Nghiên cứu đông lạnh tinh trùng lợn đực kiềng sắt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐƠNG LẠNH TINH TRÙNG LỢN ĐỰC KIỀNG SẮT Sinh viên thực : Nguyễn Văn Nam Lớp : K63CNSHC Giáo viên hƣớng dẫn : T.S Nguyễn Thị Nhiên T.S Nguyễn Khánh Vân Bộ môn : Công Nghệ Tế Bào Động Vật Hà Nội, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chưa sử dụng công bố luận văn, luận án cơng trình khoa học trước Các thơng tin, trích dẫn sử dụng khóa luận ghi rõ nguồn gốc, đảm bảo trích dẫn theo quy định Nếu không nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài mình! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Văn Nam i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi, nơi em thực tập khóa luận tốt nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để em học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp em nhận hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Khánh Vân TS Nguyễn Thị Nhiên Em xin gửi tới thầy hướng dẫn lịng biết ơn sâu sắc tận tình giúp đỡ, động viên dìu dắt em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Khóa luận tốt nghiệp khó hồn thành không nhận hỗ trợ ThS Vũ Thị Thu Hương; ThS Quản Xuân Hữu; ThS Phan Trung Hiếu; chị Phạm Thị Kim Yến; chị Nguyễn Thị Lệ Hương; chị Hồng Thị Âu cán Phịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi Em trân trọng giúp đỡ quý báu Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên môn Công nghệ tế bào động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam bảo, hướng dẫn em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, ủng hộ, giúp đỡ em suốt trình thực tập tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Văn Nam ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP viii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa nghiên cứu 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Mào tinh hoàn lợn 2.1.1 Cấu tạo mào tinh hoàn lợn 2.1.2 Chức hoạt động mào tinh hoàn lợn 2.2 Đặc điểm sinh học tinh dịch lợn 2.2.1 Cấu tạo tinh trùng 2.2.2 Tinh 2.2.3 Quá trình hình thành tinh trùng 2.3 Phương pháp khai thác tinh trùng 2.3.1 Phương pháp khai thác tinh trùng từ mào tinh hoàn 2.3.2 Phương pháp khai thác tinh trùng nhảy giá 12 2.4 Phương pháp đơng lạnh sử dụng q trình bảo quản lạnh tinh trùng 13 2.4.1 Đông lạnh tinh trùng phương pháp hạ nhiệt độ chậm 13 2.4.2 Đông lạnh tinh trùng tủ âm sâu 14 2.4.3 Đông lạnh tinh trùng không sử dụng máy (đông lạnh chậm cải tiến) 14 iii 2.4.4 Đơng lạnh tinh trùng phương pháp thủy tinh hóa 15 2.5 Một số dạng tổn thương lạnh tinh trùng q trình đơng lạnh-giải đông 16 2.6 Nguồn gốc, phân bố, đặc điểm ngoại hình khả sản xuất lợn Kiềng Sắt 18 2.7.1 Nguồn gốc, phân bố lợn Kiềng Sắt 18 2.7.2 Đặc điểm ngoại hình khả sản xuất lợn Kiềng Sắt 18 2.8 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 20 III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phương pháp lựa chọn lợn đực dùng cho trình khai thác tinh 23 3.3.2 Phương pháp huấn luyện lợn đực giống nhảy giá 23 3.3.3 Phương pháp khai thác tinh trùng từ mào tinh hoàn 25 3.3.4 Phương pháp khai thác tinh trùng nhảy giá 26 3.3.5 Phương pháp đông lạnh tinh trùng lợn 28 3.3.5 Phương pháp giải đông tinh trùng lợn 33 3.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng tinh dịch 33 3.3.7 Phương pháp xử lí số liệu 35 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp khai thác tinh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau khai thác 36 4.2 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp khai thác tinh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông 37 4.3 Đánh giá ảnh hưởng phương pháp đông lạnh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông 39 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Đề nghị 42 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TTNT : Thụ tinh nhân tạo CPA : Cryoprotective Agents DMSO : Dimethy Sulfoxide EG : Ethylen Glycol PROH : 1,2 Propanediol LPC : Lysophophatidylcholine PEG : Polyethylene glycol v DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Chất lượng tinh dịch lợn đực Kiềng Sắt sau thu từ mào tinh xuất tinh 36 Bảng Chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt thu từ mào tinh hồn xuất tinh sau đơng lạnh-giải đơng 38 Bảng Ảnh hưởng phương pháp đông lạnh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông 39 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Mào tinh hồn (ThS Phan Vũ Hải, Bài giảng Sinh sản Gia súc) Hình 2: Cấu tạo tinh trùng Hình Phương pháp tuyển 11 Hình Phương pháp thu thập ngược d ng 12 Hình Lợn Kiềng Sắt 19 Hình Đàn lợn Kiềng Sắt ni 20 Hình : Lợn đực Kiềng Sắt tiêu chuẩn cho khai thác tinh trùng 22 Hình Huấn lợn nhảy giá kích thích dương vật thị 25 Hình Lợn đực trình xuất tinh 27 Hình 10 Tinh dịch sau khai thác lọc qua hai lớp giấy lọc 27 Hình 11 Ly tâm tinh dịch 28 Hình 12 Rã đơng mơi trường đồng hồ trước khai thác tinh dịch 29 Hình 13 Tinh dịch ổn định môi trường đông lạnh hút vào cọng rạ 32 Hình 14 Tinh trùng đông lạnh bể nito lỏng 32 Hình 15 Đếm tinh trùng kính hiển vi 34 vii TÓM TẮT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên tác giả: NGUYỄN VĂN NAM Mã sinh viên: 637249 Lớp: K63CNSHC Tên đề tài: “Nghiên cứu phương pháp đông lạnh tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt” Giảng viên hướng dẫn: T.S Nguyễn Thị Nhiên T.S Nguyễn Khánh Vân Thời gian thực hiện: Tháng 02/2022 – Tháng 08/2022 Ngành: Cơng nghệ sinh học Mục đích đề tài: Đơng lạnh thành công tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt hai phương pháp đông lạnh qua hai phương pháp khai thác Phƣơng pháp nghiên cứu:  Phương pháp đông lạnh tinh trùng khai thác từ mào tinh  Phương pháp đông lạnh tinh trùng khai thác từ xuất tinh qua trình tiến hành huấn luyện lợn đực nhảy giá Kết nghiên cứu:  Đánh giá ảnh hưởng phương pháp khai thác tinh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau khai thác  Đánh giá ảnh hưởng phương pháp khai thác tinh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông  Đánh giá ảnh hưởng phương pháp đông lạnh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông Kết luận: kết luận tiêu thể tích, tỉ lệ tinh trùng sống, hoạt lực tinh trùng, mật độ tinh trùng hai phương pháp khai thác hai phương pháp đông lạnh trước đông lạnh sau giải đông viii I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Bảo tồn lạnh tinh trùng lợn địa phương pháp hiệu việc gìn giữ lợn đực giống có chất lượng tăng tốc độ cải thiện chất lượng đàn lợn địa Việt Nam Bảo quản lạnh tinh trùng lợn điều kiện cần thiết để thành lập ngân hàng gen tinh trùng lợn địa Các giống lợn địa Việt Nam có kích thước nhỏ, suất thấp chúng thường mang đặc tính quý như: chất lượng thịt thơm ngon, dễ nuôi, không cần đầu tư nhiều thức ăn, có khả kháng bệnh tốt, đáp ứng tốt điều kiện khí hậu khắc nghiệt vùng, phù hợp cho chăn nuôi vùng sâu, vùng xa, vùng cao, nguồn gen đa dạng nhiều tiềm quý Tuy nhiên áp lực đ i hỏi suất để đáp ứng nhu cầu thịt nên giống lợn địa không trọng dẫn đến nhiều giống bị suy giảm mặt số lượng bị Bên cạnh đó, ảnh hưởng dịch bệnh dịch tả lợn châu Phi nên số lượng lớn lợn địa phải tiêu hủy Quy trình đông lạnh tinh trùng lợn thiết lập thành công số giống lợn ngoại Landrace, Large White Duroc Tuy nhiên nay, có báo cáo đánh giá chất lượng tinh trùng đông lạnh giống lợn địa Việt Nam, đặc biệt tinh trùng lợn địa đông lạnh thu cách xuất tinh Hiện nay, có số báo cáo đánh giá khả tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng đông lạnh thu từ mào tinh hoàn lợn Bản (Nguyen cs, 2015; Nguyen Viet Linh cs, 2018; Nhung cs, 2020) Lợn Kiềng Sắt giống lợn địa Việt Nam có nguồn gốc xã Ba Vinh, huyện Ba Tơ, tỉnh Quảng Ngãi Chúng có đặc điểm quý 3.3.5 Phương pháp giải đông tinh trùng lợn - Lấy 80ml mơi trường pha lỗng tinh dịch lợn cho vào lọ đựng tinh dịch lợn làm ấm dung dịch pha loãng tinh dịch lợn đến 37,5oC - Cọng rạ chứa tinh trùng đông lạnh lấy khỏi dung dịch nitơ lỏng cho vào bể ấm 37,5oC v ng 30 giây để giải đông - Cọng rạ chứa tinh trùng đông lạnh sau giải đơng cắt hai đầu để tồn dung dịch cọng rạ chảy vào lọ có chứa dung dịch pha loãng tinh trùng làm ấm đến 37,5oC trước 3.3.6 Phương pháp đánh giá chất lượng tinh dịch - Lượng tinh xuất (V, ml) - Dùng cốc đong lọ có chia vạch đến mililit để đo lượng tinh xuất sau lọc bỏ chất keo nhầy Đặt cốc đọng lọ chứa tinh dịch mặt bàn phẳng, ngang tầm mắt, đọc kết mặt cong tinh dịch - Hoạt lực tinh trùng (A, %) - Dùng đũa thủy tinh sạch, lấy giọt tinh dịch đặt lên phiến kính khơ, sạch, ấm (ở nhiệt độ từ 35oC đến 37oC), phủ lamen lên đưa lên kính hiển vi có độ phóng đại từ 200 đến 600 lần, có hệ thống sưởi ấm (ở nhiệt độ từ 37oC) để xác định CHÚ THÍCH: Để đánh giá đầy đủ hoạt lực tinh trùng, cần kết hợp yếu tố: Tỷ lệ % tinh trùng tiến thẳng số tinh trùng có chuyển động tiến thẳng quan sát vi trường lực chuyển động tinh trùng - Hoạt lực tinh trùng tỉ lệ tinh trùng sống tiến thẳng so với tổng số tinh trùng quan sát vi trường quan sát - Mật độ tinh trùng (C, %) 33 - Dùng ống hút bạch cầu khô, hút tinh dịch đến vạch 0,5, sau hút tiếp dung dịch pha lỗng NaCl 3% đến vạch 11, bịt hai đầu ống pha lỗng đảo nhẹ nhàng, dung dịch pha lỗng 20 lần (khi hút khơng để tượng sủi bọt) Loại bỏ – giọt dùng lamen khô, đậy lên mặt buồng đếm, đặt miệng ống hút bạch cầu vào mép lamen khu vực buồng đếm để đưa tinh dịch vào buồng đếm Sau đưa buồng đếm lên kính hiển vi có độ phóng đại 200 – 400 lần, tiến hành đếm tinh trùng nằm góc ô nằm đường chéo Mỗi ô lớn chưa 16 nhỏ, nhỏ tích (mm3): (1/20) x (1/20) x (1/10) Hình 15 Đếm tinh trùng ƣới kính hiển vi Cơng thức tính nồng độ tinh trùng ml tinh dịch sau: C = n x 106, - C: mật độ tinh trùng - n: số tinh trùng đếm ô lớn - Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K, %) - Nhỏ giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, nhẵn, ấm, dùng lamen dàn tinh trùng phiến kính, để tinh phiến kính tự khơ sau hơ qua 34 lửa đèn cồn Nhỏ dung dịch metylen, đỏ fucsin, eosin-nigrosin lên mặt lớp tinh dịch khô, đợi từ – phút Sau rửa nhẹ cách nhỏ giọt nước cất đầu phiến kính có tiêu nước cất tự loang trôi dần thuốc nhuộm đến mức độ tiêu giữ màu nhạt thuốc nhuộm Đợi tiêu khơ, đặt lên kính hiển vi có độ phóng đại 400 – 600 lần - Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tính phương pháp xác định số lượng tinh trùng có hình dạng khác thường có tổng số 300 đến 500 tinh trùng nhuộm màu đếm Cơng thức tính sau: K = n/N*100% K(%): Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình n: Số tinh trùng kỳ hình N: Tổng số tinh trùng đếm (giao động 300 – 500) - T ng số tinh trùng tiến thẳng tinh dịch (VAC) Tổng số tinh trùng tiến thẳng lần xuất tinh (VAC, tỷ tinh trùng) tính cách nhân lượng xuất tinh (V) với hoạt lực tinh trùng (A) nồng độ tinh trùng (C) 3.3.7 Phƣơng pháp xử lí số liệu Số liệu xử lý phần mềm Microsoft Excell 2010, sai khác có ý nghĩa kiểm tra hàm ANOVA, sai khác có ý nghĩa với P 0.05) Tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh-giải đông cao so với báo cáo Nguyên cs (2015) Theo Nguyên cs (2015), tỷ lệ tinh trùng lợn Bản sống sau đông lạnh-giải đông đạt 31.9% Trong nghiên cứu hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tinh trùng kỳ hình tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau giải đông giảm nhiều so với trước đông lạnh Điều phù hợp với báo cáo Watson (2000) Theo Watson (2000), chất lượng tinh trùng sau đông lạnh giải đông bị giảm ảnh hưởng đến khả thụ tinh Nguyên nhân trình đông lạnh-giải đông gây tổn thương ảnh hưởng đến tính tồn vẹn màng, ty thể, khả di chuyển, khả sống tinh trùng Watson (2000) Sự thay đổi nhiệt độ đột ngột trình giải đơng làm thay protein lipid qua ảnh hưởng đến tính thấm chức màng tế bào tinh trùng sau đông lạnh-giải đơng (Leahy Gadella., 2011) Kết thí nghiệm cho thấy phương pháp khai thác tinh từ mào tinh hồn xuất tinh khơng ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đơng Điều có ý nghĩa lớn việc bảo tồn đực có giá trị bị chết đột ngột nguyên nhân khác 38 Chúng ta thu mào tinh hồn, khai thác, đơng lạnh tinh trùng đực giống có giá trị bị chết đột ngột; qua bảo tồn nguồn vật liệu di truyền đực giống tái tạo lại đàn cần thiết 4.3 Đánh giá ảnh hƣởng phƣơng pháp đông lạnh đến chất lƣợng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông Từ kết nội dung nghiên cứu 4.2, thí nghiệm chúng tơi sử dụng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt khai thác phương pháp xuất tinh để đánh giá ảnh hưởng phương pháp đông lạnh đến chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đơng lạnh-giải đơng Trong thí nghiệm này, sử dụng hai phương pháp đông lạnh tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt: (1) lần cân (2) lần cân Ảnh hưởng phương pháp đông lạnh đánh giá dựa chất lượng tinh trùng lợn sau giải đông Các tiêu đánh giá chất lượng tinh trùng lợn sau đông lạnh-giải đông gồm có: hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Kết đánh giá chất lượng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông phương pháp khác thể bảng Bảng Ảnh hƣởng phƣơng pháp đông lạnh đến chất lƣợng tinh trùng lợn đực Kiềng Sắt sau đông lạnh-giải đông Chỉ tiêu đánh giá Phƣơng pháp Phƣơng pháp Hoạt lực tinh trùng (%) 34,88±2.89 35,01±2,76 Tinh trùng sống (%) 45,98±2.09 45,33±2,34 Tinh trùng kỳ hình (%) 11,45±2.65 11,26±2,31 Kết bảng cho thấy khơng có khác biệt hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình đơng lạnh hai 39 phương pháp khác (P > 0,05) Tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh-giải đông hai phương pháp đạt > 45% Tốc độ đông lạnh yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến chất lượng tinh trùng sau đơng lạnh-giải đơng Mặc dù phương pháp có tốc độ đơng lạnh nhanh phương pháp 1, khơng có khác biệt hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Ngun nhân tốc độ đơng lạnh hai phương pháp nằm giới hạn cho phép Theo Said cs., (2010) tốc độ đông lạnh tối ưu tinh trùng lợn -30oC/phút Việc tăng tốc độ đơng lạnh q trình bảo quản lạnh giúp cho tế bào tránh tổn thương lạnh, làm giảm nồng độ chất bảo quản lạnh, nhờ tế bào vượt qua vùng nhiệt độ giới hạn (-5 đến -15oC) cách nhanh chóng, nước ngồi tế bào đơng lạnh bên Điều ngăn chặn tổn thương lạnh giọt lipid nội bào, lipid có màng tế bào khung xương tế bào Mức độ nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ phải tốc độ giới hạn Đối với loại tế bào có tốc độ giới hạn cho phép khác Cùng với mức độ nước khả tạo băng đá nội bào tăng lên gây tổn thương cho tế bào đông lạnh giải đông Nếu tốc độ đông lạnh giới hạn cho phép sống tế bào gắn liền với biến đổi tính chất dung dịch, đồng thời nồng độ chất h a tan tăng lên bên tế bào Các tượng vật lý xảy bên tinh trùng q trình đơng lạnh-giải đơng phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả nước nhanh ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá trì tiềm chất hóa học nội bào cân với tiềm chất hóa học ngoại bào Điều dẫn tới việc tế bào bị nước không đông lạnh bên tế bào 40 Nhưng tế bào đơng lạnh q nhanh khơng có khả nước nhanh để trì cân bằng, nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên xảy tượng đông lạnh nội bào Như diện tinh thể đá nội bào hiệu ứng dung dịch hai yếu tố chủ yếu thay đổi theo tốc độ đông lạnh để định đến khả sống tinh trùng sau đông lạnh-giải đông Trong nghiên cứu này, khơng có khác biệt về hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình hai phương pháp đơng lạnh, ưu điểm phương pháp rút ngắn thời gian thao tác bước q trình đơng lạnh tinh trùng so với phương pháp Tuy nhiên để lựa chọn phương pháp đơng lạnh tinh trùng lợn thích hợp cần có thêm nghiên cứu khác đánh giá chất lượng tinh trùng lợn sau đông lạnh-giải đông hai phương pháp như: thụ tinh nhân tạo, tạo phôi lợn in vitro từ tinh trùng lợn sau đông lạnh-giải đông 41 V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Thể tích tinh dịch thu từ mào tinh hoàn lợn đực Kiềng Sắt thấp nhiều so với thu từ xuất tinh (tương ứng 2,98ml/mào tinh hoàn so với 71,32ml/xuất tinh) - Mật độ tinh trùng thu từ mào tinh hoàn lợn đực Kiềng Sắt cao nhiều so với thu từ xuất tinh (tương ứng 9635,11 triệu/ml so với 281,15 triệu/ml) - Khơng có khác biệt hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tinh dịch lợn sau khai thác hai phương pháp khai thác tinh từ mào tinh hoàn xuất tinh (tương ứng 79,01% 77,98%;82,37% 80,98%; P > 0,05) - Khơng có khác biệt hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình tinh trùng lợn sau đơng lạnh-giải đông hai phương pháp khai thác tinh từ mào tinh hoàn xuất tinh (tương ứng 31,65% 34,88%; 45,48% 45,98%; P > 0,05) - Khơng có khác biệt hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống tỷ lệ tinh trùng kỳ hình đơng lạnh hai phương pháp khác (P > 0,05) Tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh-giải đông hai phương pháp đạt > 45% 5.2 Đề nghị - Cần có thêm nghiên cứu khác đánh giá chất lượng tinh trùng lợn sau đông lạnh-giải đông hai phương pháp như: thụ tinh nhân tạo, tạo phôi lợn in vtro từ tinh trùng lợn sau đông lạnh-giải đông để lựa chọn phương pháp đơng lạnh tinh trùng lợn thích hợp 42 VI TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt Đào Đức Thà, Đỗ Hữu Hoan, Nguyễn Đình Dũng (2007) Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ Bộ môn sinh sản thụ tinh nhân tạo Viện Chăn Nuôi Hà Minh Tuân (2015) Luận án tiến sỹ Viện Chăn Nuôi Hồ Trung Thông, Đàm Văn Tiện, Đỗ Văn Chung (2013) Đánh giá khả sinh sản lợn nái Kiềng Sắt Quảng Ngãi Hue University Journal of Science Agriculture and Rural Development Nguyễn Thị Hậu (2009) Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo nhân giống lợn Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên  Tài Liệu Tiếng Anh Ahmad, K and Chaudhry, R A (1980) Cryopreservation of buffalo semen Vet Rec 106: 199-201 Akhter, S., Ansari, M S., Rakha, B A., Andrabi, S M H., Khalid, M and Ullah (2011) Effect of low density lipoproteins in extender on freezability and fertility of buffalo (Bubalus bubalis) bull semen Theriogenology 76(4): 759-764 Bergeron, A and P Manjunath (2006) New insights towards understanding the mechanisms of sperm protection by egg yolk and milk Mol Reprod Dev 73: 1338-1344 Cerolini S, Maldjian A, Surai P, Noble R (2000) Viability, susceptibility to peroxidation and fatty acid composition of boar semen during liquid storage Anim Reprod Sci, 58(1-2): 99-111 43 Chaveiro A, Cerqueira C, Silva J, Franco J, Franco J and Moreira da Silva (2015) Evaluation of froen thawed cauda epididymal sperms and in vitro fertilizing potential of bovine sperm collected from the cauda epididymal Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University, Vol 16, No 2, Ser.No 51: 188-193 10 Cheshmedjieva, S B., Vaisberg, C N and Kolev, S I (1996) On the lipid composition of buffalo spermatozoa frozen in different cryoprotective media Bulgarian J Agric Sci 2: 23–26 11 Dhami, A J and Sahni, K L (1993) Effect of extenders, additives and deep freezing on the leakage of lactic dehydrogenase from cattle and buffalo spermatozoa Indian J Anim Sci 63: 251-256 12 Devireddy RV, Fahrig B, Godke RA, Leibo SP (2004) Subzero water transport characteristics of boar spermatozoa confirm observed optimal cooling rates Mol Reprod Dev, 67(4): 446-57 13 Esmaeili V, Shahverdi AH, Moghadasian MH, & Alizadeh AR (2015) Dietary fatty acids affect semen quality: a review Andrology, 3(3), 450–461 14 Fuller, B and Paynter, S (2004) Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine Reprod Biomed Online 9: 680-691 15 Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP (1990) Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive Journal of Andrology, Vol 11, Iss 1: 73-88 16 Hafez, E S E and Hafez, B (2000) Reproduction in Farm Animals Seventh Edition, Ed Lippincott William & Wikins, United States of America 44 17 Horvath A, Harnos A, Szenci O, Pribenszky C (2018) Investigation of hydrostatic pressure-induced stress preconditioning of boar semen using modified cryopreservation Reprod Domest Anim, 53(6):1589-93 18 Leahy T, Gadella (2011) Capacitation and capacitation-like sperm surface changes induced by handling boar semen Reprod in Dom Anim, 46: 7-13 19 Li J, Parrilla I, Ortega MD, Martinez EA, Rodriguez-Martinez H, Roca J (2018) Post-thaw boar sperm motility is affected by prolonged storage of sperm in liquid nitrogen A retrospective study Cryobiology, 80:119-25 20 Medeiros, C M O., Forell, F., Oliveira, A T D and Rodrigues, J L (2002) Current status of sperm cryopreservation: why is it better Theriogenology 57: 327-344 21 Nguyen BX, Kikuchi K, Uoc NT, Dang Nguyen TQ, Linh NV, Men NT, Nagai T (2015) Prodcution of Ban miniature pig embryos by in vitro fertilization: A comparative study with Landrace Anim Sci J, 86: 487-493 22 Nguyen Viet Linh, Tamas Somfai, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Dong Van Quyen, Hoang Ha Chu, Nguyen Thanh Son, Kazuhiro Kikuchi (2018) Optimization of the in vitro fertilization protocol for froen epididymal sperm with low fertilization ability in Ban-A native Vietnamese pigs Anim Sci J, 89(8): 1079-1084 23 Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen, Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai (2020) Optimization of in vitro embryo production 45 and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: The effect of different in vitro oocytes maturation systems Anim Sci J Vol 91, Iss 24 O'Connell M, McClure N, Lewis SEM (2002) The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function Human Reprodcution, Vol 17, Iss 3: 704-709 25 Parrilla I, Vazquez JM, Caballero I, Gil MA, Hernandez M, Roca J, Lucas X, Martinez EA (2009) Optimal characteristics of spermatozoa for semen technologies in pigs Soc Reprod Fertil S66: 37-50 26 Ramakrishnan P and Ariff M O (1994) Effect of glycerol level and cooling rate on post-thaw semen quality of Malaysian swamp buffalo In: Vale, W G., Barnabe, V H and Mattos, J C A de, Proceedings of 4th World Buffalo Cong, Sao Paulo, Brazil International Buffalo Federation, Roma, Italy: 540-542 27 Rasul, Z., Ahmed, N and Anzar, M (2007) Antagonist effect of DMSO on the cryoprotection ability of glycerol during cryopreservation of buffalo sperm Theriogenology 68: 813-819 28 Rodriguez-Martinez H (2012) Cryopreservation of pig spermatozoa, oocytes and embryos: state of the art In: Katkov I (Ed) Cryopreservation Intech Open Access Publisher: 231-258 29 Sansone, G., M.J.F Nastri and A Fabbrocini (2000) Storage of buffalo (Bubalus bubalis) semen Animal Reproduction Science 62: 55-76 30 Said TM, Gaglani A and Agarwal A (2010) Implication of apoptosis in sperm cryoinjury Reprod Biomed Online 21:456–62 31 Watson PF (2000) The causes of reduced fertility with cryopreserved semen Anim Reprod Sci, 60-61: 481-492 46 32 Yu I, Leibo S (2002) Recovery of motile, membrane-intact spermatozoa from canine epididymides stored for days at degrees C Theriogenology, 57(3): 1179-1190 33 Zeng C, Tamg K, He L, Peng W, Ding L, Fang D, Zhang Y (2014) Effects of glycerol on apoptotic signaling pathways during boar spermatozoa cryopreservation Cryobiology 68, 395-404 47