Bài Thí Nghiệm Số 1 Xác Định Hoạt Độ Alpha Amylase Theo Phương Pháp Wohlgemuth.pdf

BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ STT THÀNH VIÊN Đặng Thị Phương Trinh Phan Nguyễn Ngọc Vi MSSV 21116261 21116272 Nguyễn Thị Tường Vy Phan Thị Kiều Xuân 21116277 21116283 NHIỆM VỤ Báo cáo + Tổng hợp báo cáo Báo cáo +Word 4+ Excel Báo cáo + Word + Excel Báo cáo TỶ LỆ HOÀN THÀNH 100% 100% 100% 100% MỤC LỤC BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH 1 Tổng quan 1 Giới thiệu enzyme 1.2 Cơ chế xúc tác – phản ứng 1.3 Mục tiêu thí nghiệm 1.4 Phương pháp thí nghiệm 2 Quy trình tiến hành 2.1 Nguyên liệu – Dụng cụ 2.2 Pha hóa chất 2.3 Cách tiến hành 3 Kết : 3.1 Kết thí nghiệm 3.2 Công thức tính: 10 3.3 Xử lý số liệu 11 Bàn luận 12 4.1 Bàn luận kết 12 4.2 Các nguyên nhân gây ảnh hưởng kết 15 4.3 Phương pháp giảm thiểu sai số 16 Kết luận 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 2: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ LIPASE 19 Mục tiêu nguyên tắc thí nghiệm 19 1.1 Mục tiêu thí nghiệm 19 1.2 Giới thiệu enzyme lipase 19 1.3 Nguyên tắc chung 20 Chuẩn bị thí nghiệm 20 2.1 Dụng cụ 20 2.2 Thiết bị 20 2.2 Hóa chất 21 Cách tiến hành thí nghiệm 21 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.1 Cách tiến hành thí nghiệm 21 3.2 Giải thích quy trình 22 3.3 Những lưu ý thực thí nghiệm 23 Kết thí nghiệm 24 Tính tốn kết 24 Bàn luận kết 25 6.1 Bàn luận kết 25 6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết 26 6.3 Biện pháp khắc phục 26 Kết luận 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 BÁO CÁO THÍ NGHIỆM BÀI 3: KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ 28 INVERTASE 28 Tổng quan invertase 28 1.1 Mục đích thí nghiệm 29 1.2 Nguyên tắc 30 Dụng cụ hóa chất 30 2.1 Dụng cụ 30 2.2 Hóa chất 31 Cách tiến hành 31 3.1 Điều chế dung dịch invertase 31 3.2 Sơ đồ quy trình 33 Kết thí nghiệm 37 4.1 Kết thí nghiệm xác định hoạt độ invertase từ men bánh mì thể bảng sau 37 4.2 Tính tốn kết 38 Bàn luận 40 5.1 Nhận xét 40 5.2 Các yếu tố dẫn đến sai số q trình tiến hành thí nghiệm 41 5.3 Giảm thiểu sai số 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 4: KHẢO SÁT ĐỘNG HỌC VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME UREASE 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Tổng quan: 43 1.1 Giới thiệu enzyme 43 1.2 Cơ chế xúc tác – phản ứng 43 1.3 Mục đích thí nghiệm 44 Dụng cụ hoá chất: 44 2.1 Dụng cụ: 44 2.2 Pha hóa chất 44 Cách tiến hành 45 3.1 Chuẩn bị dịch chiết urease: 45 3.2 Tiến hành khảo sát động học 45 3.3 Tiến hành khảo sát hoạt độ 47 Kết quả: 49 4.1 Khảo sát động học 49 4.2 Xác định hoạt độ: 55 Bàn luận 56 5.1 Vai trị hố chất: 56 5.2 Khảo sát động học: 57 5.3 Xác định hoạt độ: 58 5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả: 59 5.5 Biện pháp khắc phục 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH Hình 1 Kết thí nghiệm khảo sát enzyme α-amylase với dung dịch NaCl 0,5% 30 phút Hình So màu ống nghiệm 11 Hình Kết thí nghiệm khảo sát enzyme α-amylase với dung dịch NaCl 1% 30 phút Hình So màu ống nghiệm 11 10 Hình Phản ứng thuỷ phân lipid thành acid béo xúc tác lipase 20 Hình 2 Sơ đị khối cách tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt độ lipase 22 Hình Cơ chế hoạt động enzyme invertase 28 Hình Enzyme invertase 29 Hình 3 Sơ đồ khối chiết dịch invertase từ men bánh mì 32 Hình Dịch chiết invertase suốt thu sau lần lọc 33 Hình Sơ đồ cách tiến hành khảo sát hoạt độ invertase 34 Hình Bình tam giác sau cho 5ml iodine vào 36 Hình Bình tam giác sau cho 7,5ml NaOH 0,1N 36 Hình Hình ảnh trước chuẩn dộ (bên trái) sau chuẩn độ (bên phải) 38 Hình Sơ đồ tiến hành khảo sát động học 46 Hình Sơ đồ khảo sát hoạt độ 48 Hình Khảo sát động học enzyme urease điều kiện nhiệt độ 300C 49 Hình 4 Biểu đồ biểu diễn biến thiên 1/V theo 1/[S] 300C 51 Hình Dung dịch 400C sau chuẩn độ 52 Hình Biểu diễn biến thiên 1/V theo 1/[S] 400C 54 Hình Biểu đồ biểu diễn lượng chất bị thủy phân theo nồng độ chất ban đầu mốc nhiệt độ 55 Hình Dung dịch sau chuẩn độ 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Màu ống nghiệm khảo sát enzyme α-amylase với dung dịch NaCl 0,5% 30 phút Bảng Màu ống nghiệm khảo sát enzyme α-amylase với dung dịch NaCl 1% 30 phút 10 Bảng Chỉ số pH trước chuẩn độ 24 Bảng 2 Thể tích NaOH dùng để chuẩn độ pH sau chuẩn độ 24 Bảng Chuẩn bị dãy ống nghiệm khảo sát hoạt độ invertase 33 Bảng Kết qủa thí nghiệm xác định hoạt độ invertase 37 Bảng 3 Số liệu tính tốn kết 39 Bảng Khảo sát động học enzyme urease điều kiện nhiệt độ 300C 50 Bảng Kết khảo sát động học 300C 50 Bảng Khảo sát động học ezyme urease điều kiện 400C 52 Bảng 4 Kết khảo sát động học 400C 53 Bảng Kết thu sau chuẩn độ 56 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an BÀI THÍ NGHIỆM SỐ 1: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ALPHA AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH Tổng quan 1 Giới thiệu enzyme Alpha-amylase (α-amylase) enzym (EC 3.2.1.1) thủy phân liên kết alpha polysaccharid lớn, chẳng hạn tinh bột glycogen, tạo chuỗi ngắn chúng, dextrin maltose [1] Đây dạng amylase tìm thấy người động vật có vú khác Nó có hạt giống mà sử dụng tinh bột dạng lượng dự trữ, chất tiết nhiều lồi nấm α-amylase có nhiều loại hạt nói chung đại mạch nói riêng Trong sinh lý người, tìm thấy nhiều mơ, amylase chủ yếu có dịch tụy nước bọt αamylase có nhiều loại hạt nói chung đại mạch nói riêng.[2] Mức độ α-amylase hạt lúa mì lúa mạch mạch nha lúa mạch thông số chất lượng quan trọng Mức độ cao enzyme lúa mì lúa mạch sử dụng dấu hiệu cho thấy nảy mầm trước thu hoạch [3] Trong đại mạch, cần có hàm lượng α-amylase cao để xúc tác q trình hịa tan khử tinh bột q trình nghiền sản xuất bia Amylases nói chung α-amylase nói riêng có vai trị quan trọng cơng nghiệp, công nghiệp thực phẩm Chúng sử dụng nhiều ngành công nghiệp sản xuất bia rượu, mạch nha bánh mì 1.2 Cơ chế xúc tác – phản ứng Enzyme có tác dụng xúc tác q trình thủy phân tinh bột có hạt thành đoạn dextrin ngắn, cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho việc nảy mầm Sự thủy phân tinh bột α-amylase tóm lược thơng qua phương trình phản ứng sau: Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Điều kiện hoạt động tối ưu cho α-amylase pH từ 4,2 đến 5,7; anion chất hoạt hóa gồm: Chloride bromide (hiệu nhất), iodine (ít hiệu hơn), sulfate phosphate (kém hiệu nhất) Vì thí nghiệm sử dụng NaCl làm chất hoạt hóa cho thí nghiệm.[4] 1.3 Mục tiêu thí nghiệm Biết cách tính tốn khối lượng, thể tích pha chế hóa chất thí nghiệm Xác định hoạt độ α-amylase theo phương pháp Wohlgemuth để biết nồng độ enzyme thấp để thủy phân tinh bột thành dextrin Tìm hiểu thêm số ứng dụng enzyme đời sống thực tiễn 1.4 Phương pháp thí nghiệm Phương pháp Wohlgemuth dựa vào nguyên tắc tìm nồng độ enzyme thấp để thủy phân tinh bột thành dextrin Đơn vị Wohlgemuth lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút 37°C có Cl- làm chất hoạt hóa Dùng Iodine 0,3% để kiểm tra có mặt tinh bột, mẫu thí nghiệm cịn xuất phức chất màu tím xanh chứng tỏ enzyme alpha-amylase chưa thủy phân hết lượng tinh bột có mẫu.[5] Quy trình tiến hành 2.1 Nguyên liệu – Dụng cụ - 11 ống nghiệm - Pipet 1mL (4 cái) - Tủ ấm - Dung dịch NaCl 0,5% - Dung dịch hồ tinh bột 0,5% - Iodine 0,3% KI 3% Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 10% Formol trung tính: pha 380m formol trung tính với 1,8ml NaOH 0,2N thu dược formol trung tính Phenolphthalein 1%: cân 0.5g phenolphthalein pha với 25ml ethanol 25 ml nước cất Phenolphthalein 0,5%: Pha 5ml phenolphthalein với 5ml ethanol 5ml nước Ure 2%: cân 3g ure pha với 150ml nước cất Ure 1/3M: cân 2g ure pha với 100ml nước cất NaOH 0,2N: pha 0,32g NaOH với 40ml nước cất NaOH 0,05N: pha 1,4g NaOH với 700ml nước cất Cách tiến hành 3.1 Chuẩn bị dịch chiết urease: Lần 1: Cân 18g đậu nành, cho vào beaker 500ml, dùng bình định mức định mức 450ml nước cất cho vào beaker, trộn 15 phút Chuyển dung dịch vào ống ly tâm, cân ống ly tâm cho ống nhau, chuyển vào máy ly tâm, ly tâm 5000 vòng 15 phút Sau lọc dung dịch qua giấy lọc lần Ta thu 292ml dịch chiết urease Lần 2: Cân 12g đậu nành, cho vào beaker 100ml, dùng bình định mức, định mức 300ml nước cất cho vào beaker, trộn 15 phút làm tương tự Ta thu 200ml dịch chiết 3.2 Tiến hành khảo sát động học 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Ure 1/3M Dd urease Nước cất Ure 1/3M Dd Cho vào urease dãy ống nghiệm Nước cất Cho vào dãy ống nghiệm Cho vào bể ổn nhiệt 40oC, 20 phút Cho vào tủ ấm 30oC, 20 phút Cho vào tủ ấm 30oC, 20 phút Cho vào bể ổn nhiệt 40oC, 20 phút Lấy lắc phút Lấy lắc phút Chuyển ống nghiệm sang erlen 100ml giọt phenolphthalein 1% Chuyển ống nghiệm Định phântừng với NaOH 0,05N sang erlen 100ml Định phân với NaOH 0,05N giọt phenolphthalein 1% Tính tốn kết Hình Sơ đồ tiến hành khảo sát động học Tính tốn kết • Giải thích quy trình: Chuẩn bị dãy ống nghiệm, dãy ống nghiệm Ở dãy cho 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an dung dịch vào bảng sau: Ống nghiệm Ure 1/3 M (ml) Nước cất (ml) Dung dịch urease (ml) 5 5 5 Đặt dãy thứ vào bể ổn nhiệt 40oC, dãy thứ đặt vào bể 30oC xác 20 phút Sauk hi kết thúc thời gian thủy phân thêm vào ống nghiệm 5ml formol trung tính, lắc phút Chuyển ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với nước cất Thêm giọt phenolphthalein 1% định phân với NaOH 0,05N Lặp lại thí nghiệm lần 3.3 Tiến hành khảo sát hoạt độ 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Ure 1/3M Ure 1/3M Dd urease dun cách thủy Dd urease Dd urease Dd dun cách urease Cho vào dãy ống nghiệm thủy Nước cất Nước cất Cho vào dãy ống nghiệm Cho vào bể ổn nhiệt 40oC, 20 phút Cho vào bể ổn nhiệt 40oC, 20 Lấy lắc phúttrong phút Lấy lắc phút Chuyển ống nghiệm sang erlen 100ml giọt phenolphthalein 1% Chuyển ống nghiệm Định phântừng với NaOH 0,05N sang erlen 100ml Định phân với NaOH 0,05N Tính tốn kết Hình Sơ đồ khảo sát hoạt độ Tính tốn kết 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn giọt phenolphthalein 1% C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an • Giải thích quy trình Thực ống nghiệm sau: Ống nghiệm Ure 2% (ml) 5 Nước cất (ml) 0 Dung dịch urease (ml) 5 Dung dịch urease đun cách thủy (ml) 0 Mang tất ống nghiệm đặt 40oC Sau 20 phút cho vào ống nghiệm 5ml formol trung tính, lắc phút Đổ ống erlen 100ml Định phân NaOH 0,05N với phenolphthalein 1% làm thị Lặp lại thí nghiệm lần Kết quả: 4.1 Khảo sát động học Hình Khảo sát động học enzyme urease điều kiện nhiệt độ 300C Ống nghiệm 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an V1(mL) 0.7 1.05 1.1 1.2 1.25 1.35 V2(mL) 0.65 1.1 1.15 1.3 1.4 V3(mL) 0.65 1.15 1.2 1.3 1.35 1.4 0.67 1.067 1.13 1.22 1.3 1.383 Trung bình Bảng Khảo sát động học enzyme urease điều kiện nhiệt độ 300C Ống nghiệm VNaOH 0.67 1.067 1.3 1.13 1.22 1.383 0.0000267 0.000028 0.000031 0.000032 0.000035 0.0333333 0.066667 0.1 0.166667 Số mol ure bị thủy phân [Y] Nồng độ ure ban đầu [S] Vận tốc thủy 0.133333 0.00000133 0.0000014 0.0000015 0.0000016 0.0000017 phân Bảng Kết khảo sát động học 300C Ta có: 𝑛𝑁𝑎𝑂𝐻 = 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 ×0,05×10−3 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Vì 𝑛𝐻2 𝐶𝑂3 = 𝑛𝑁𝑎𝑂𝐻 theo phương trình phản ứng H2CO3 + 2NaOH → Na2CO3 + 2H2O - Động học phản ứng enzyme biểu diễn tính tốn dựa vào đồ thị Lineweaver-Burk Trong đó: Vmax: vận tốc thủy phân cực đại (M/phút) [S]: nồng độ chất (M) Km: số Machaelis-Menten Đặt y = /𝑉 , x= 1/ [S] từ ta có phương trình: y = ax+b Hình 4 Biểu đồ biểu diễn biến thiên 1/V theo 1/[S] 300C Dựa vào đồ thị ta có y= 6445x + 573126 b= a= 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑘𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 573126 => 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 573126 = 1,75× 10−6 (M/phút) = 6445 => 𝑘𝑚 =6445×1.75× 10−6 =0,0112 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình Dung dịch 400C sau chuẩn độ Ống nghiệm V1(mL) 0.85 2.4 3.1 3.25 3.05 3.1 V2(mL) 0.7 2.3 3.05 3.25 3.05 V3(mL) 0.8 2.2 3.23 3.25 3.1 3.2 0.78 2.3 3.05 3.25 3.05 3.18 Trung bình Bảng Khảo sát động học ezyme urease điều kiện 400C Bảng 4.4 Kết khảo sát động học 400C Ống nghiệm VNaOH 0.78 2.3 3.05 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 3.25 3.05 3.18 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Số mol ure bị thủy 0.0000575 0.000076 0.000081 0.000076 0.000077 0.0333333 0.066667 0.1 phân [Y] Nồng độ ure ban đầu 0.133333 0.166667 [S] Vận 0.00000288 0.000003 0.000004 0.000003 0.000003 8 tốc thủy phân Bảng 4 Kết khảo sát động học 400C Ta có: nNaOH = (VNaOH x 0.05 x 10-3)/2 nH2CO3 = nNaOH/2 theo phương trình phản ứng H2CO3 + 2NaOH → Na2CO3 + 2H2O - Động học phản ứng enzyme biểu diễn tính tốn dựa vào đồ thị Lineweaver-Burk Trong đó: Vmax: vận tốc thủy phân cực đại (M/phút) [S]: nồng độ chất (M) Km: số Machaelis-Menten 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 1 𝑉 [S] Đặt y = , x= từ ta có phương trình: y = ax+b Hình Biểu diễn biến thiên 1/V theo 1/[S] 400C 1/[S](1/M) 1/V (1/mol/phút) - 30 15 10 7,5 347826,08 262295,08 246153,846 262295,08 256684,49 2 2 Dựa vào đồ thị ta có y= 3952,2x + 220906 b= a= 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑘𝑚 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 220906 => 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 220906 = 4,527× 10−6 (M/phút) = 3952,2 => 𝑘𝑚 =3952,2×4,527× 10−6 =0,01789 54 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình Biểu đồ biểu diễn lượng chất bị thủy phân theo nồng độ chất ban đầu mốc nhiệt độ 4.2 Xác định hoạt độ: Hình Dung dịch sau chuẩn độ 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Số mL NaOH để chuẩn độ H2CO3 STT Lần Lần Lần 0.75 0.7 0.75 1.8 1.85 0.8 0.75 0.75 0.8 Bảng Kết thu sau chuẩn độ Hoạt độ urease thông qua số mol ure bị thủy phân lượng enzyme urease có 1g bột đậu nành thời gian phút 40 độ C tính theo cơng thức: (𝑉2 −𝑉1 ).A.k 20×103 ×2×𝑡×𝑎×𝑚 Trong đó: 𝑉1 , 𝑉2 : số mol NaOH 0.05N dùng định phân dung dịch ống nghiệm a: thể tích enzyme cho vào ống nghiệm A: tổng thể tích enzyme có từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút) m: khối lượng mẫu cân (g) k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.05N 𝑉1 0.73333333 𝑉2 1.816666667 A a k t m 492 20 30 Áp dụng cơng thức ta tính hoạt độ urease X= (1,816666667−0,73333333).492×1 20×103 ×2×20×5×30 =4,4416 × 10−6 (mL/g.phút) Bàn luận 5.1 Vai trị hố chất: 56 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Dung dịch NaOH 0,2N: dùng để pha dung dịch formal trung tính Dung dịch NaOH 0,05: dùng để làm chất chuẩn, định phân lượng acid sinh Dung dịch formol trung tính: thêm vào mơi trường để giải phóng acid carbonic Phenolphthalein 1%: đóng vai trò chất thị để nhận biết lượng NaOH 0,05N dư Ure 2%, ure 1/3M: đóng vai trị chất 5.2 Khảo sát động học: Dựa vào hai bảng kết 30 40 độ C, lượng ure bị thủy phân enzyme urease điều kiện 30 độ C lượng urea bị thủy phân enzyme urease điều kiện 40 độ C tăng cao không nhiều Tốc độ thủy phân cực đại enzyme urease 40 độ C lớn so với nhiệt độ 30 độ C Khi chuẩn độ với dung dịch NaOH thị Phenolphtalein 1%, màu dung dịch từ không màu chuyển sang màu hồng chất phản ứng acid tác dụng với bazo phenolphatalein làm chất thị Ta thấy 𝑘𝑚 nhiệt độ 300C lớn Km nhiệt độ 400C, lực giữ enzyme chất điều kiện 300C thấp 400C ( 𝑘𝑚 đặc trưng cho lực enzyme với chất, 𝑘𝑚 có trị số nhỏ lực enzyme với chất lơn, nghĩa vận tốc phản ứng enzyme xúc tác lớn) Phản ứng xúc tác enzyme giống phản ứng hóa học khác nghĩa nhiệt độ tăng tốc độ phần ứng tăng theo Tuy nhiên, enzyme có chất protein nên bị biến tính nhiệt độ vượt giới hạn Vì vậy, enzyme có nhiệt độ khoảng nhiệt độ mà đó, lực xúc tác cao Người ta gọi nhiệt độ tối thích cho 57 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an enzyme hoạt động Theo phương trình động học Michaelist-Mentene ta thấy Km tỉ lệ nghịch với với vận tốc Theo kết tính tốn cho thấy Km 300C lớn Km 400C vận tốc thủy phân chất nồng độ chất 40 0C hoạt động tối ưu hoạt động tốt so với nhiệt độ 300C Tốc độ thủy phân cực đại Vmax nhiệt độ 40OC nhanh so với 300C cho thấy enzyme urease có động lực thủy phân tốt nồng độ chất Khi nồng độ chất đủ lớn, tất các phân tử enzyme tham gia tạo phức ES, tốc độ enzyme thủy phân đạt cực đại 𝑉0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 NaOH dùng để chuẩn độ nhiệt độ 40°C cao so với nhiệt độ 30°C vì: Nhiệt độ tối ưu urease 45-50°C nên gần nhiệt độ tối ưu enzyme urease thủy phân ure tốt để tạo NH CO2 nên lượng H2CO3 tạo nhiều lượng NaOH dùng nhiều Trong thí nghiệm ta cần phải điều chế formol trung tính formol dư tác dụng với NaOH chuẩn độ làm sai lệch kết không làm bất hoạt enzyme làm lượng chất bị thủy phân nhiều dẫn đến kết không đáng tin cậy Từ kết cho thấy urease hoạt động tốt khoảng nhiệt độ 40 0C, phù hợp với điều kiện tối ưu enzyme urease đề cập phần tổng quan enzyme 5.3 Xác định hoạt độ: Ống nghiệm 1: bao gồm nước cất dung dịch urease, theo nguyên tắc cần đến giọt NaOH đủ để xuất màu hồng, làm thí nghiệm ta cần nhiều lượng NaOH Nguyên nhân enzyme urease sử dụng lấy trực tiếp từ đậu nành, tồn lượng acid tự nên lượng NaOH sử dụng cần nhiều để trung hòa lượng acid tự Ống nghiệm 2: Lượng NaOH cần để chuẩn độ lượng H 2CO3 tạo thành nhiều 58 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn