Sử dụng công nghệ GEN để biểu hiện glucoamylase trên bề mặt tế bào nấm men

vvự 06/"1

Lời cảm ơn

Chúng tôi xi hân thành cám ơn Sở Khoa Học và Công Ngiệ Trung Tim Phát Triển Khoa Học Công Nghệ Trẻ TĐ, Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Sinh học Trường ĐHKH TN, ĐH Quế: giá Tp HCM đã giúp để về kinh phí và tạo điểu kiện thuận lợi cho chúng tôi thực hiện để tài này

Chúng em xin bày tỏ lòng biết on sâu sắc đến Thầy Trần Linh Thước

đã cho chúng em nhiều lời khuyên quí bầu trong suốt quá trình thực hiện dễ

tài

Xin cắm ơn anh Định Minh Hiệp, các anh chị và các bạn đồng nại

đã giúp đỡ, động viên chúng tôi hoàn tất để tài.

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

L Giới thiệu về công nghệ bể mặt tế bào

2 te Cơ chế chuyển vị protein lên bề mặt tế bào 6 ndm men Scerevisiae 11

1 .3 Nguyên lý chung của kỹ thuật cố định protein trên bể mật tế bao

năm men

3, Thành tựu và ứng dụng công nghệ bẻ mặt tế bào

Ứng dụng công nghệ bể mặt tế bào trong việc cố định các protein

chức năng

is Ứng dụng công nghệ bể mặt tế bào trong nghiên cứu sẵn xuất

3.3 Ứng dụng công nghệ bể mặt tế bào trong biểu hiện kháng thể

3.4 Ung dung công nghệ bể mặt tế bào trong sản xuất kháng thẻ kháng

3.5, lĨng dụng công nghề bề mất tế bào trong hấp phụ tế bào a

36 ở mật tế bảo trong ky aghe enzyme vee ES

3.8 gcday nghe be matte bdo trong KT by MOL UAL ee ee 1g +, GlivoamwEUE cuc

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHẤP se "5Ắ.Ð 31

1.VẶT LIỆU 2?

1.1 Dụng cụ và thiết DE eee ce cece teeeeceer ete tcceeeennnteceennuastesnnstensas 22

1.2 Hóa chất và môi trưỜng co se ceerihrhtrrerirrrrrrrrrrrrdriidrrre 22

2.2 Tao dong S cerevisiae pGA I 1/MTB-] biểu hiện gen mã hóa

glucoamylase trên bể mặt tế bào

3.3 Khảo sát một số đặc tính của dòng nấm men tái tổ hợp

KẾT QUÁ VÀ THÁO LUẬN

2 Tao dong S cerevisiae pGA11/MT8-1 b

2.1, Tao dong S crerisiae pGAL/MT8-I bằng phương pháp lithium-

acetate cải biên

3.1 Kiểm tra bằng kĩ thuật nhuộm huỳnh quang -

3.2 Kiểm tra khả năng phân giải tỉnh bột của dòng nấm men tái tổ hợp 45

3.3 Kiểm tra khả năng lên men trực tiếp từ tỉnh bột của đòng nấm men

"mà 46

4, Khảo sát một số đặc tính của đồng à mến tái tổ hựp MT-PGA 46 N6 nh a +6 4.2, Hình thất tế bào cu

3,3, Đông hục tăng

KET LUAN VA DE

TÀI LIỆU THẤM KHẢO

tà

công nghiệp dệt, sản xuất thuốc, vacxin Ngoài ra, xứ dụng kỹ thuậi gọn côn

cho phép nghiền cứu sự kiểm soát biểu hiện gen, edi tao vat saudi chy wong edi

thiển chất hưïng nông xió,

Giãn đây, miệt Ứng dụng nổi cua KỸ thuật gen hưỚng tỚI việu lao proleH

tái tổ hựp và có định nó trên bệ mật tế bào, Công nghệ mới nãy được gọi là

công nghệ bề mặt tế bào, Công nghệ bề mặt tế bào là công nghề sử dụng kv

thuật gen để thay đổi thành phần bẻ mi rể bão, thông qua đó thay đổi chức năng tế bào

Sự ra đời của công nghệ bể mật tế bào mở ra phiền Hiển vọng ứng dạng

^

rộng rãi rong các ngành khác nữữt như :

- Nghiên cứu sự liên kết giữu các tế bảo

- - Củ định các protein chức năng lên bé mặt tế bảo

~ Nady mda treading

- Neheen ctu hhane azuy dn Khing the

Xý nghệ cũủZy me bờ mặt

Thiết lập các bệ thống căm biến sinh học sử dụng trong nghiên cửu

sàng lục và phải hiện thuốc

Trong vác lagi i bau chd da duge sử dụng trong công nghệ be marc

bac gaat men Seccheromaves ccreriacug là tiệt tế bàu chủ có nhiều uu điểm do

tỉnh an toần trong sử dụng nhất là đổi với các sảo phẩm thực phẩm và dược

phẩm Bên cạnh độ, nấm men là tế bào nhân thật, do vậy thích hợp để biểu

hiện các protein ngoại lại cổ aguốn gốc cucaryote giảm thiển các rủi rơ trong

các biến đổi sau dịch mã protm Với các ưu điểm trên, công nghệ bể mật tế

bào năm men da ra dei va dude eng dung rong rd

Mammen S cerevisiae thuting duce su dung trong cong nehiép bia, rugu va lên men carbunhvedrat Wong công nghiệp Tuy nhiên, & cerevisiae không co be thòng vazvme thủy phần tính bộc va thity phan cellulose nén khong thé An

men nguyễn liệu giầu tỉnh bột và ccllulosc mặc di đây là nguồn nguyên liệu

phong phú và rẻ tiền, Như vậy, để cải thiện chức năng sinh học CủA Bấm Điển

$ cerewiae có thể sử dụng KỆ thuật gen dé chuyén gen ma hoa enzyme eJucuamylase NY nam mc Riizopus orvrae Vao nấm men § cerevisiae UY dé tuo ra đông nằm men tải tỔ help có khá năng sử dụng và lén men Hực tiệp từ tình

bột

Nhằm mG cis cho việc Ứng dạng công nghệ bể mặt tệ hào ở Việt Nam

trong phạm vị dc tài nghiên Cứu ›:›Ÿ chúng tôi xin trình bay Kết quá nghiên utfy tao dong nam men 4 cerevisiae tiểu hiện glucoat tmylase trên bỂ mặt tế bắc: và một số kết quả khảo sải đậu tỉnh của đồng nấm mca tái tổ hựp nây

4 oie

TONG QUAN TAI LIEU.

1 Giới thiêu về công nghệ bê mật tế bào

Bề mặt tế bào là thánh phần thiết yếu chu su sông của tế bàu là fut nat phân cách giữa tế bào chất bên trong và múi trường ben ngoài tế bào, Vì vậy bể mặt tế bão rất quan trọng đối với sự sống của tế bào Các chức nang của bệ mặt tế bào do cde protein tren bể mặt tế bàu thực hiệp báo š gốm: cầu bén bảo, thự quan chuyên Biệt, các ©ñ2Ym, protein vận chuyển Trong đó, mội số protein hể mậ: kéo đài đến mans nguyén sinh chất, các proiem khác gắn với cấu trúc bể mặt bằng các liên kế: đẳng hóa trị hay liên kết không dong hda wi Cac protein hể mặt được gần chuyên biết trong những vũng đặc biệt trên cấu

trúc bề mãi của tế bão,

Tế bão sống có các hệ thông gắn và cũ định prolcin bo mats nHững vị

tí chuyên biệt trên bể mặt tế bào, Cơ chế phần tử của các hệ thông này củn đang được nghiên cứu, Fuy nhiên, về mật ứng dụng, dựa vào những hiểu biết

về cơ chế cổ định protein trên bể mãi tế bào các hệ thống biểu hiện protein

ngoại lại trên bÉ mặt tế bảo vị sinh vật được thiết lặp và ng dung trong nhiều

lĩnh vực nhữ nghiện cứu sự tương tác giữa các tế bào, sản xuất vắc xmm.{Ì|

Hệ thống biểu hiện pro ngoại lại trên bể mặt tế bào đâu tiên đước nghiên cứu trén phage Sruth và cộng sự đã biểu hiện một chuỗi nepuide trên bể mật thể thực khuẩn bằng cách cắn chuối pe pide này Với proler của phage Két qua cho thấy rằng chuỗi penude dược biểu hiện trên bề mãi phage mà không ảnh hưởng tới khả nâng xam nhiềm của phage nay van tế bào È, củi {2] Thành công của nghiên cứu trên dan dén sv phat uiển của bệ thống biểu hiệu Ó phapc, Những hộ thống này sốp nhần lầm guá mình cô lần cầu Hgand chuyến biết, các khẳng nguyên, kháng thể trở nên dễ đăng, Tuy nhtch, protein đụng hơn siữa các pi Jypepude cô kích thước lồn va proban trên vò hội củu phuốc thường khó sát nhập vào thành phẫu của phayc dẫn đến không biểu

hiện được trong he thane này,

Sau hệ thống biểu biện ở phage nhiều nghiên cứu cho thay bể mi tế

bào vị khuẩn thích hợp cho sự biểu hiện phiền loại protein bé mặt, Ở vị khuẩn gram âm, việc cô định protein ngoại lại lên bề mật tế bào hấu hểi dựa vào phần lộ ra khỏi măng ngoài của các protein như lipoprotein, khuẩn ma, HỒU

mao, Đối với ví khuẩn gram dương, các Bệ thống biểu hiện trên bể mật tế hào chỉ mới được nghiền cứu gần đây, Hầu hết các hệ thống này đếu sử dụng kỹ

thuật dụng hợp protein ngoại lai với protein À của bể mặt tế bào ví khuẩn gram

dương Staphyloceceus aureus Bằng sự dụng hợp nầy, protein ngoại lại được

biểu hiện trên bể mặt tế bac vi khuẩn gram) đương,

Khi hệ thống biểu hiện bể mật được đưa vào ứng dụng trong các quy trình

xắn xuất sinh học như thực phẩm thức trống có côn, thuốc men yêu cầu đãi ra

là phải đảm bảo được sự an toần, Nấm mến § cerer6due là Vị xinh vậi được sử

dựng trong các quy trình chế biến thực phẩm, nước uống từ rất lầu, không gây bại và là miột trong các ví sinh vật được công nhận rộng rãi là un toan (ORAS

generally regarded as safe) Do vay ndm men được chọn là vì sinh vật phù

hợp đấp ứng yêu cầu an toàn trong sử dụng sẵn phẩm thực phẩm, được phẩm: của cúc quy trình sẵn xuấi sinh học, Thêm vào đó, nấm men rất dễ nuôi cảy để

đạt mật độ tế bào thích hợp trên môi trường rẻ den, Ban than té bao nani men tà tế bầu nhần thật, do vậy, nộ côn là một tế bào chủ th bop eho cone ashe gen khi biểu hiện, sẵn xuất cúc protein có nguồn gốc cucaryote, Với những vt điểm trên, nấm men $.cerevisiae lÀ một đối tượng thích hợp cho sự phái triển

hệ thống biểu hiện bề mật,

2 Công nghệ hề mật tế bào nấm men |8 9 t 11, LẢ (5, 17, TR 22

2 Céu tric bé mdi té bao ndm men va cde thành phần chúc năng trong công nghệ bê mãi tế bào

? 1 † Câu trúc BÉ tài tỉ Đào nàn) men S cerevisiae

Bên nguài miầng nguyên sinh chất, tế bầu nấm men Š, cerevbtde có

thành tế bào dày và chắc chấn (khoảng 200am) Thành tế bào à cơ/crtdue được cầu tao chủ vềun từ manndorotem và cấp gn Hoan Hếna kết với nhấn bởi nói l, vú vấu trúc gai lớn, úp tạo Khung xướng tế bảo ở bén Hung a Op ghi cán

phủa HñgORI càng của bể niất tế bào, Cát tỷ Báo pamoumen Ã, cerới Giác loại d

biển hiến a-apeluuinin, ngược lại tế Bếu nấm mep loạt @ hiểu hiện

agelubnin

-œaggluUinm được mã hóa bởi sen AGmi, có chức năng tưởng lúc độc hiệu với tiểu phần gắn (binding subunio của a-apglunnin trên tế bào nấm món loại a

a-agglutinin hao gim mét tiếu phần lõi (core subuni) Agnlm, mã hóa

bởi gen AGAi, Tiểu phần lỗi này nối với môi tiểu phần được mã bỏa bởi gcn

AGA? ˆ

œ-Agglntnin và tiểu phần lỗi của a-aggluunin đều mạng trình tự tín hiệu

(sss) cần cho quá trình tiết protein (secreUon signal reglon), vùng hoại động đảm báo chức năng của protein agglutinin, mot trinh tự peplid giku serme, threonine va mat ving due gid dinh cd chulc nang nhan dién, gan agglutinin Wen be marc fio mang idn GPL glycoss tohosphudiads hnositad.

5§5S Vũng hoạt động Vùng giàu Ser/Thr Neo GPI

v

tĩnh 3: Alà hình edu tric a-aeglutinin

Ga f-ÄšgIntinin là mội chuối pepbd dài: khoáng 650 anino acid Rằng kệ

thuật đọt biển điểm định hướng người lá nhận thấy rằng các hoại đồng chức

Hằng của Gas glutinin dụ chuối pepnd ở đầu N của han tử này gui định, Đầu C vúa &-ngglutinia là vàng cần thiểi và chịu trách nhiệm truay việc ấn phân tử proter nay ten be matic blo

b Nee GPE wlyconvlinkesetiatetidvtinasitel

Neo GPT được tìm thấy ở nhiều protein trên màng nguyên sinh chất của tế bào cucaryote, từ protein vỏ bọc của protozoa đến phân Hứ có chức năng liên kết tế bào ở đồng vật hữa nhũ, ÖPI thường sẵn với các nhóm phân tử chức nằng, Một trong số cáu nhềm phần tử chức nage nay ia cde gÌycoprotein be mat cua protazoa Cac protein ndv che phủ hầu hết bế mát của môi số loài prolozna như Ƒ IV Ung bruce! GP! rất cần thiết cho sự sống của các loài sinh vật

nay Mot ohdm phần tử chức năng khúc là nhóia các phần từ hên kết bao gỗ¡n

pữteosglvoagn và N-CAÀM neural cell qghesion nolocgfe}, môi số khá Hư nouyvẻa dụng Bách huyệt (Iyniphoil aatipeni như TRy-E, CEA-š (lymphocvte funcHon-

1sS d6 a012en) cũng có dea GPL

CÍ nấm men, neo GPI hiện điện ở rất nhiều protein trong đó về protein a

daylHinm, Neo ÚP] động cái ö quan trọng trong sự biểu hiện protet Để Tạt,

động thời nẹu GEI cũng rất cần thiết cho sự sone cua bao adm mien Phan giVcophuspboliptd của neo ỐPI sấn với đầu € của protem bề mật bằng liên kel ding bos ti và thực hiện chức năng duy trị sự kết nối ổn định của protein vd) Mang, tae

Cau tric cla GPI ed tính bảo tAn cao trong nhiều sinh vật nhân thật

gười tạ thấy rằng cấu trúc cơ bản củu GP] trong tế bảo nÑm men tương đẳng với vậu cầu trức tìm thấy trong những sinh vật nhần thậi khác và thường dược cầu thành Bởi cúc phần tử như Đ‹ethanolamide phosphate, a- 1 2-mannose u- Ì Ỗ-mannose, ot mannose, -lo-glucosamine, inositol phosphulipid (Hinb 4) Thank phan cau inositol phospholipid thay dit: ong các cấu inic mee GP!

ï nản men.

Các trình tự acid amin cần thiết cho việc gắn neo GPI của các protein be

mat G nam men Scererisige dude tinh bay trên hang Sai

Bảng | Cade protem bể mặt của tế hào nấm men 5 cerevisiae nnn aes Va trink ti

amino acid gan két vdi neo GPI

Sẽ

1 Tên protein

thứ tự Ký hiệu I Trình tự acid amin gắn kết với neo GP

— ——“

l— ¡ ư-Ágghhuinin TATALMISTYEGKASIFFSAELGSUPLULS YLLF

Cae protein gan neo GPE od chad: peptide ky nước dau © khi quả

trình xinh tổng hợi: protein Roàn iat proteins mới tạo thành vẫn được neo trỏn MAN cha mang RA nột chất nham bing dau carboxy! ky nude, mot phan cou

protein nằm trong lông ống của mạng lưới nội chất nhấm, Trong vòng mội

phúi, đầu carboxyl ky nước bị cất ở vị trí œ và tách khỏi mạng lưới nội chi

nhảm Đống thời, cũng tại vị trí này, có sự gin neo GPT vie protein thdne qua

phán ứng chuyển amin vdi ade tic ea enzyme transamidase

Le

Giycan

2.2 Cơ chế chuyến vì protein lên bê mặt tệ bào ở adn men 3; cerevisiae

Kết quả thí nghiệm trên các thể đột biểu 5 cererisie mắt khá nâng

chuyển vị protoin cho thấy sự định vị ằœ-awsiutinin và a-agelutinin trên be mat

tế hào thông qua cơ chế chuyển vị protein, Ngày này, người tạ biết tăng, ở K,

cerevisiae, con dudng chuyén vị protem nhìn chung đi theo trình tự sau:

Lưới nội chất nhám -> Các không bão vận chuyển -> Bộ máy Golgi ->

Các túi tiết -> Bể mặt tế báo, Như vậy, quá trình tiết protein 6 S cerevisiae

bao pẩm sự chuyển ví qua hàng loại măng xinh chất của các bào quan tạo thành cón đường Hết protein (protein secretion pathway} Đắn tiên prolein tIỂ! được

chuyển vị trong lông ống của mạng lưới nội chất nhám, sau đỏ được chuyển từ

tưới nội chất nhầm sang bộ máy Golgi thông qua cấc không bào vận chuyển và từ đó chuyển đến màng nguyên smh chất qua các túi tiết gắn trên màng Cuối cùng sự dung hợp giữa các túi tiết có nguồn gốc từ bộ máy Goigi và màng nguyên ainh chất có tác dụng đưa protein ra bé marté bao Cac agglutinin Jude phống ¡ích lên bể raặt tế bào nhờ (ác động của ñ-plucanase, nếu không cụ sự tác động này, các agghutinin vẫn gắn ở màng nguyên sinh chat bang neo GPL Do vay, o-agglutinin gan nhu bi bao bọc bởi thành tế bào, Trong trường hớp nầy, vì thành tế bào adm men rất đầy (210am) nên ơ-agglubnin không đủ dài để có thể vữa gấn trên màng tế bào ở rạng thái hoạt động vừa thể hiện vi id kết đính trên bể mặt của thành tế bao, Như vậy, s-agelulnm được chusén ra

ngoài mảng nguyên sinh chất thông qua cơ chế chuyển vi protein trong dang

gin vdi neo GPL San da, a- -agplutinin tách khói màng nguyên sinh chất nhờ tác động ctia enzym phosphatidylinositol phos spholipase C (PI-PLC) va chuyén ra bể mật tế bào Quá trình neo ơ-agelulnin trên vách tế bào được hoàn tất bằng việc gắn thêm ñ-l 6-giucan vào phan con Jai cua neo GPI trong cẩu trúc Ø-

Thành 1% tae oe seg tutiala

Neo GPE oT

chuyea vp peedouy Xuất bào lên bé midi 1é báu

nấm men S,

cerevisiae ER, ludi ndi char, SV,

không bào tiết

Thể Golgi

Ff EK

trelitnin nhờ xúc tÁc cua enzyme transanudase, Hệ von vận chuyền tứ

ioe

soelutin nga BỂ mặt tế bầo được mÕ bình hỏa trang Hình 4 như sau?

3.3 Nguyên lý chung của kŸ thuật cễ dinh protein trén bé mdi t& hae adm men

Hồ, 12, ix]

Các proleim bề mặt tế bào như Hacculhin PLOT, Cwps va agglutinin da và đang được sử dụng cho mục đích cổ định protein trên bể mặt tế bào men,

Trung đó, œaggluunin và tiểu phan Aga2p của a-aggluinin được ứng dụng

nhiền trong các hệ thống biểu hiện protein ngoại lại trên bỂ mật giyc - zotoin

Trong trường lớp sử dụng œ-ageiadnain lâm cầu nổi ung gián nhằm

biểu hiện protcin ngoại lại trên bề mật tế bào nấm niên, proiein mục tiều được nổi Với trình tự tín hiệu của neo gắn ở đầu C -œ-asslutinia bằng các kỹ thuật

xinh bọc phân tử, Đầu C-g-avsiugbain, CH-A sứp, là trình tự peepud gầm 320 amind acid nằm ở đầu C của dedgiuiaia và cầu Húc neo giycosy[ phophaudyl inosital, GPL Giống như trường hựp của Aga2p, cầu túc neo GPI được sử dụng

để nhận biết và chuyển vị nuïiein mục tiêu lên bể mặt tế bào (Hình Ôi,

Alah 6: Cau tric bidu hién pretein

needl lal trén be putt #8 bee ridin men fades gue ữ»gdQÄ0HTHữN

3 Thanh tutu và ứng dụng công nghệ bề mặt tế bào l5, 7 23|

3.1 Ứng dụng công nghÊ bÊ mãi 1€ bào trong việc cế định các motebL chức

NỆHE

Trên thực tế, có nhiều hệ thống cổ định protein thẳng qua các phường

pháp khác nhau Một trong các phương nhấp là cố định protein théne qua cae x

liên kết đồng hoá trị bến trong môi trường có nông độ muối cao và nông độ cơ

chất cao Tuy nhiên trường hợp này thường xây ra hiển tượng thay đối cấu trúc và tính chất của phần tử protein được cố định mặc đù đã được xứ LÝ và cải thiền -ăng nhiều phương pháp khác nhau, Thêm vào đó, sử dụng phương pháp số

định protein bằng các liên kết mạnh thưỡng gặp khó khăn trong việc Xác định chính xác điều kiện phan ứng cố định, Các phương pháp cd dinh protein khác, kể cả phương pháp cế định bằng tương tác lòn, đều có thể dẫn đến sự phá hủy

cấu trúc sinh bọc tự nhiên của prolein và do vậy làm mất cấc chức nàng sinh học của proteim sau khi được cô định,

Việc ứng dụng kỹ thuất gen, sử dụng bé mat t€ bao lam vat mang để cổ định protein chức năng có thể giải quyết những khó khăn gấp phái trong cấc phương pháp kế trên, Protcin mục tiêu được biểu hiện nhờ hoại động của promoter trone tế bào chú sau đó, do SỰ + vấp xếp cau trúc gen, prottin mục liều được cổ định trên bế mật tế bào mội cách tự nhiên theo cổ chế tiết protoin của bào, Nhờ vậy puatcm mục tĐiểu sau Khi được cô định trên bở mật tế bảo V án vú được cấu trúc và các hoại tỉnh SH học Tự nhiền, Các protein này có Khả

găng đáp ứng các chức nắng bể mật từ báo như nhạn diện, hẻn ROE GS tic, thy

qnan chives bét, enzyme profes vận chuyển,

Thiết kế hệ thống cổ định prolsin trÊnP hễ mãi tế bào vị sinh vật, đặc buổi là nm nen, mô ra nhiều triển vọne ứng dụng như nghiền cứu Sự búp shar te bào, sản xuất vắc xin, nghiên cứu sự nhận điện phân tứ chuyên biệt, nghiển cửa cơ chế nhận điện kháng nguyên Kháng thể, thụ quan chuyên Biết bày NI

xuÃi cấu chất xúc tác sinh học như cn/y0nc

tHffỀtt tia tế Txá»+

3.3 tÍng dụng công nghệ bề mỗi tỆ bào trang nghiền ciêu sân xuất vấc-*úI

MiỘt trong các điển vợng ứng dụng lớn thúc đẩy việu nghiền cửu các hệ

thống biểu hiện protein ngoại lủ trên bể mặt tế bào là sản xuất vấc-xim sông, Vấu-xin sống tí tổ hợp lá dạng tế bào vị sinh mang trên BÉ mật tế bào các polyoepud gây miễn dịch Các polypepHd gây miễn dịch nầy có nguấn gấu từ

các tức nhân sây bệnh, Đo vậy, san khi vấc-xin sống được đựa vào cơ thể

người động vật bãng đường nường, nó sẽ có khả nẵng gây đáp ứng miễn dịch

cho cd ine vit cba

rất nhiều loại vắc-Xửn tải tổ hựp được sản xuất và sử dụng,

Miặc du đủ có Ï

ác-xm sông từ hệ thông biểu hiện Để mắt tế bào có những tu

việc šỬ dụng v

điềm sau:

- Kháng nguyên biểu hiện trên bể mặt tế bảo có thể được hệ thông

miền dịch của cơ thể nhận diện tết hơn do các kháng nguyễn này được biều hiện một cách tự nhiền và sự xâm nhập vào ca thể vũng tê

bào chủ

- Màng ngoài của tế bảo có bản chất là lipopolysaccharide cam ứng

sự đáp ứng miễn dịch mạnh và có thể sử dụng nhữ mội tả dược chủ

các polipepdd được neo trên bể mặt tế bào.

Trên thực tế nhiều kháng nguyên peptid có nguồn gốc từ một SỐ nguồn

bệnh đã được biểu hiện trên bể mặt 1€ bao E cali hay Salmonella So với CÁC VỊ sinh vật kể trên, nfm men 3 cerevisiae co nhiều ưu điểm hơn trong mục dich sản xuất vắc-xin sống đo nấm men này không gây bệnh, đám bảo được sự an toàn sử đụng,

3 Ứng dụng công nghệ bỆ mãi tế bào trone biểu hiện kháng thể tà thành

lần các thu tiên nepttd

Gan đây, sự phải tiểu của kỹ thuật biểu hiện protein trong thể thực

khuẩn đã góp phần lồn làm dừn gián hóa việc chọn lọc cất peptid vA cd Khang

thể tái tổ hợp Vĩ dụ như thư viện kháng the sc Fv (single-chain Fy ant ety) là

thư viên đấu tiên được biển hiện trên bể mặt thể thực khuẩn, Cũng trên thể

thực khuấn người tá đã biểu hiện các kháng thể có ái lực cao dùng để cô định

kháng nguyền, Việc sàng lọc nhanh chóng các thư viện kháng thể lớn fed the chữa 18” - 10 khang thể tái tổ hợp) hứa hẹn một triển vọng ứng dụng lớn

trong VIỆC ` phát triển kháng thể đùng trong trị bệnh ở người, phát triển kháng

thể xúc tác

~ VN

Sự ra đổi của các hệ thống biểu hiện trên bể mặt tế bào vị khuẩn, đặc

biệt là biểu hiện trén bỀ mặt tế bào nam ten Wao ra nhiều hệ thống sing lọc

kháng thể bố sung cho công nghữ bề niặt thể thực khuẩn, Các hệ thống biểu

hiện này chủ thấy vỏ các ứu điểm như su0;

- Củ sự hình hoạt o2 ntti độ bí “a bin protera be mat

- Đối với hệ thống biểu hiến trên ví khuẩn VÀ nầm men, số hiking

nủÌx pepuid được biểu hiện trên Đề mặt tế bầu nhiên bay H lũy Hiệu vào sự lda chọn và thiết Kế vector biểu hiển,

- Hệ thống biểu hiện trên thể thực khuẩn đòi bội polypepUdl mục bea

nhất thiết phải được gắn với đầu N của protein va cua thể thực

khuẩn Ngược lại, trên hệ thống biển hiện ở ví khuẩn và nấm mien, các polypepud này có thể được vấn ở đầu C hay đầu N, Đây là một

yếu lố quan trong trong VIỆC lạo cấu trúc không gian ba chiếu của protein sau địch mã,

- Biểu hiện protein trên BÉ mi thể thực khuẩn thường ảnh hưởng dén

khá năng xâm nhiễm của thể thye khudn vao £ coli va du vay gây

trở ngại cho hước sàng lục thể tái tổ hợp,

- Các thao tác trong cơng nghệ hệ mặt tế bào tên vị khuẩn và nầm

men thường dễ thực hiện hơn so với thể thực khuẩn,

3.4 Ứng dụng cơng nghệ hệ mất tẾ bào trong sản xuat kháng thể kháng

peptid

Việc biểu hiện kháng nguyên trên bể mặi tế bào cĩ thể được dùng để tạo

các kháng nguyên vector để gây đáp ứne niễn địch nhằm tạo các kháng thể đa dịng ở động vật Trong các nghiên cứu của mình, Hofnung và cộng sự phái

miah neat phường pháp đơn gián nhằm sắn xuất kháng kháng thể Pepuúd mục

tiêu được sản với hai loại prolem, MIslE Gmaltose biading proiein) và mội protein bề mất tế bào, LamB Tế bào biểu hiện đụng hợp pepnd-LamB được sử dụng để sấy miễn nhiềm động vật ở hai dụng, dạng tẾ BẢO nguyên ven va dang tế bào bị phá vỡ bằng sĩng siếu âm, Sau đĩ, phần dụng hợp pepud-MaIE được

sử dụng để định tính và định lượng kháng thể, Bằng cách nâv, cĩ thể và phái hiện kháng thể đặc hiệu của pepud niục Hếu mà khơng cần phải tổng hợp

pepldl này bằng phương pháp bĩa học cũng như khơng cần kết gấn peptid nds

với mội protein mang để gây đáp ứng miễn dịch, :

3.5 Une dung eéne nehé b&@ mdt té baa trone hép pitu té baa Gvitole-cell

adsorbent)

Trong sắc ái lực chuyên Biệt sử dụng kháng nguyên, Kháng nguyen này cần được sẵn xuất bảng giá tính lên mĩn được m chế sạn đĩ sắn bằng hĩn kếi đồng hịa tị với pha cĩ dịnh của bệ sắc ký, Trong đã số trường DUP qua ảnh này rất tổa Nớm VÀ chỉ dành cơng cho việc tủ ` SẠCH Cốc 4H, H81 cv SỐ

H1 cao

Hiểu hiện prolein rên Bổ mật € bio cho phép tạo các sản phẩm bap pha di lc re Ges Protein due seu " X mật tế bào vị sinh vật, Lạu các từ bầu vị sinh cơ định pònie mà khơng ảnh hướng đến cáu chức năng sinh học

chính của tế bào chủ Trong các năn trước đầy, tế bào vị khuẩn boany dai

máng các thụ quan bề mặt đã được sử dụng như một cơng cụ hấp phụ Gần đây,

nhất là việc sử dụng các tế bão Staphylococcus aureus vi protein A biểu biện

trên bể mặt tế bão ái lực cao đối với Fc trong globulin mién dich cla ddng vat

hữu nhà Sự biểu hiện các kháng thể chuối đơn (single-chain anHBody! và

protein thạ quan trên bể mật tế bào vị khuẩn và nấm men hứa hẹn mội triển

vịng une dụng trong viỆU nắp nhụ tế bào.

Trong lĩnh vực này, có rất nhiều enzyme đã được cổ định trên bể mặt tế bào nấm men như biểu hiện o-galactosidase, glucoamylase hpase đồng biếu

hién o-amylase va glucoamylase, celhilase q-Galactosidase có nguồn gốc từ

Cyamopsis feiragonoloba đã dude sử dụng làm enzyme chí tín Gen mã hỏa œ galactosidase, được gắn với dau € -d-agHutnm, sự biểu hién cac protein nay được kiếm soái bởi promoter thudng HỰC phasphoglycerokinase (PGK) Ket quả nhuộm miễn địch huỳnh quang cho thay protein dung hop nay hiện điền

tren bé mat té bao ram men

3.7 Ứng dụng công nghệ bề mặt Tế bàa trang cảm biến sink hac

Cảm bien sinh hoc (biosensor) là những yếu tổ sinh học có khả nắng cảm biển, nhay cảm với vật chất và chuyển những °c "cảm giác” nhận được thành

tín hiệu, Các tín hiệu nãy Có thể nhận biết và quan sát được Thông qua các lÍủ hiệu nhận được tầy theo tính chất của biosensor, chúng ta có thể biết được sự hiến diện, bản chất và sự thay đổi nổng độ của vật chất, MộI số hệ thông cảm

biến sinh học đã được thiết lập để áo nêng độ glucosc trong máu, đo hàm Jung

và sự thay đối nàng độ của lòn calcium trong TẾ Đào v.V,

tÍ nợ dụng các thành tựu của công nghệ bể mật tế bào các nhà khua học

đang hướng tới việc thiết lập các hệ thống cảm biến sinh học dùng dé theo doi kiểm soát nếng dO phosphate, tinh bột, sự hiện điện cia cdc kim loại nẵng trong radi irudng ham lượng cthanol ong qua trink Jén men Cac he thống, cảm biến sinh học này có thể được ứng dụng vào Các gu trình lên Hiền sản xưấi ^^

ln, ứng dung 1 rong việc Sằng học, kiểm: soái thuốc,

tùnh 8: Cait bien sinh hes dai vei sue Stay dor nding db culctum 3.8 Ung dung cing nghé bo mat 1€ bee troug xi Wi mdi inddng

Xử lý môi trường là mội trong các lĩnh vực ứng dụng của công nghệ bề mật tŠ bảo, Sử dụng kỹ thuật sen, eø2ynlee phân giải các hợp chất hữu cơ cao

phần tử được gắn rên bề mi nà báo Như vậy, có thể dùng sinh khối tế bào

mang enzyme trên bể mặt như một chế phẩm sinh học để xử lý môi trưởng,

r

Công neiệ bỂ mi tế bào căng được ứng dụng trong việc cấi thiện các môi trường é nbiém kitn loai nặng Đằng cáu dòng tế bào biểu hiện ven hap tha

oe - ~ 272 we RES OY ye wo a ra ¬ Sone

fare low: mine trần B mat Mhẩt số hệ thông bận thu kim loại nặo» đang đượu : te : = we X : “ae x

nghiên cứu như hấp thu Cu `”, ến

4 Glucoamvlase

Clocuamylase thdy phần liên Kết a - L và ở - 1.6 gÌúcan trong

polisaccharsl, tách tuần tự từng sốc slucose từ đầu không khử của mạch,

Glocoamyvlase côn có Khá năng thủy phân glucogen amylopectin, dextrin,

izomialose, mahose tổi elucose, Các cơ chất có cấp tạo phản phánh bị

glucoamiylase tấn công với vận tốc khá lủn, Đa số glucoanayhese đã biết đến

&

thể hiện hoạt lực tối đa Ở vùng pH 3,5 ~ 3.5 So vdi o - amylase glucoamylase bến với acid hơn nhưng kém bến với tác dụng của rượu ctylic, accton Tĩnh bột hay olgosaccharid có thể bí thủy phần hoàn toàn thành giucose dưới tác đồng của ghivcoamylase từ nấm mốc Ñroj@ delemar va bi thay phân thành 80-85% glucose cầng các oHsosaccharitd khác nhau dưỜi tác độce cua ghìcosoatnviisg — xt

từ nấm mốc Asp nieer Khả năng thủy phân mạnh mẽ cả liên két 0-14 va a L6: thậm chi cé a-1.3 glucan cia glucoscamylase gitp enzyme nay dat vị tí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bat Vi vay, viéc sử đụng glucoseamylase

trone sẵn xuất bía, rượu, mật, tình bội có ý nghĩa triển vọng vÕ cùng lớn lao.

VAT LIEU

PHUONG PHAP

May Ide du nhiéi (Stuart Scientific Auh}

Máy chụp hình gel Ìmagemastcr VDS (Amersham Pharmacta Biotech}

Máy giải tinh ty gen ABI 375 {DNA sequencer 373 AppDed

Hap soi dén tw ngeai Hoefer (model no UVTM-19-230V}

Máy ly tâm fanh Mikro 22R (Hettich Zenirifugen) Máy ly tâm lanh Bicfage Sratas (Heraeus ìn?USHI€DIX)

Máy điều nhiệt theo chủ kỳ PTC - 190°"

Maks ổo quang phố Líhrosgee 2180

- Đừng địch H ( pha trước khi dùng ) Trong 100001 có các thành phần

Sodium dodecyl sulfát (GDS) 10? 1001

DHLO 8604

Dune dich 20% PEG 6000/2,5mM NaC]

Dung dich HE (KOAC) pH 4.8: Glacial gectic acid Q.2M

- sopropanol hui::( giữ d - 30” )

EtOH 99% (EU: soi 99%) lạnh (ơi ố -20”C),

Hồu chất dùng để tách chiế DNA plasmid từ nấm men

- #vmolise ” Yeast DNA plasmud extract kit (Clontech }

Húa chất dũng để biển nạp phạnHd vậo vì khuẩn

~ Dung dich CM:o fms CaCt

bro MuCis 6 HO

Cuadlh (Gui tanh (gis 4°)

Ampicltin 100mgaml tụịhú trong nước cất vô núững)

Hou chat ding dé én nap phöủd vào nâm nen

- Dung dich nap man: 0.25 & bromuphenal blue

40% glycerot trong TAE LA

Bộ hóa chất dùng để thủ nhận và tình sạch gen từ gel agarosc

- Sephaglas MS Band Prep Kit (Amersham Pharmacia Biotech)

Hóa chất dùng cho bảo quản giống

- Giyưet | 80%

Thuốc thử Lugol: là ty

Nước cất - 300ml

iO MAI Hriưng

- Môi tring LB (Luria ~ Bertani) (mdi trường nuối cay B colts

Thành phân mỗi trường như sau:

the

Trypton 10s Cao nam men Sg

DH:O Hl00ml

Miỗi đường LB-An Onôi Hưởng chọn lạc thỏ hice map Ê: co] Thanh phần tượng tự như mỗi tưởng LB và được bố sung thêm Ampiedlin với nóng độ Sng/nủ §40-48°C saa kip aap kUẾ tùng Môi trường ŠSD-trp môi trưởng SỐ thiểu Irymophan) (mỗi rưỜng

chon foc thé bith nap ndm nies}

Thành phần mỗi trường nhữ sau:

Uracin 3ừng Yeast nitrogen buse 5, 7g

ĐH„O ¡000ml

- Môi trường YPD (Yeasi Pepton Dextim )

Thành phần môi trường nhữ sau

Cao nam men ig

Môi ưng dược hòa tia chuyền vào ống nghiệm ÔinGp¿ 1, Cũ: Câu ngôi ng

một ống Durham (úp ngượu xuống)

Tất vả các môi trường trên đều được hấp khử rùng ở 121”G trong 3Ö phút,

Môi trường rắn có thành phần như mới trường lỏng và được bổ sung Tï agur Ì.3 Nguvén vat Neu

!,3.1 Các chủng vị sinh vật (Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh bọc phản tử)

- Ếgcherichiu ca DHầo (ÍE” chải hs 17 (remy) supE de thik recA!

gvrA9ố 4 lacU H9 (ệ 60 (acó 4 3( 151)

~ Saccharomyces cerevisiue MIS i (MATa ade hind feulirp Ù ngư

Í.33, Thành phần phân từng PCR

Tay DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotest:

1.2

- Pfu Turbo DONA polymerase (Stratagen, Nbat Bans

- JON PCR Buffer: dùng cho Tay polymerase (500mM KCL, Lâu MeC} 1G0mM Tris-HCL, pH)

1OX Pru PCR botfer

- dNTPiAmersham Pharmacia Biotech}

- Các cặp mdi (primer) dac hiệu đăng để khuyếch đại sen

3 6557 4 436} 5 3332

L234 Encym cd? gidt han

SucH, EcoRl, Bgild, Xhai và các dụng dịch đếm kẽm theo (Toyobo- Japan)

PHƯƠNG PHAẠP

3.1 Câu trúc vevter tái tô hơn biểu hiển gen mA boa glucoamyvlase trên

bể mặt tế bào nấm men

ĐỂ Tạo vecttr nung gen mục tiêu biểu hiện trên bề mặt tẾ bào nấm wen,

trước tiến ching 18) UEn hanh cat vector plasmid va gen muc ben hằng cũng

một enZ⁄ym cải ønÌ hạn, sua đó thực Riện phản ứng noi va chon law veehar iH

tổ hựp mang een rong muốn, Quá nình thiết kế vector tái tổ hợp biểu biện sch mục tiêu trên bể mặt tế bào nấm men được mô hình hóa qua SƠ để sau:

36