Nghiên cứu tạo đột biến in vitro cây trầu bà công chúa hồng philodendron pink princess bằng xử lý sodium azide

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -� � � KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO CÂY TRẦU BÀ CÔNG CHÚA HỒNG PHILODENDRON “PINK PRINCESS” BẰNG XỬ LÝ SODIUM AZIDE” HÀ NỘI 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -� � � KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO CÂY TRẦU BÀ CÔNG CHÚA HỒNG PHILODENDRON “PINK PRINCESS” BẰNG XỬ LÝ SODIUM AZIDE” Sinh viên thực : Trần Thùy Dung Lớp : K63CNSHD Mã sinh viên : 637310 Giảng viên hƣớng dẫn : T.S Ninh Thị Thảo Bộ môn : Công nghệ sinh học Thực vật HÀ NỘI 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài tốt nghiệp khóa luận ―Nghiên cứu tạo đột biến in vitro trầu bà công chúa hồng (Philodendron ―Pink Princess‖) xử lý sodium azide‖ cơng trình nghiên cứu riêng thân dƣới hƣớng dẫn TS Ninh Thị Thảo Các số liệu kết nghiên cứu đƣợc đƣa đề tài khóa luận tốt nghiệp trung thực không chép hay sử dụng kết đề tài nghiên cứu tƣơng tự Nếu nhƣ phát có chép kết nghiên cứu đề đề tài khác thân tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Ngƣời thực Trần Thùy Dung i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực tập tốt nghiệp hồn thành luận văn, tơi nhận đƣợc giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân ngồi học viện q trình nghiên cứu đề tài khóa luận Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến tồn thể Thầy Cơ khoa Công nghệ sinh học – Học viện nông nghiệp Việt Nam ln tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Đặc biệt, xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Ninh Thị Thảo tồn thể tập thể cán phịng Cơng nghệ sinh học Thực vật - Học viện Nông nghiệp Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để tơi hồn thành tốt đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, ngƣời thân bạn bè cổ vũ, động viên, giúp đỡ q trình học tập thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn tình cảm quý báu Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng… năm 2022 Ngƣời thực Trần Thùy Dung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT x PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu khái quát chi Philodendron 2.1.1 Sơ lƣợc phân bố 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh học sinh thái 2.1.4 Giá trị sử dụng 2.1.5 Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh học trầu bà công chúa hồng Philodendron ―Pink Princess‖ 2.2 Khái quát xử lý đột biến chọn tạo giống trồng 10 2.2.1 Khái niệm đột biến 10 2.2.2 Các tác nhân gây đột biến 10 iii 2.2.3 Cơ chế di truyền đột biến 13 2.2.4 Giới thiệu chung chất gây đột biến sodium azide 13 2.3 Chỉ thị RAPD 14 2.4 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống trồng xử lý đột biến in vitro 15 2.3.1 Trên giới 15 2.3.2 Tại Việt Nam 17 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 17 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.3.1 Nội dung 1: Xử lý tạo đột biến sodium azide (NaN3 ) 18 3.3.2 Nội dung 2: đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý với NaN3 sau lần cấy chuyển 19 3.3.3 Nội dung 3: Đánh giá sai khác di truyền dịng trầu bà cơng chúa hồng biến dị 21 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.4.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 21 3.4.2 Phƣơng pháp xử lý đột biến 21 3.4.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA trầu bà công chúa hồng 21 3.4.4 Phƣơng pháp RAPD-PCR 22 3.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Xử lý tạo đột biến NaN3 26 4.1.1 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 đến khả sống sinh trƣởng chồi thời gian xử lý đột biến 60 phút 26 4.1.2 Ảnh hƣởng thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả sống sinh trƣởng chồi 28 iv 4.1.3 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả sống sinh trƣởng chồi 31 4.2 Đánh giá trì biến dị qua lần cấy chuyển 33 4.2.1 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 nồng độ khác lần cấy chuyển thứ 33 4.2.2 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 1,0 mM khoảng thời gian khác lần cấy chuyển thứ 35 4.2.3 Đánh giá khả sinh trƣởng trì biến dị chồi mơi trƣờng ni cấy có bổ sung NaN3 lần cấy chuyển thứ 39 4.3 Đánh giá sai khác di truyền dòng đột biến giả định sau xử lý NaN3 thị RAPD 41 4.3.1 Kết xác định nồng độ độ tinh DNA tổng số 42 4.3.2 Kết phân tích RAPD-PCR 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Tài liệu tiếng việt 49 Tài liệu tiếng anh 49 PHỤ LỤC 52 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BA Benzyl adenin CT Công thức CTAB Cetyl trimethylammonium bromide CV (%) Hệ số biến động ĐC DNA Đối chứng Deoxyribonucleic Acid EMS Ethyl methanesulfonate H20 Nƣớc LSD (0,05) Sai khác nhỏ có ý nghĩa MS Mơi trƣờng Murashige Skoog, 1962 PCR Polymerase chain reaction P-value Probability value RAPD Random Amplified Polymorphic DNA vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các mồi RAPD đƣợc sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 24 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 đến khả sống sinh trƣởng chồi (sau tuần) 26 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng thời gian xử lý NaN3 1,0 mM đến khả sống sinh trƣởng chồi sau tuần 28 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng nồng độ NaN3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đến khả sống sinh trƣởng chồi 31 Bảng 4.4 Khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 nồng độ khác lần cấy chuyển 33 Bảng 4.5: Khả sinh trƣởng trì biến dị chồi sau xử lý NaN3 1,0 mM khoảng thời gian khác lần cấy chuyển 36 Bảng 4.6: Khả sinh trƣởng trì biến dị chồi mơi trƣờng ni cấy có bổ sung NaN3 lần cấy chuyển 39 Bảng 4.7: Kết kiểm tra nồng độ độ tinh DNA mẫu trầu bà công chúa hồng 43 Bảng 4.8: Kết RAPD-PCR 44 Bảng 4.9: Hệ số tƣơng đồng di truyền mẫu đối chứng mẫu biến dị giả định 45 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây trầu bà công chúa hồng (Philodendron ―Pink Princess‖) Hình 2.2 Cấu trúc 2D sodim azide (NaN3) 14 Hình 3.1: Mẫu trầu bà cơng chúa hồng in vitro 18 Hình 4.1 Chồi trầu bà cơng chúa hồng sau xử lý với NaN3 nồng độ mM (A); 1,0 mM (B); 2,5 mM (C) 5,0 mM (D) 60 phút sau tuần 27 Hình 4.2 Chồi trầu bà cơng chúa hồng sau xử lý với NaN3 1,0 mM phút (A); 30 phút (B); 60 phút (C); 90 phút (D)và 120 phút (E) sau tuần 30 Hình 4.3: Chồi biến dị giả định công thức (A), công thức (B), công thức (C) với nồng độ xử lý NaN3 1,0 mM khoảng thời gian tƣơng ứng 30 phút, 60 phút, 90 phút sau tuần nuôi cấy 31 Hình 4.4 Chồi trầu bà công chúa hồng nuôi cấy môi trƣờng bổ sung NaN3 nồng độ NaN3 µM (A); 1,0 µM (B)và 10 µM (C) sau tuần 32 Hình 4.5: Chồi trầu bà cơng chúa hồng sau đƣợc xử lý NaN3 nồng độ mM (A); 1,0 mM (B); 2,5 mM (C) 5,0 mM (D) 60 phút nuôi cấy mơi trƣờng có MS + mg/L BA lần cấy chuyển 34 Hình 4.6: Các chồi biến dị giả định (A): chồi công thức đối chứng, (B): chồi không khác biệt mặt hình thái so với đối chứng, (C): đa chồi, chồi phát triển không đồng đều, nhiều chồi phát triển mạnh (D): đa chồi, chồi phát triển mạnh, to (E): đa chồi, phát triển đồng đều, chồi bé 38 viii 20 P Srivastava, S Marker, P Pandey and D.K Tiwari, 2011 Mutagenic Effects of Sodium Azide on the Growth and Yield Characteristics in Wheat (Triticum aestivum L em Thell.) Asian Journal of Plant Sciences, 10: 190-201 21 PubChem (n.d.) Sodium azide Retrieved June 4, 2022, from https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/33557 12/6/2022 22 Ray, Thomas S (December 1990) "Metamorphosis in the Araceae" American Journal of Botany 77 (12): 1599–1609 doi:10.2307/2444492 JSTOR 2444492 23 Reha-Krantz, L J (2013) Mutagens In S Maloy & K Hughes (Eds.), Brenner’s Encyclopedia of Genetics (Second Edition) (pp 528–532) Academic Press 24 Shu Q.Y (ed.) (2009) Induced Plant Mutations in the Genomics Era Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome: 425-427 25 Terzaghi, B E., Streisinger, G., & Stahl, F W (1962) The mechanism of 5-bromouracil mutagenesis in the bacteriophage T alpha Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 48(9), 1519–1524 26 Van, Den-Bulk RW., Loffer, H.J.M., Lindhout, W.H., Koornneef, M., 1990 Somaclonal variation in tomato: effect of explants source and a comparison with chemical mutagenesis Theoretical Applied Genetics 80, 817–825 51 PHỤ LỤC Analysis of variance He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 22 0.35 0.24 28.73 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 1.00 0.33 3.22 0.0476 Nong Sodium azide 1.00 0.33 3.22 Error 1.86 18 0.10 Total 2.85 21 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.40865 Error: 0.1032 df: 18 Nong Sodium azide Means n S.E 0.00 0.76 0.14 A 5.00 1.10 0.13 A 1.00 1.24 0.14 B 2.50 1.33 0.13 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 22 0.12 0.00 52 12.60 B 0.0476 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 0.12 0.04 0.78 0.5198 Nong Sodium azide 0.12 0.04 0.78 Error 0.90 18 0.05 Total 1.01 21 Model 0.5198 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.28398 Error: 0.0498 df: 18 Nong Sodium azide Means n S.E 0.00 1.69 0.10 A 1.00 1.71 0.10 A 2.50 1.79 0.09 A 5.00 1.88 0.09 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV So la/choi 22 0.08 0.00 12.55 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 0.72 0.24 0.55 0.6532 Nong Sodium azide 0.72 0.24 0.55 Error 7.88 18 0.44 Total 8.60 21 Model 53 0.6532 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.84166 Error: 0.4377 df: 18 Nong Sodium azide Means n S.E 2.50 5.13 0.27 A 1.00 5.16 0.30 A 0.00 5.20 0.30 A 5.00 5.57 0.27 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Analysis of variance He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 37 0.39 0.31 28.84 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 1.05 0.26 5.06 0.0028 Thoi gian ngam mau 1.05 0.26 5.06 0.0028 Error 1.66 32 0.05 Total 2.72 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.24309 Error: 0.0520 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 120 0.59 0.08 A 0.62 0.09 54 A 60 0.78 0.08 90 0.91 0.08 30 1.04 0.09 A B B C C Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 37 0.07 0.00 15.85 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 0.21 0.05 0.58 0.6780 Thoi gian ngam mau 0.21 0.05 0.58 0.6780 Error 2.93 32 0.09 Total 3.14 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.32256 Error: 0.0916 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 30 1.82 0.11 A 1.86 0.11 A 1.87 0.12 120 60 1.95 0.11 A 90 2.03 0.11 A A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV 55 So la/choi 37 0.44 0.36 8.19 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 4.44 1.11 6.17 0.0009 Thoi gian ngam mau 4.44 1.11 6.17 0.0009 Error 5.76 32 0.18 Total 10.20 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.45210 Error: 0.1799 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 90 4.59 120 0.15 A 5.14 0.17 B 5.18 0.15 B 60 5.45 0.15 B 30 5.57 0.16 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Analysis of variance He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 16 0.11 0.00 38.54 Analysis of variance table (Partial SS) S.V Model SS df MS F p-value 0.20 0.10 0.81 0.4642 56 Nong Sodium azide 0.20 Error 1.56 13 0.12 Total 1.76 15 0.10 0.81 0.4642 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.46057 Error: 0.1203 df: 13 Nong Sodium azide Means n S.E 0.76 0.16 A 0.90 0.14 A 10 1.04 0.16 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 16 0.47 0.39 11.09 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 0.54 0.27 5.86 0.0154 Nong Sodium azide 0.54 0.27 5.86 Error 0.59 13 0.05 Total 1.13 15 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.28398 Error: 0.0457 df: 13 57 0.0154 Nong Sodium azide Means n S.E 1.69 0.10 A 1.94 0.09 A 10 2.15 0.10 B B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV So la/choi 16 0.14 0.01 13.82 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 1.15 0.58 1.04 0.3813 Nong Sodium azide 1.15 0.58 1.04 Error 7.21 13 0.55 Total 8.36 15 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.98856 Error: 0.5543 df: 13 Nong Sodium azide Means n S.E 10 5.16 0.33 A 5.20 0.33 A 5.73 0.30 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Analysis of variance 58 0.3813 He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 22 0.36 0.25 26.49 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 2.30 0.77 3.34 0.0424 Nong Sodium azide 2.30 0.77 3.34 Error 4.13 18 0.23 Total 6.44 21 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.60972 Error: 0.2297 df: 18 Nong Sodium azide Means n S.E 5.00 1.57 0.20 A 1.00 1.60 0.21 A 0.00 1.68 0.21 A 2.50 2.33 0.20 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 22 0.50 0.42 15.62 MS F Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df 59 p-value 0.0424 Model 2.13 0.71 6.09 0.0048 Nong Sodium azide 2.13 0.71 6.09 Error 2.09 18 0.12 Total 4.22 21 0.0048 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.43397 Error: 0.1164 df: 18 Nong Sodium azide Means n S.E 0.00 1.72 0.15 A 1.00 2.03 0.15 A 2.50 2.32 0.14 5.00 2.56 0.14 B B C C Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV So la/choi 22 0.22 0.09 15.43 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 2.76 0.92 1.66 0.2119 Nong Sodium azide 2.76 0.92 1.66 Error 9.99 18 0.55 Total 12.74 21 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.94759 Error: 0.5548 df: 18 Nong Sodium azide Means n 60 S.E 0.2119 5.00 4.43 0.30 A 1.00 4.72 0.33 A B 0.00 4.76 0.33 A B 2.50 5.37 0.30 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Analysis of variance He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 37 0.45 0.38 21.79 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 2.18 0.55 6.47 0.0006 Thoi gian ngam mau 2.18 0.55 6.47 0.0006 Error 2.70 32 0.08 Total 4.88 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.30946 Error: 0.0843 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 120 1.12 0.12 1.16 0.10 A 60 1.25 0.10 A 90 1.32 0.10 A 30 1.81 0.11 A B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) 61 Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 37 0.42 0.35 12.48 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 2.20 0.55 5.90 0.0011 Thoi gian ngam mau 2.20 0.55 5.90 0.0011 Error 2.99 32 0.09 Total 5.19 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.32554 Error: 0.0933 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 2.01 0.11 A 30 2.44 0.12 B 90 2.54 0.11 B 60 2.59 0.11 B 2.72 120 0.12 Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV 62 B So la/choi 37 0.17 0.06 9.47 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 1.70 0.43 1.60 0.1981 Thoi gian ngam mau 1.70 0.43 1.60 0.1981 Error 8.50 32 0.27 Total 10.20 36 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.54939 Error: 0.2657 df: 32 Thoi gian ngam mau Means n S.E 5.07 0.18 A 60 5.45 0.18 A B 5.48 0.21 A A B 120 30 5.55 0.19 90 5.70 0.18 B B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Analysis of variance He so nhan choi Variable He so nhan choi N R² Adj R² CV 16 0.55 0.48 33.09 MS F Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df 63 p-value Model 3.37 1.69 7.85 0.0058 Nong Sodium azide 3.37 1.69 7.85 Error 2.79 13 0.21 Total 6.16 15 0.0058 Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.61507 Error: 0.2146 df: 13 Nong Sodium azide Means n S.E 10 0.72 0.21 A 1.68 0.21 B 1.73 0.19 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) Chieu cao choi Variable N R² Adj R² CV Chieu cao choi 16 0.66 0.61 13.64 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 2.15 1.08 12.59 0.0009 Nong Sodium azide 2.15 1.08 12.59 Error 1.11 13 0.09 Total 3.26 15 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=0.38810 64 0.0009 Error: 0.0854 df: 13 Nong Sodium azide Means n S.E 1.72 0.13 A 10 2.03 0.13 A 2.59 0.12 B Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) So la/choi Variable N R² Adj R² CV So la/choi 16 0.17 0.04 17.17 Analysis of variance table (Partial SS) S.V SS df MS F p-value 1.57 0.79 1.35 0.2934 Nong Sodium azide 1.57 0.79 1.35 Error 7.59 13 0.58 Total 9.16 15 Model Test:Fisher LSD Alpha:=0.05 LSD:=1.01429 Error: 0.5835 df: 13 Nong Sodium azide Means n S.E 10 4.00 0.34 A 4.57 0.31 A 4.76 0.34 A Means with a common letter are not significantly different (p > 0.05) 65 0.2934