Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống ổi (psidium guajava l)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC MẪU GIỐNG ỔI (Psidium guajava L.) HÀ NỘI, 9/2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC MẪU GIỐNG ỔI (Psidium guajava L.) Sinh viên thực : NGUYỄN THỊ KIỀU TRINH Mã sinh viên : 637284 Lớp : K63CNSHC Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hướng dẫn : TS PHẠM THỊ DUNG HÀ NỘI, 9/2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam kết khóa luận tốt nghiệp “Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống ổi (Psidium guajava L.)” cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Phạm Thị Dung Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài hoàn toàn trung thực, khách quan Các phần tham khảo, trích dẫn ghi rõ phần tài liệu tham khảo Nếu phát có gian lận tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trinh i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận tốt nghiệp, lời em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cơ TS Phạm Thị Dung, người tận tình hướng dẫn bảo em suốt trình nghiên cứu thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Đinh Trường Sơn – Bộ môn CNSH Thực vật thầy cô, anh (chị) Bộ môn Sinh học phân tử CNSH Ứng dụng tạo điều kiện giúp đỡ để em có điều kiện tốt suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học nói riêng giảng viên Học viện Nơng nghiệp Việt Nam nói chung tận tình giảng dạy, trang bị cho em kiến thức quý giá suốt quãng thời gian học tập Học viện Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân ln bên cạnh, ủng hộ, khích lệ tinh thần giúp em hồn thành tốt khóa luận Dẫu cố gắng hồn thiện chắn khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy cô Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thị Kiều Trinh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC HÌNH viii TÓM TẮT ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2.Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu ổi 2.1.1 Giới thiệu chung 2.1.2 Đặc điểm thực vật học ổi 2.1.3 Giá trị ổi 2.1.4 Phân bố 2.2 Chỉ thị phân tử ứng dụng số thị phân tử phân tích đa dạng di truyền thực vật 10 2.2.1 Khái niệm thị phân tử 10 2.2.2 Chỉ thị ISSR (InterSimple Sequence Repeat-ISSR) 11 2.2.3 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 12 2.2.4 Chỉ thị RAPD 12 2.3 Những nghiên cứu đa dạng di truyền ổi nước quốc tế 15 iii PHẦN III VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.2 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 18 3.3.1 Dụng cụ thiết bị 18 3.3.2 Hóa chất 18 3.3.3 Danh sách mồi thị RAPD 18 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Nội dung nghiên cứu 18 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 19 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Phân tích đa dạng kiểu gen ổi 24 4.1.1 Đa dạng hình thái 24 4.1.2 Hàm lượng Vitamin C ổi 29 4.2 Kết DNA tổng số 33 4.3 Phân tích đa dạng di truyền thị RAPD 35 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 5.1 Kết luận 38 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 42 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid OD Optical Density PCR Polymerase chain reaction PVP Polyvinylpyrrolidone RAPD Random Amplified Polymorphic DNA TAE Tris-acetate EDTA v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng ổi Bảng 3.1 Danh sách kí hiệu mẫu giống ổi 17 Bảng 3.2 Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng phản ứng PCR 20 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 4.1 Hình dáng màu sắc giống ổi 25 Bảng 4.2 Một số đặc điểm ổi 26 Bảng 4.3 Một số đặc điểm ổi 29 Bảng 4.4 Tỉ lệ giống hoa, phân loại ổi theo độ chín 31 Bảng 4.5 Kết số OD260/280 nồng độ mẫu nghiên cứu 34 Bảng 4.6 Đa hình 10 mẫu giống ổi dựa thị RAPD 35 Bảng 4.7 Hệ số tương đồng 10 mẫu giống ổi dựa thị RAPD 36 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ thịt quả/ khoang chứa (%) 30 Biểu đồ 4.2 Sự biến đổi hàm lượng vitamin C q trình chín 33 vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Một số thực phẩm làm từ ổi Hình 2.2 Búp, ổi non giã nát dùng làm thuốc Hình 2.3 Hình ảnh minh họa kỹ thuật thị RAPD 13 Hình 4.1 Cấu tạo ổi 24 Hình 4.2 Mặt mặt 10 giống ổi thu thập tháng địa điểm khác Hà Nội 28 Hình 4.3 Ảnh cắt ngang ổi 29 Hình 4.4 Minh họa 10 mẫu giống ổi 32 Hình 4.5 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền 10 mẫu giống ổi 37 viii 4.1.2 Hàm lượng Vitamin C ổi 4.1.2.1 Tỷ lệ thịt quả/khoang chứa Các giống ổi khác ưa chuộng đặc tính Các giống có kích thước to nhỏ khác Có nhiều hạt, có hạt (Bảng 4.3 hình 4.4) Bảng 4.3 Một số đặc điểm ổi STT Mẫu giống Kích thước (cm) Độ dài thịt (cm) Độ dài khoang chứa hạt (cm) G1 9.2 3.7 1.8 G2 4.1 0.7 2.7 G3 7.5 1.3 4.9 G4 7.9 1.4 5.1 G5 6.4 1.6 3.2 G6 6.6 1.1 4.4 G7 6.9 1.3 4.3 10 G10 10.2 2.4 5.4 Hình 4.3 Ảnh cắt ngang ổi 29 Biểu đồ 4.1 Tỉ lệ thịt quả/ khoang chứa (%) Từ bảng biểu đồ ta thấy, số 10 mẫu giống ổi nghiên cứu thời điểm thu có mẫu giống thu có kích thước quả, độ dài thịt quả, độ dài khoang chứa hạt khác Mẫu giống G10 có kích thước to (10.2cm), bé giống G2 (4.1cm) Tỷ lệ thịt so với khoang chứa cao giống G1(67.27%), mẫu giống khác đồng Giống G1 cao đặc tính giống ổi không hạt 30 4.1.2.2 Xác định hàm lượng vitamin C Bảng 4.4 Tỉ lệ giống hoa, phân loại ổi theo độ chín Mẫu giống Có hoa Có  G1 Mức độ chín Đặc điểm Ký hiệu Chuyển màu 80% xanh, Độ chín 20% vàng G2  Xanh già 100% xanh Độ chín G3  Chuyển màu 80% xanh, Độ chín 20% vàng  G4 Chín 50% xanh, Độ chin 50% vàng G5  Xanh già 100% xanh Độ chín G6  Chín mềm 100% vàng Độ chín G7  Chín mềm 100% vàng Độ chín G8  x x x G9  x x x Chín 50% xanh, Độ chín G10  50% vàng Trong 10 mẫu giống ổi, có mẫu giống thu tháng để kịp tiến hành đo hàm lượng vitamin C, mẫu giống ( Ổi rubi ruột đỏ ổi tím Malaisia ) hoa Các mẫu giống thu hái mức độ chín khác với đặc điểm khác ký hiệu từ độ chín đến ( Xanh già, chuyển màu, chín, chín mềm (Bảng 4.4) Mỗi độ chín gồm có mẫu giống để tiến hành đo hàm lượng Vitamin C (Biểu đồ 2) 31 Ổi không hạt (G1) Ổi găng ruột đỏ (G2) Ổi lê (G3) Ổi xá lị ruột đỏ (G4) Ổi rừng (G5) Ổi bát (G6) Ổi Đông dư (G7) Ổi rubi ruột đỏ (G8) Ổi tím Malaisia (G9) Ổi nữ hồng (G10) Hình 4.4 Minh họa 10 mẫu giống ổi 32 Biểu đồ 4.2 Sự biến đổi hàm lượng vitamin C q trình chín Hàm lượng vitamin C ổi mẫu giống q trình chín thể hình Từ đồ thị hình thấy hàm lượng vitamin C tăng dần từ độ chín (41,94 mg/100g chất tươi (CT)) lên độ chín (87,56 mg/100g CT) đạt giá trị cao độ chín (298,72 mg/100g CT), sau giảm độ chín (259,38 mg/100g CT) Hàm lượng vitamin C đạt giá trị cao giai đoạn chín (độ chín 3), giá trị tương tự kết nghiên cứu trước Mercado-Silva cs (1998) nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin C giống ổi trồng Mexico thấy hàm lượng vitamin C đạt giá trị thấp độ chín và có tăng đột biến đạt giá trị lớn độ chín Tương tự, Bulk cs (1996) hàm lượng vitamin C đạt giá trị lớn giai đoạn chín (ripe) ổi 4.2 Kết DNA tổng số Vì ổi có chứa lượng lớn hợp chất thứ cấp nên cần bổ sung thêm Polyvinylpyrrolidone (PVP) vào đệm chiết để tách DNA tinh đảm 33 bảo chất lượng để thực phản ứng PCR.Sản phẩm sau tách chiết đo số OD260/280 nồng độ DNA để kiểm tra độ tinh DNA Bảng 4.5 Kết số OD260/280 nồng độ mẫu nghiên cứu Mẫu OD260/280 Nồng độ DNA (ng/ µl) G1 1.04 14 G2 1.01 G3 1.08 52 G4 1.05 G5 1.01 71 G6 1.02 G7 1.02 G8 1.17 13 G9 1.05 70 G10 1.03 11 Từ bảng cho thấy độ tinh DNA không cao nồng độ DNA thấp DNA sau tách chiết pha loãng tới nồng độ 3ng/µl chạy PCR thử với mồi OPA03 cho kết băng vạch rõ nét Do số OD260/280 không cao DNA đảm bảo cho phản ứng chạy PCR với mồi RAPD 34 4.3 Phân tích đa dạng di truyền thị RAPD Trong mồi RAPD sử dụng nghiên cứu, mồi cho sản phẩm PCR rõ ràng xuất tất 10 mẫu giống ổi nghiên cứu Tổng cộng có 16 locus ghi nhận, trung bình locus/mồi, có 13 locus đa hình, chiếm tỉ lệ 81,3% Mồi OPA 05 cho số băng/mẫu giống cao với 2,90 băng/mẫu giống Kích thước băng vạch dao động khoảng 200-1500bp Dựa kết thu cho thấy việc sử dụng thị RAPD phân tích mối quan hệ di truyền mẫu giống ổi đa dạng di truyền mẫu Bảng 4.6 Đa hình 10 mẫu giống ổi dựa thị RAPD Từ bảng cho ta thấy, sử dụng mồi RAPD nhân 108 băng, trung bình 27 băng/mồi Mồi OPA 05 nhân số băng lớn (29 băng) mồi OPS 05 nhân số băng (24 băng) Theo Botstein cộng (1980), với thị đồng trội, số PIC > 0,5 mồi cho kết đa hình cao, ngược lại số PIC nằm khoảng 0,25 - 0,5 cho kết đa hình 35 trung bình với số PIC < 0,25 kết đa hình thấp Chỉ số đa hình PIC mồi nhỏ 0,31 (mồi OPA 05 OPS 05) cao 0,39 (mồi OPA 03) Chỉ số PIC trung bình mồi 0,34 cho thấy mồi có mức độ đa hình trung bình Bảng 4.7 Hệ số tương đồng 10 mẫu giống ổi dựa thị RAPD M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 1.00 0.81 1.00 0.50 0.44 1.00 0.44 0.63 0.56 1.00 0.69 0.75 0.44 0.50 1.00 0.75 0.69 0.50 0.69 0.69 1.00 0.50 0.56 0.50 0.81 0.56 0.75 1.00 0.81 0.63 0.69 0.50 0.75 0.81 0.56 1.00 0.69 0.88 0.44 0.50 0.88 0.56 0.44 0.63 1.00 0.69 0.63 0.81 0.50 0.50 0.69 0.56 0.75 0.50 1.00 Hệ số tương đồng di truyền thể mối quan hệ di truyền mẫu, hệ số tương đồng di truyền cao chứng tỏ hai mẫu gần mặt di truyền Từ bảng cho ta thấy hệ số tương đồng 10 mẫu giao động khoảng từ 0.44-0.88 Hệ số tương đồng cao 0.88 mẫu G2 với G9 G5 với G9 Hệ số tương đồng di truyền thấp 0.44 mẫu G9 với G3, G5 với G3, G4 với G1 G9 với G7 Từ hệ số tương đồng, sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, ta vẽ sơ đồ thể mối quan hệ di truyền 10 mẫu giống ổi: 36 Hình 4.5 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền 10 mẫu giống ổi Cây phân loại dựa theo hệ số tương đồng di truyền chia mẫu thành nhóm, nhóm I gồm mẫu G4 G7 có hệ số tương đồng cao 0.81 Nhóm II gồm mẫu G10 G3 có hệ số tương đồng cao 0.8 Nhóm III gồm mẫu G5, G9, G2 mẫu G2 G9 có hệ số tương đồng gần Nhóm IV gồm mẫu G6, G8, G1 37 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 10 mẫu giống ổi phổ biến thu thập địa điểm khác Hà Nội nghiên cứu đánh giá số tính trạng nơng sinh học cho thấy mẫu giống có đa dạng với hình dạng , hình dạng đỉnh lá, hình dạng đế lá, màu sắc gân bật màu tím sẫm với giống G9 (Ổi tím Malaisia), kích thước hình dáng bật giống G10 đặc tính ổi khơng hạt Các giống ổi khác có chiều dài phiến đa dạng, dao động từ 8.18 (giống G2) đến 14.7 (giống G8) Chiều rộng phiến dao động từ 4.43 (giống G4) đến 9.25 (giống G8) Chiều dài cuống giống dao động từ 0.41 (giống G6) đến 1.02 (giống G10).Tỷ lệ thịt quả/khoang chứa cao giống G1 (Ổi không hạt) Hàm lượng vitamin C đạt giá trị thấp độ chín và có tăng đột biến đạt giá trị lớn độ chín Đã sử dụng thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền 10 mẫu giống ổi phát tổng số 16 locus với 108 băng Chỉ số PIC trung bình mồi 0,34 hệ số tương đồng 10 mẫu giống khoảng 0,44 đến 0,88 Kết phân tích đa dạng di truyền thị RAPD cho thấy 10 mẫu giống ổi có mức độ đa dạng di truyền cao Sử dụng phương pháp UPGMA thông qua phần mềm NTSYSpc 2.1, ta vẽ sơ đồ thể mối quan hệ di truyền 10 mẫu giống ổi với nhóm 5.2 Kiến nghị Cần tiếp tục thu thập nguồn gen mở rộng nghiên cứu nguồn gen ổi kỹ thuật phân tích ADN để phục vụ định hướng cho công tác bảo tồn, chọn tạo giống để đem lại giống ổi có chất lượng tốt 38 Do hạn chế thời gian phạm vi nghiên cứu đề tài khố luận nên chúng tơi chưa thể chạy thêm đa dạng nhiều mồi nên cần thu thập sử dụng thêm thị phân tử để làm tăng tính đa dạng mẫu giống ổi 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Đinh Trường Sơn (2020) Bài giảng KT di truyền, NL&UD Hà Nội Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vật, Tạp chí sinh học, 36(3): 265-295 Nguyễn Thị Huyền Trang, Lê Thị Thủy, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Hương Thủy (2012) Nghiên cứu biến đổi hàm lượng Vitamin C, polyphenol hoạt tính kháng oxi hóa ổi q trình chín, Tạp chí Khoa học Phát triển, 10(5): 805-811 Tài liệu nước Ahmed B, Mannan MA, Hossain SA Molecular characterization of guava (Psidium guajava L.) germplasm by RAPD analysis Int J Nat Sci 2011; 1(3):62-67 Chen, J., and J Chen, X S J, X.D Xie, C.F Chen, and Z.W Liang 2015 Effects of drip fertigation on yield and fruit quality of ‘jadeite’ guava China Trop Agric 6: 51–52+57 Gutiérrez, R.M.P., S Mitchell, and R.V Solis 2008 Psidium guajava: A review of its traditional uses, phytochemistry and pharmacology J Ethnopharmacol 117(1):0–27 doi: 10.1016/j.jep.2008.01.025 Dahiya KK, Sunil A, Karihaloo JK DNA fingerprinting of Guava cultivars using RAPD markers Indian J Plant Genet Res 2002; 15(2):112-115 Grattapaglia D and Bradshaw H 1994 Nuclear DNA content of commercially important Eucalyptus species and hybrids Canadian Journal for Research, 24: 1074-78 40 ishwas A Bapat, Umesh B Jagtap, Siddhesh B Ghag, Thumballi R Ganapathi (2020) Molecular Approaches for the Improvement of Under-Researched Tropical Fruit Trees: Jackfruit, Guava, and Custard Apple International Journal of Fruit Science 20:3, pages 233-281 Kanupriya, P Madhavi Latha, C Aswath, Laxman Reddy, B Padmakar, C Vasugi, M R Dinesh (2011) Cultivar Identification and Genetic Fingerprinting of Guava (Psidium guajava) Using Microsatellite Markers International Journal of Fruit Science 11:2, pages 184-196 Ni Nyoman Ari Mayadewi , I Nyoman Rai, , Rindang Dwiyani , and Ida Ayu Astarini (2016) Genetic Diversity of Guava (Psidium Guajava L.) In Bali Indonesia Based on RAPD Marker International Journal of Bioscience and Biotechology, 9: 303-337 Prakash D P., Narayanaswamy P and Sondur S N 2002 Analysis of molecular diversity in guava using RAPD marker J Hort Sci Biotech., 77: 287293 Priyamvada Pandey, Rajesh Kumar, Daya Shankar Mishra, Anand Singh Jeena and Jitendra Kumar (2017) Morphological and molecular characterization of guava International Journal of Chemical Studies, 5(4): 533-538 Wang, E.G 2017 Preliminary report on introduction of red meat guava varieties in Zhangzhou, Fujian South China Fruits 46(3):103–105 Yuan, C.C., H Wu, and K.D Liu 2010 RAPD analysis of genetic diversity of varieties of Psidium guajava L J Zhanjiang Normal Coll 31(6):112–117 41 PHỤ LỤC Hình ảnh ổi cắt ngang mẫu Ổi không hạt (G1) Ổi găng ruột đỏ (G2) Ổi lê Đài Loan (G3) Ổi rừng (G5) Ổi bát (G6) Ổi Đông Dư (G7) 42 Kết điện di sản phẩm PCR mồi Mồi OPA-03 Mồi OPA-05 Mồi OPS-04 Mồi OPS-05 43