Tom tat lats nghiên cứu hóa học, chiết xuất, bào chế và kiểm nghiệm một số hợp chất polyphenol trong nguyên liệu và thành phẩm từ lá actisô đà lạt – folium cynarae scolymi)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC, CHIẾT XUẤT, BÀO CHẾ VÀ KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG NGUYÊN LIỆU VÀ THÀNH PHẨM TỪ LÁ ACTISÔ ĐÀ LẠT (FOLIUM CYNARAE SCOLYMI) Ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2023 Cơng trình hồn thành tại: Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp trường Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a Lý tính cần thiết nghiên cứu Actisơ (Cynara scolymus L.) dùng để hỗ trợ điều trị bệnh gan, mật hạ lipid máu Hiện Actisô trồng phổ biến nhiều nơi giới với quy mô sản lượng lớn Tại Việt Nam, Actisô trồng nhiều Đà Lạt, Sa Pa, Tam Đảo đề tài nghiên cứu hóa thực vật còn hạn chế, đề tài thường liên quan đến ngành chăn nuôi nông nghiệp Hiện nay, việc nghiên cứu phát triển thuốc từ Actisơ hồn tồn phù hợp với sách quốc gia thuốc định hướng phát triển dược liệu Bộ Y tế Actisô 40 thuốc định hướng ưu tiên đầu tư phát triển Hiện thị trường Việt Nam giới có nhiều chế phẩm từ Actisơ Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy có nhiều kết không tương đồng nguyên nhân cho cao chiết Actisơ chưa tiêu chuẩn hóa nên có khác biệt lớn hàm lượng polyphenol chế phẩm Chính vậy, mục đích nghiên cứu sản xuất cao chiết chế phẩm đạt chất lượng tương đương cao số chế phẩm uy tín tiếng nước ngồi (Chophytol - Rosa Pháp,…) b Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dược liệu Actisơ Nghiên cứu quy trình sản xuất bán thành phẩm (cao chiết) thuốc (thành phẩm) từ cao Actisơ có hàm lượng cynarin acid chlorogenic tương đương cao chế phẩm nước (Chophytol Pháp) c Đối tượng phương pháp nghiên cứu ❖ Đối tượng nghiên cứu: Lá Actisơ (giống xanh) ngun liệu dùng chiết xuất, phân lập, xây dựng quy trình định lượng nghiên cứu sản xuất cao chuẩn hóa Việc định danh thực TS Võ Văn Chi Các phận dùng khác (hoa, thân, rễ, gân lá) giống Actisơ (xanh tím) dùng để nghiên cứu so sánh thành phần tác dụng sinh học Các mẫu lưu môn Dược liệu, khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM ❖ Phương pháp nghiên cứu: - Dược liệu chiết xuất phương pháp chiết nóng, phân lập chất sắc ký cột silica gel, sephadex sắc ký điều chế, xác định cấu trúc hợp chất phổ MS NMR - Các chất gồm cynarin, acid chlorogenic, cynarosid phân lập thiết lập chất đối chiếu theo ISO 13528 17025 Xây dựng quy trình định lượng HPLC UPLC-PDA thẩm định qui trình theo hướng dẫn ICH - Các cao chiết chất tinh khiết phân lập thử hoạt tính chống oxy thử nghiệm DPPH MDA với chứng dương acid ascorbic silymarin - Khảo sát phương pháp chiết xuất cao Actisô giàu hàm lượng cynarin acid chlorogenic quy mơ phịng thí nghiệm, triển khai chiết xuất cao Actisô quy mô lớn (500 kg phiến lá/mẻ) - Dựa vào cơng thức quy trình bào chế khảo sát trước đây, áp dụng bào chế với ngun liệu cao Actisơ chuẩn hóa nghiên cứu nâng cấp cỡ lô sản xuất viên nén bao phim quy mô 15.000 viên/lô Khảo sát độ ổn định chế phẩm d Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn - Lần đầu cung cấp quy trình phân lập đồng thời CĐC (CY, AC, CR) đạt hiệu suất cao, quy trình đơn giản dễ thực với điều kiện nghiên cứu nước - Lần đầu công bố động thái tích lũy hàm lượng acid chlorogenic Actisô theo thời gian thu hái hàm lượng cynarin cao chiết tương ứng chúng - Lần đầu công bố khác biệt 12 thành phần polyphenol hoạt tính chống oxy hóa giống Actisô trồng phổ biến Đà Lạt (giống xanh tím) - Lần đầu cơng bố khác biệt 12 thành phần polyphenol phận dùng (lá, gân lá, thân, rễ, hoa) giống Actisô - Lần đầu công bố so sánh hàm lượng 12 polyphenol chế phẩm Actisơ nước so với chế phẩm nước - Lần đầu cơng bố so sánh hoạt tính chống oxy hóa mơ hình (DPPH MDA) hợp chất tinh khiết phân lập từ Actisô - Lần đầu cơng bố so sánh HTCO mơ hình (DPPH MDA) cao chiết từ các phận dùng giống Actisô - Lần đầu sản xuất thành cơng cao chiết Actisơ chuẩn hóa viên nén bao phim từ cao Actisô với hàm lượng acid chlorogenic cynarin đạt chất lượng cao e Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 33 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 22 trang, kết nghiên cứu 66 trang, bàn luận 25 trang, kết luận trang kiến nghị trang Luận án có 80 bảng, 47 hình, 198 tài liệu tham khảo gồm 15 tài liệu tiếng việt, 174 tài liệu tiếng Anh trang web; 63 phụ lục thể kết thực nghiệm TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Thực vật học Cynara loài lưỡng bội (2n = 2x = 34) nên chúng đa dạng kiểu gen Lanteri cộng (2012) báo cáo đa dạng kiểu hình tạo hệ nhờ lai hóa kiểu gen Actisơ trồng với Cardoon trồng Cardoon dại Porceddu cộng (1976) đề xuất chia giống Actisô thành nhóm (Spinosi, Catanesi, Violetti, Romaneschi) dựa vào đặc điểm hình thái hoa đầu Ở Việt Nam, Actisơ người Pháp di thực từ kỷ 20 Hiện nay, giống Actisơ A80 (“giống tím”, ký hiệu AT) giống A85 (“giống xanh”, AX) trồng nhân giống rộng rãi Đà Lạt Cây Actisơ có nguy thối hóa nguồn gen có suy giảm nghiêm trọng sản lượng chất lượng năm gần phương pháp nhân giống vơ tính truyền thống dễ bị lây nhiễm bệnh từ mẹ Hiện nay, chưa có nghiên cứu so sánh hàm lượng polyphenol giống Actisơ để cung cấp sở khoa học cho việc lựa chọn giống sản xuất chế phẩm 2.2 Thành phần hóa học Lá Actisô giàu polyphenol (acid phenol flavonoid); sesquiterpen lacton (vị đắng Actisơ cynaropicrin) Polyphenol acid caffeoylquinic (CQA) gồm acid mono-CQA, di-CQA flavonoid (cynarosid scolymosid) Trong đó, acid chlorogenic (5CQA) cynarosid (flavonoid) xem “marker” quan trọng Actisô Cynarin (1,3-diCQA) hợp chất tạo trình chiết xuất nhiệt độ cao nên có cao chiết 2.3 Tác dụng sinh học Dịch chiết từ Actisô thể số tác dụng có hiệu lâm sàng điều trị rối loạn tiêu hóa, hỗ trợ điều trị cao lipid huyết, cao huyết áp viêm gan nhiễm mỡ không rượu nhờ tác động chống oxy hóa, lợi mật hạ lipid hợp chất CQA flavonoid 2.4 Phân tích polyphenol Actisơ DĐVN V định lượng cynarin cao Actisô phương pháp UV-Vis Tuy nhiên phương pháp có độ chọn lọc khơng cao Actisơ có đồng phân khác có phổ UV Ngồi ra, DĐVN u cầu định tính cynarin Actisô, hợp chất chứng minh khơng có mà có cao chiết Actisô (do tạo chiết xuất nhiệt độ cao) Do đó, Dược điển Anh, Pháp, Ý, Châu Âu khơng có tiêu kiểm nghiệm cynarin Actisơ Chính vậy, tiêu chuẩn chất lượng cho “lá” “cao” Actisô DĐVN cần phải xây dựng lại tiêu phương pháp thử cho phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế 2.5 Quy trình chiết xuất polyphenol từ Actisô Eich cộng (2004) đăng ký sáng chế (US 2004/0234674 A1) phương pháp chiết xuất làm giàu thành phần CQA flavonoid từ Actisô sau: Lá Actisô (tươi khô) chiết xuất với nước với methanol, ethanol hỗn hợp dung môi với nước, cô thu hồi dung môi, rửa dịch chiết với dung môi hữu phân cực (alkan, alken, ete, este, dung mơi có chlor), tách loại bỏ phần dung mơi hữu Sau lắc phân bố với hỗn hợp 2butanol ethyl acetat, cô cắn thu cao chiết A Phần dịch chiết nước lại thu cao chiết B Cao chiết A giàu polyphenol cao chiết B, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol chống oxy hóa mạnh đáng kể so với cao khác Ngược lại, cao chiết B có hoạt tính chủ yếu chứng khó tiêu cao cao chiết tồn phần 2.6 Tổng quan dạng bào chế Cao khô Actisô số cao chiết từ dược liệu ứng dụng làm thuốc dược liệu với nhiều dạng bào chế khác dùng trị liệu bệnh liên quan gan mật Từ chế phẩm Chophytol (Rosa – Pháp) nhập vào Việt Nam, đến Việt Nam có khơng 20 loại sản phẩm chủ yếu viên nén chứa cao chiết từ Actisô Tuy nhiên, ngoại trừ doanh nghiệp uy tín, phần lớn sở sản xuất không đưa kèm tiêu sở; có tiêu đơn giản, thiếu tính khoa học cao chiết Actisơ gây khó khăn đánh giá chất lượng thành phẩm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Nguyên vật liệu: Lá, hoa, rễ, thân già giống Actisô (giống xanh tím) thu hái vườn phường 5, Đà Lạt từ 10/2014 đến 5/2017 Cao khô Actisô (BV Pharma) Các chế phẩm trà Actisô túi lọc mua thị trường nước 5/2017 Các chế phẩm từ cao chiết Actisô mua Việt Nam, Pháp, Mỹ, Đức (2/2020) 3.1.2 Hóa chất và dung mơi: Dung mơi đạt tiêu chuẩn phân tích gồm CHCl3, MeOH, EtOH, EtOAc, n-BuOH Dung môi dùng cho HPLC/UPLC gồm ACN (Scharlau), MeOH, acid formic (Merck), acid trifluoroacetic (Prolabo) Silica gel 60 C18 (40-63 µm) Chuẩn acid chlorogenic, cynarin cynarosid (Phytolab-Đức) Silymarin (Sigma, 31K1467) acid ascorbic (Sigma, A92902) DPPH (Sigma, STBD1145V) KCl 1,15 %; đệm phosphat 50 mM, pH=7,4 (KH2PO4, K2HPO4); trichloroacetic (TCA) 10 %; acid thiobarbituric (TBA) 0,8 % Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, chủng Swiss albino, trọng lượng 25 ± g, - tuần tuổi, cung cấp Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế - TP Nha Trang Chuột nuôi ổn định thực phẩm viên, rau xanh nước uống đầy đủ tuần trước thử nghiệm Chuột sinh lý mổ lấy gan dùng thử nghiệm MDA (malondialdehyd) (ex vivo) Bảng 2.2 Các tá dược dùng nghiên cứu bào chế Tá dược Cao khô Actisô* Microcrystallin cellulose Silicon Dioxid Natri Croscarmellose Magnesi carbonat Xuất xứ Cao nghiên cứu Trung Quốc Grace - Đức JRS Pharma - Ấn Độ Scora-Pháp Tá dược Glyceryl behenat Magnesi stearat Vivacoat Màu nâu (Brown) Xuất xứ Gattefossé - Pháp Trung Quốc JRS Pharma - Đức Fiorio colori - Ý *Cao nghiên cứu chứa 2,6 % cynarin 2,3 % acid chlorogenic ( TCCS) 3.1.3 Thiết bị dùng nghiên cứu Máy đông khô; MPLC; prep-HPLC; máy đo phổ NMR, MS; HPLC; UPLC; máy ly tâm; cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; µm); ThermoFisher C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm); máy đo phổ UV, máy đo pH, máy khuấy gia nhiệt, máy nghiền đồng thể, máy đọc ELISA Máy rửa dược liệu, nồi chiết xuất có áp lực 3.000 lít, thiết bị quay tuần hồn áp suất giảm (1.000 lít/giờ), máy sấy phun sương 50 lít/giờ Máy trộn chữ V 500 lít, dập viên 27 chày, bao phim 150 lít, đóng lọ, đo tỷ trọng, đo độ chảy, độ cứng; thử độ rã, độ mài mòn độ hòa tan Nơi nghiên cứu: Các môn (Dược liệu, Dược lý, Công nghiệp dược); Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc tự nhiên Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM: Khoa Thiết lập chất chuẩn chất đối chiếu Cơ sở chiết xuất dược liệu phường 5, Đà Lạt; Nhà máy BV Pharma-Củ Chi 3.2 Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu đề tài tóm tắt sau: Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 3.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học Chiết xuất: Phiến tươi (90 kg) rửa sạch, hấp 100 oC/ 10 phút, ngâm nóng với ethanol - nước (1:1), đến cao lỏng, lắc phân bố với chloroform (Cf), ethyl acetat (EA), n-butanol (Bu) thu 60 g cao Cf, 30 g cao EA 90 g cao Bu Phân lập: Bằng phương pháp sắc ký VLC, MPLC, sephadex LH-20, tinh chế semi-prep HPLC; pha tĩnh gồm silica gel 60 C18 (40-60 µm) Chiết xuất, phân lập chất đối chiếu (CĐC): Dựa vào quy trình phân lập chất để đưa phương pháp phù hợp ổn định để phân lập CĐC (≥ 500 mg), độ tinh khiết HPLC ≥ 95 % Xác định cấu trúc: Bằng phổ MS NMR, so sánh với tài liệu 3.2.2 Nghiên cứu phân tích kiểm nghiệm a Thiết lập chất đối chiếu (CĐC): Theo hướng dẫn tài liệu ASEAN ấn Định tính phổ UV, IR, MS, NMR Định lượng HPLC-PDA so với chuẩn sơ cấp (CSC) Đánh giá đồng lơ liên phịng thí nghiệm đạt GLP Giá trị ấn định công bố xác định theo hướng dẫn ISO 13528 b Xây dựng quy trình định lượng: Xây dựng quy trình định lượng tùy vào đối tượng nghiên cứu: - Lá khô Actisô: (1) Định lượng đồng thời polyphenol HPLC-PDA phục vụ cho tiêu chuẩn hóa dược liệu, nghiên cứu động thái tích lũy hoạt chất kiểm nghiệm chế phẩm trà túi lọc - Cao khơ Actisơ: (2) Định lượng đồng thời polyphenol HPLC-PDA phục vụ cho tiêu chuẩn hóa cao chiết, bán thành phẩm chế phẩm (3) Định lượng đồng thời 12 polyphenol UPLC-PDA nhằm so sánh TPHH cao chiết BPD (lá, gân, thân, rễ, hoa) chế phẩm từ cao Actisô thị trường ngồi nước Các bước xây dựng quy trình định lượng bao gồm: (a) Khảo sát điều kiện sắc ký (HPLC/UPLC); (b) Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử; 11 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 4.1.1 Chiết x́t Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất SKĐ phân tích cao EA Bu HPLC-PDA 330 nm Chú thích: Các đỉnh đánh số từ - 13 chất phân lập đề tài 4.1.2 Phân lập chất từ cao n-butanol (Bu) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Bu Chú thích: Các chất xác định cấu trúc phổ NMR 12 Hình 3.3 SKĐ phân tích phân đoạn cột MPLC cao Bu (MPLC-Bu) 4.1.3 Phân lập chất từ cao ethyl acetat (EA) Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao EA Chú thích: Các chất xác định cấu trúc phổ NMR 4.1.4 Phân lập chất đối chiếu (CĐC) Acid chlorogenic (AC), cynarin (CY) cynarosid (CR) thành phần có tác dụng sinh học chứng minh Actisô Do đó, chất lựa chọn làm nguyên liệu thiết lập CĐC Cao khô Actisô (Số lô CNC1.1 có hàm lượng CY 2,6 %; AC 2,3 13 %) nghiên cứu điều chế Mục 4.4 lựa chọn làm nguyên liệu chiết xuất phân lập chất CĐC Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất phân lập nguyên liệu CĐC Ghi chú: *n: Lặp lại n lần với điều kiện sắc ký (n=2, cột VLC thực 1-2 ngày; n=24, cột MPLC thực giờ; n=107, cột semi-prep.HPLC thực 15 phút) Các PĐ giàu CY AC, dùng phân lập tiếp hợp chất MPLC @ 4.1.3 Xác định cấu trúc Các chất phân lập xác định cấu trúc phổ MS NMR, kết có phù hợp với liệu công bố (Bảng 3.2) Bảng 3.1 Tổng kết hợp chất phân lập từ cao EA Bu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ký hiệu 10 11 12 13 18 19 20 17 15 Nhóm mono-CQA di-CQA Dẫn xuất acid benzoic Flavonoid KLa 12,36 13,43 49,9 49,4 21,7 9,49 83,5 85,2 63,3 74,4 43,1 48,6 13,2 6,2 245,4 750,1 16,7 2,4 Tên hợp chất c b 1-CQA 3-CQA b acid caffeic b, h acid chlorogenic b 4-CQA b 3-feruloylquinic b cynarin 3,4-diCQA b 3,5-diCQA b 1,5-diCQA b 4,5-diCQA b aldehyd protocatechuic b acid protocatechuic b 4-p-hydroxy benzaldehyd b scolymosid b, e cynarosid h luteolin h apigenin-7-rutinosid c KLPT CTPT 354,1 354,1 180,6 354,1 354,1 368,2 516,4 516,3 516,1 516,1 516,2 138,0 154,0 122,1 594,4 448,6 286,1 578,0 C16H18O9 C16H18O9 C9H8O4 C16H18O9 C16H18O9 C17H20O9 C25H24O12 C25H24O12 C25H24O12 C25H24O12 C25H24O12 C7H6O3 C7H6O4 C7H6O2 C27H30O15 C21H20O11 C15H10O6 C27H30O14 HPLC % 99,17 97,78 97,53 98,69 97,16 99,67 98,60 90,47 91,22 95,99 96,39 95,99 97,36 95,24 99,61 97,70 95,61 96,47 14 19 16 20 14 Sesquiterpen lacton Acid hữu 180,7 cynaratriol c 282,3 C15H22O5 -d 133,5 acid succinic 118,0 C4H6O4 97,21 : Khối lượng (mg); b: Hợp chất lần phân lập lồi Actisơ Việt Nam c : Các chất xác định phổ NMR d: Không kiểm tra HPLC phân cực nhạy với đầu dò PDA e: Trùng với chất phân lập năm 2011 nhóm nghiên cứu a 4.2 Nghiên cứu phương pháp kiểm nghiệm 4.2.1 Thiết lập chất đối chiếu (CĐC) Bảng 3.19-3.20 Kết thiết lập CĐC Đồng lô Đồng liên PTN Giá trị ấn định Chỉ tiêu đánh giá A chlorogenic Cynarin Cynarosid Tổng khối lượng (mg) Khối lượng đóng lọ (mg) Hàm lượng (so với CSC) (%)* (n lọ) 1000 10 92,18-92,74 (n = 20) 450 10 93,75-94,43 (n = 14) 2000 10 91,31-92,00 (n = 28) PTN (%) (n = 6) 92,19-92,68 93,66-94,69 91,23-91,91 PTN (%) (n = 6) 92,10-92,86 94,07-94,72 91,27-92,09 RSD % (n = 12) 0,28 0,31 0,32 92,39 (1,40) 94,26 (0,85) 91,53 (0,94) 0,22 0,088 0,21 0,086 0,24 0,097 Hàm lượng TB (%) (RSD) tính nguyên trạng * Độ lệch s Độ khơng đảm bảo đo µ CSC (chuẩn sơ cấp); PTN (phịng thí nghiệm); *Hàm lượng so với CSC (HPLC-PDA) PTN 1: Khoa Thiết lập chất chuẩn – chất đối chiếu, Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM PTN 2: Khoa Vật lý đo lường, Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM Xây dựng TCCS cho CĐC gồm: Cảm quan, độ tan, độ ẩm, định tính (phổ UV, IR, MS, NMR), hàm lượng % HPLC-PDA 4.2.2 Xây dựng quy trình định lượng a Khảo sát điều kiện sắc ký: ĐL1: Định lượng polyphenol Actisô ĐL2: Định lượng polyphenol cao Actisô 15 ĐL3: Định lượng 12 polyphenol cao Actisô CQA (caffeoylquinic acid); CF (acid caffeic); AC (acid chlorogenic); CY (cynarin); CR (cynarosid); SCO (scolymosid) Hình 3.12-3.15-3.18 Sắc ký đồ quy trình định lượng polyphenol cao Actisô ĐL 1: Cột Sunfire C18 (250 ì 4,6 mm; àm) Pha ng: ACN (A ) - FA 0,1% (B) Chương trình: 8-20% A (15p); 20-25% A (3p); 25-30% A (5p); 30% A (2p); 30-95% A (1p); 95% A (5p) Tốc độ ml/phút, tiêm 10 µl Phát hiện: 325 nm (AC) 349 nm (SCO CR) ĐL 2: Cột Sunfire C18 (250 ì 4,6 mm; àm) Pha ng: ACN (A ) - FA 0,1% (B) Chương trình: 8-15% A (20p); 15% A (1p); 15-30% A (9p); 30% A (5p); 30-95% A (1p); 95% A (5p) Tốc độ ml/phút, tiêm 10 µl Phát hiện: 325 nm (AC CY) 349 nm (SCO CR) ĐL 3: Cột ThermoFisher C18 (100 ì 2,1 mm; 2,6 àm) Pha ng: ACN (A ) - TFA 0,1% (B) Chương trình: 0-3% A (20p); 3% A (2p); 3-10% A (3p); 10% A (2p); 10-12% A (2,5p); 12% A (2,5p); 12-15% A (2p); 15% A (4p); 15-90% A (4p); 90% A (3p) Tốc độ 0,8 ml/phút, tiêm µl Phát hiện: 325 nm (mono diCQA) 349 nm (SCO CR) b Kết khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu thử: Lá khô (0,1 g lá, 15 ml EtOH 50 %, 70 oC, siêu âm 20 phút, vđ 25 ml) Cao khô (20 mg cao, ml MeOH 40 %, 50 oC, siêu âm 10 phút, lần tương tự, vđ ml) c Kết đánh giá quy trình định lượng theo ICH: Cả quy trình đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu Khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ xác độ tóm tắt sau Bảng 3.27-3.29 3.32-3.34 3.38-3.40 Kết đánh giá theo ICH Định lượng QT1 QT2 QT3 Khoảng tuyến tính (µg/ml) LOD a, LOQ b (µg/ml) - 200 (R > 0,998) – 300 (R2 > 0,999) - 500 (R2 > 0,999) 0,025 - 0,060 0,083 - 0,198 a 0,031 - 0,125 b 0,103 - 0,417 a 0,05 - 0,125 b 0,165 - 0,412 Độ xác (%RSD) Trong ngày Trung gian a b 0,90 - 1,20 1,10 - 1,20 1,45 - 1,88 1,73 - 2,26 0,62 - 1,16 0,91 - 2,01 Độ (%) (%RSD) 96,28 - 103,47 (1,3 - 3,7) 93,02 - 103,97 (0,78 - 3,72) 90,02 - 106,11 (0,51 - 2,78) QT1: Định lượng AC, SCO, CR Actisô; QT2: Định lượng CY, AC, SCO, CR cao khô Actisô; QT3: Định lượng 12 polyphenol cao khô Actisô 16 4.2.3 Nghiên cứu động thái tích lũy a So sánh thành phần hoạt chất cao chiết giống Actisơ: Hình 3.20 Biểu đồ so sánh hàm lượng polyphenol cao chiết giống Actisô Đà Lạt Ghi chú: Các cột có kí tự khác khác biệt có ý nghĩa thống kê (p 1,5-diCQA = cynarin = scolymosid > 4-CQA > acid chlorogenic > vitamin C > 3-CQA > 1-CQA > silymarin - Thử nghiệm MDA: Cynarin > 1,5-diCQA > 4,5-diCQA > cynarosid > scolymosid > acid chlorogenic > 4-CQA > 3-CQA > silymarin > 1-CQA 4.3.2 HTCO của cao chiết Hình 3.5 Biểu đồ so sánh IC50 (μg/ml, n=3) cao chiết Actisô (giống xanh tím) - Cao chiết nước: LT – tươi; LK – khô; T – thân; G – gân; R – rễ; H – hoa - Cao chiết cồn: Chữ đầu kí hiệu BPD tương tự cao chiết nước Kí hiệu sau dung mơi chiết xuất (EtOH 40 96 %) - Biểu đồ xếp theo IC50 tăng dần (HTCO giảm dần) - Sự khác biệt mẫu có ý nghĩa thống kê (Tukey, p