên cứu Nguyễn Thị Thoa cs., (2009) có tỉ lệ phơi nang 13,59%, Nguyễn Thị Hƣơng (2010) có tỉ lệ 25.03% Tổng số phơi trung bình/phơi nang chúng tơi thấp Nguyễn Thị Thoa cs., (2009) Nguyễn Thị Hƣơng (2010) đạt tỉ lệ theo thứ tự 50,41%, 66.87%, 69.32% Tỷ lệ phôi nang thấp hay cao nhiều yếu tố trứng thu từ lị mổ, môi trƣờng nuôi… Chúng dùng môi trƣờng PZM3 bổ sung huyết bê vào cuối ngày thứ ngày thứ sau thụ tinh Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Thoa cs., (2009) Nguyễn Thị Hƣơng (2010) dùng môi trƣờng NCSU-37 10% PFF Theo Yoshida cs., (1993) vai trò PFF mơi trƣờng làm gia tăng tỉ lệ chín nhân, PFF có tác dụng lớn để nâng cao khả phát triển trứng lợn in vitro Tuy dùng môi trƣờng PZM3 bổ sung huyết bê vào cuối ngày thứ ngày thứ sau thụ tinh có kết tạo phơi khơng cao mơi trƣờng NCSU-37 10% PFF nhƣng áp dụng tạo 39 phôi lợn từ môi trƣờng Điều cho thấy mơi trƣờng ni cấy khác ảnh hƣởng đến dãn nở cumulus ảnh hƣởng đến kích thích thâm nhập tinh trùng Hình 15: Phơi nang lợn Landrace in vitro Hình 16: Phôi nang lợn in vitro đƣợc nhuộm với Hoechst 33342 để đếm tổng số tế bào/phôi nang 40 Bên cạnh đó, mơi trƣờng thời gian thụ tinh có vai trị quan trọng q trình thụ tinh Việc sử dụng mơi trƣờng thụ tinh có chứa caffeine tăng tỷ lệ thụ tinh in vitro tế bào trứng lợn (Nguyen Viet Linh cs., 2018) Caffeine chất có tác dụng kích thích, hỗ trợ cho tinh trùng xâm nhập vào tế bào trứng lợn trình thụ tinh (Funahashi Nagai, 2001) Để nâng cao hiệu tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn nội sau đông lạnh-giải đông, sử dụng mơi trƣờng thụ tinh có chứa 5mM caffeine với thời gian thụ tinh Theo Nguyen Viet Linh cs (2018), tế bào trứng lợn Bản đƣợc thụ tinh mơi trƣờng có chứa 5mM caffeine với thời gian thụ tinh cải thiện hiệu thụ tinh đơn tinh trùng 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết thu đƣợc nuôi phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh làm nguyên liệu cho nghiên cứu tinh trùng phôi lợn nội Buồng trứng lợn dùng cho thí nghiệm đƣợc thu từ lị mổ địa phƣơng khu vực Hƣng Yên, Đông Anh phƣơng pháp cắt lát từ buồng trứng lợn Landrace lị mổ Các tế bào trứng lợn Landrace sau ni thành thục in vitro môi trƣờng POM + EGF + hormone sau 24 đạt tỷ lệ 62,34% Khả xâm nhập phôi tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đông lạnh sau thụ tinh in vitro dựa tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập thời điểm 10 sau thụ tinh in vitro, phôi có tinh trùng xâm nhập tế bào trứng có tiền nhân sau thụ tinh in vitro có tỷ lệ tƣơng ứng đạt 59,93% 40,85% Phôi phân chia, tạo phôi nang sau thụ tinh in vitro từ tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt đơng lạnh tƣơng ứng có tỷ lệ đạt 61,26% 18,87% Tổng số tế bào trung bình/phơi nang đạt 50,41% 5.2 Đề nghị Nghiên cứu tạo phôi lợn từ lợn Landrace kết không cao nhiên áp dụng tạo phơi lợn từ lợn Landrace tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt Để cải thiện chất lƣợng phơi cần thí nghiệm môi trƣờng nuôi khác 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH Abeydeera LR, Wang WH, Cantley TC, Rieke A, Murphy CN, Prather RS, Day BN 2000 Development and viability of pig oocytes matured in a protein-free medium containing epidermal growth factor Theriogenology, 54: 787-797 Allen, C and V Harper, Edison Community College Fetal Pig Dissection Guide Human/Pig Comparisons 2003 Bearden, H.J., J.W Fuquay, and S.T Willard, Applied animal reproduction 6th ed 2004, Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice Hall xvi, 427 p Brown, C and W Cheng, (1985), "Limited proteolysis of the porcine zona pellucida by homologous sperm acrosin" Reproduction 74(1): p 257 Bearden, H J., & Fuquay, J W (2000) Applied animal reproduction (5th edition) Upper Saddle River, NJ: Prentice-Hall Ding, J and G Foxcroft, (1992), "Follicular heterogeneity and oocyte maturation in vitro in pigs" Biology of reproduction 47(4): p 648 Ebert, K and V Papaioannou, (1989), "In vivo culture of embryos in the immature mouse oviduct" Theriogenology 31(2): p 299-308 Funahashi H and Nagai T 2001 Regulation of in invitro penetration of frozen-thawed boar spermatozoa by caffeine and adenosine Molecular Reproduction and Development, 58: 424-431 Grupen CG, Armstrong DT 2010 Relationship between cumulus cell apoptosis progesterone production and porcine oocyte developmental competence: temporal effects of follicular fluid during IVM Reproduction Fertility and Development, 22: 1100-1109 10 Hak Hyun Ka, W.H.W., Kyung Soon Im, Koji Niwa 1, (1997), "Effects of Fetal calf serum, Pig follicular fluid, and Gonadotropins an maturation of pig oocytes cultured in different media" J Mamm Ova Res 14 11 Ian, G., Laboratory production of cattle 1994, Cab International 12 Ito, M., H Iwata, M Kitagawa, Y Kon, T Kuwayama, and Y Monji, (2008), "Effect of follicular fluid collected from various diameter follicles on the progression of nuclear maturation and developmental competence of pig oocytes" Animal Reproduction Science 106(3-4): p 421-430 43 13 Keller, P.R.O.J.E.C.T.S., Experimental developmental biology : a laboratory manual 1999, Academic press, cop 14 Khatir, H., C Carolan, P Lonergan, and P Mermillod, (1997), "Characterization of calf follicular fluid and its ability to support cytoplasmic maturation of cow and calf oocytes" Reproduction 111(2): p 267 15 Laura R Keller, John Hyde Evans, Thomas C S Keller.1999, “Experimental Developmental Biology: A Laboratory Manual” 16 Prochazka R, V Srsen, E Nagyova, T Miyano, J.E Flechon 2000 Development regulation of effect of epidermal growth on porcine oocytescumulus cell complexes: nuclear maturation, expansion, and F-actin remodeling Mol Reprod Dev, 56: 63-73 17 Romar R, Funahashi H and Coy P 2016 In vitro fertilization in pigs: New molecules and protocols to consider in the forthcoming years Theriogenology 85: 125-134 18 Sofie Tanghe *, A.V.S., Hans Nauwynck 2, Marc Coryn 1, Aart De Kruif, Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization, Molecular Reproduction and Development p 414-424 19 Suzuki, M., K Misumi, M Ozawa, J Noguchi, H Kaneko, K Ohnuma, D Fuchimoto, A Onishi, M Iwamoto, and N Saito, (2006), "Successful piglet production by IVF of oocytes matured in vitro using NCSU-37 supplemented with fetal bovine serum" Theriogenology 65(2): p 374-386 20 Somfai T and Hirao Y 2011 Synchronization of in vitro maturation of porcine oocytes Methods Mol Biol, 761: 211-225 21 Shimada, M and T Terada, (2001), "Phosphatidylinositol 3-kinase in cumulus cells and oocytes is responsible for activation of oocyte mitogenactivated protein kinase during meiotic progression beyond the meiosis I stage in pigs" Biology of reproduction 64(4): p 1106 22 Tamás, S., (2004), "SYNCHRONIZATION OF IN VITRO MATURATION OF PORCINE OOCYTES" UNIVERSITY OF WESTHUNGARY FACULTY OF AGRICULTURE AND FOOD SCIENCES 23 Tatemoto, H., N Muto, I Sunagawa, A Shinjo, and T Nakada, (2004), "Protection of porcine oocytes against cell damage caused by oxidative stress during in vitro maturation: role of superoxide dismutase activity in 44 porcine follicular fluid" Biology of reproduction 71(4): p 1150 24 Yoshida, M., Y Ishizaki, H Kawagishi, K Bamba, and Y Kojima, (1992), "Effects of pig follicular fluid on maturation of pig oocytes in vitro and on their subsequent fertilizing and developmental capacity in vitro" Reproduction 95(2): p 481 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đỗ Thị Kim Lành, Hoàng Thị Kim Chi, Nguyễn Thị Ngọc Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Kazuhiro Kikuchi, Takeshige Otoi, Nguyễn Thị Thu Trang, Sử Thanh Long 2020 Nghiên cứu ứng dụng môi trƣờng nuôi thành thục trứng lợn in vitro phù hợp với điều kiện Việt Nam Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, Vol 18, No 7: 504-509 Nguyễn Thị Ƣớc, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, Bùi Xn Nguyên 2008 Nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa tổ hợp công nghệ ống nghiệm nhân vơ tính Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A): 625-635 Nguyễn Mộng Hùng (1993) Bài giảng Sinh học phát triển NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyen Viet Linh, Tamas Somfai, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Dong Van Quyen, Hoang Ha Chu, Nguyen Thanh Son, Kazuhiro Kikuchi 2018 Optimization of the in vitro fertilization protocol for froen epididymal sperm with low fertilization ability in Ban-A native Vietnamese pigs Anim Sci J, 89(8): 1079-1084 Nguyễn Thanh Bình 2016 Ảnh hƣởng cystein môi trƣờng nuôi cấy tế bào trứng đến khả tạo phôi kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm (IVF) heo Tạp chí phát triển KH&CN Tập 19, số 2: 19-26 Nguyễn Thị Thoa, Lƣu Ngọc Anh, Vũ Thị Thu Hƣơng, Trần Sơn Hà, Đỗ Văn Hƣơng Nguyễn Thị Hƣơng 2009 Kết tạo phôi lợn ống nghiệm sử dụng môi trƣờng NCSU 37 10% pFF Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Chăn ni Số 19 45