(Luận văn) nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don) phục vụ chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH lu an n va p ie gh tn to NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN d oa nl w u nf va an lu LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH lu NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN an n va gh tn to p ie Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.01.21 d oa nl w an lu ll u nf va LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC oi m z at nh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM z m co l gm @ an Lu THÁI NGUYÊN - 2015 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả lu an Trần Thị Anh n va Người hướng dẫn khoa học p ie gh tn to Xác nhận khoa chuyên môn d oa nl w ll u nf va an lu PGS.TS Nguyễn Thị Tâm oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ nhiều cá nhân quan đơn vị Nay luận văn hồn thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Trong q trình nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phịng Cơng nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại lu học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ an n va q báu tn to Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền Sinh học gh đại, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện p ie thuận lợi để thực trình nghiên cứu w Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, thầy giáo, oa nl cán khoa, thầy cô giáo thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học sư d phạm - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ lu va an tơi q trình học tập thực luận văn u nf Cuối xin chân thành cảm ơn người thân gia đình ll bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập oi m z at nh Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả z gm @ m co l Trần Thị Anh an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi lu MỞ ĐẦU an Đặt vấn đề va n Mục tiêu nghiên cứu tn to Nội dung nghiên cứu ie gh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU p 1.1 Giới thiệu chung dừa cạn nl w 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại d oa 1.1.2 Đặc điểm hình thái dừa cạn an lu 1.1.3 Phân bố sinh thái va 1.1.4 Kỹ thuật trồng dừa cạn ll u nf 1.1.5 Ứng dụng dừa cạn y học oi m 1.2 Nhân giống in vitro công nghệ tế bào thực vật z at nh 1.2.1 Ưu phương thức nhân giống in vitro 1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 13 z 1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng nuôi cấy mô thực vật 14 @ gm 1.3.1 Auxin 14 m co l 1.3.2 Cytokinin 16 1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn kĩ thuật nuôi cấy in vitro 17 an Lu 1.4.1 Tình hình ni cấy in vitro dừa cạn giới 17 n va ac th iii si 1.4.2 Tình hình ni cấy in vitro dừa cạn Việt Nam 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hoá chất 22 2.1.1 Vật liệu thực vật 22 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Pha môi trường 22 2.2.2 Khử trùng hạt 23 lu 2.2.3 Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi sinh trưởng 23 an 2.2.4 Phương pháp gây tổn thương tạo chồi 24 va n 2.2.5 Nghiên cứu môi trường tạo rễ 24 tn to 2.2.6 Nghiên cứu giá thể đưa tự nhiên 25 ie gh 2.2.7 Xử lí tính tốn số liệu 26 p 2.3 Điều kiện thí nghiệm 26 nl w Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 d oa 3.1 Kết khử trùng hạt 27 an lu 3.2 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến va phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách ll u nf mầm 29 oi m 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng z at nh chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng z chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 32 @ gm 3.2.3 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi m co l từ nách mầm 34 an Lu n va ac th si 3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA, BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách mầm dừa cạn 36 3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 37 3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 39 3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi dừa từ nách mầm 41 lu 3.4 Kết tạo đa chồi phương pháp gây tổn thương 44 an 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả va n rễ chồi dừa cạn ống nghiệm 46 tn to 3.5.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi dừa cạn ie gh môi trường MS 46 p 3.5.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi nl w trường MS 47 d oa 3.5.3 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn mơi an lu trường ½ MS 50 va 3.6 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng ll u nf vườn ươm 51 oi m KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 z at nh TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT lu an n va : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng CT : Công thức ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleic acid HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid : Tổ chức y tế giới ie gh tn to 2,4-D p WHO d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va iv ac th si DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt (sau 10 ngày) 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 35 lu Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA đến phát sinh chồi an sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 38 va n Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA đến phát sinh chồi tn to sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40 ie gh Bảng 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA đến phát sinh chồi p sinh trưởng chồi từ nách mầm 42 nl w Bảng 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương 44 d oa Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ 47 an lu Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ 48 va Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ dừa cạn ll u nf (sau tuần) 50 oi m Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng z at nh dừa cạn (sau 45 ngày) 51 z m co l gm @ an Lu n va v ac th si DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây dừa cạn Hình 1.2 Hoa ba giống Catharanthus roseus Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt dừa cạn 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 34 lu Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP 0,5 mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng an chồi từ nách mầm 36 va n Hình 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA 0,4mg/l đến phát tn to sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ie gh (sau tuần) 39 p Hình 3.6 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l đến phát nl w sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40 d oa Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l an lu đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 43 va Hình 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương 45 ll u nf Hình 3.9 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau tuần) 47 oi m Hình 3.10 Rễ dừa cạn mơi trường bổ sung IBA 0,2mg/l z at nh môi trường MS (sau tuần) 49 Hình 3.11 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l z môi trường ½ MS (sau tuần) 51 @ gm Hình 3.12 Ảnh hưởng giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát m co l đến sinh trưởng dừa cạn 52 an Lu n va vi ac th si 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100ml/l Chúng lựa chọn công thức tạo để tạo chồi phục vụ trình chuyển gen từ nách mầm lu an n va p ie gh tn to B tuần d oa nl w A tuần ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ C 10 tuần Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l an Lu đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm n va ac th 43 si 3.4 Kết tạo đa chồi phương pháp gây tổn thương Dùng thân dừa cạn bánh tẻ, nuôi cấy in vitro - 10 tuần tuổi, cắt thành đoạn có kích thước 1,0 - 1,5cm mang mắt chồi bên Gây tổn thương ví trí mắt chồi bên cách: (1) dùng dao chẻ dọc qua mắt chồi bên (khơng làm đứt hồn tồn mơ); (2) dùng đầu mũi châm vào mắt tạo chồi bên Sau đó, ngâm mô gây tổn thương dung dịch MS bổ sung kích thích sinh trưởng nồng độ tối ưu BAP 1,0mg/l, IBA 0,6mg/l 20 phút Sau ngâm 20 phút, nuôi mô lên môi trường đặc BAP 1,0mg/l + IBA 0,6mg/l + MS + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 100 ml/l, để mẫu tối lu ngày Sau ngày, cấy mẫu lên mơi trường tạo chồi tối ưu tìm Kết an tạo chồi mô gây tổn thương thể cụ thể bảng 3.8 va n Bảng 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương Tỉ lệ mô sống % p ie gh tn to Phương pháp gây tổn thương Số chồi/mẫu Số lá/chồi Chất lượng chồi Sau tuần 92,3 ± 0,32 9,13 ± 0,26 1,72 ± 0,21 3,83 ± 0,15 CT (1) 47,3 ± 0,28 9,21 ± 0,37 1,57 ± 0,04 4,22 ± 0,13 CT (2) 56,6 ± 0,33 9,34 ± 0,49 1,54 ± 0,11 4,13 ± 0,11 CT 3,15 ± 0,16 6,78 ± 0,19 CT d oa nl w (0) Chiều cao chồi (cm) u nf va an lu Sau 10 tuần 92,3 ± 0,32 10,2 ± 0,36 (1) 47,3 ± 0,28 11,21 ± 0,37 2,97 ± 0,04 6,32 ± 0,13 CT (2) 56,6 ± 0,33 11,34 ± 0,49 2,89 ± 0,11 6,13 ± 0,11 CT ll (0) oi m z at nh z Ghi chú: (0): không gây tổn thương; (1) Chẻ dọc thân qua mắt chồi bên; @ l gm (2) dùng đầu mũi dao chích vào mắt tạo chồi bên; CT: Chồi tốt m co Qua bảng 3.8 cho thấy, số chồi/mẫu mô sau gây tổn thương tăng lên Sau gây tổn thương tỉ lệ mơ sống giảm so với đối chứng Mẫu khơng an Lu gây tổn thương có số mô sống tạo chồi 92,3% Gây tổn thương cách chẻ n va ac th 44 si dọc đoạn thân qua mắt chồi bên tỉ lệ mơ sống tạo chồi đạt 47,3% Nếu gây tổn thương cách châm mũi dao vào mắt tạo chồi bên tỉ lệ mô sống đạt 56,6% Tỉ lệ mô sống tạo tạo cách khác số chồi/mẫu tương đương Nuôi cấy tuần đầu mơi trường khơng có than hoạt tính Tiếp theo, chuyển cụm chồi sang mơi trường có than hoạt tính, quan sát thấy chồi sinh trưởng tốt Kích thước chồi sau 10 tuần nuôi cấy in vitro đạt trung bình xấp xỉ 2,9cm Qua quan sát thực nghiệm chúng tơi nhận thấy, khơng có sai khác số lượng kích thước chồi cách gây tổn thương, chồi lu xanh phát triển tốt an Qua thí nghiệm gây tổn thương trên, chọn để phục vụ chuyển gen có va n thể sử dụng cách Cách gây tổn thương chẻ dọc qua đoạn thân tỉ lệ mô tn to sống thấp hiệu xâm nhập vi khuẩn tốt Gây tổn ie gh thương cách châm mũi dao vào mắt chồi bên vết thương mô p khơng sâu chẻ dọc đoạn thân kích thước thân dừa cạn nhỏ d oa nl w vết thương mũi dao kích thích khuẩn xâm nhập tốt ll u nf va an lu oi m z at nh z gm @ B tuần m co l A tuần Hình 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương an Lu n va ac th 45 si 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả rễ chồi dừa cạn ống nghiệm Kích thích tạo rễ khâu cuối của q trình ni cấy in vitro Các chồi dừa cạn có chiều cao - 3cm, xanh, chồi sinh trưởng phát triển bình thường chuyển sang mơi trường rễ để hồn thiện q trình nhân giống in vitro Chất kích thích sinh trưởng cảm ứng rễ sử dụng IBA NAA, mơi trường MS ½MS 3.5.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi dừa cạn mơi trường MS NAA chất kích sinh trưởng thuộc nhóm auxin NAA đưa vào lu an môi trường nuôi cấy thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng n va cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ [5] tn to Đây giai đoạn quan trọng, định thành công q gh trình ni cấy in vitro Chồi dừa cạn phải có rễ có khả tự hút chất p ie dinh dưỡng ngồi mơi trường tự nhiên để sinh trưởng phát triển w Chồi dừa cạn nuôi cấy môi trường bổ sung kích thích oa nl sinh trưởng NAA nồng độ 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l sau d tuần nuôi cấy thu kết bảng 3.9 lu va an Qua bảng 3.9 cho thấy, môi trường bổ sung NAA có tỉ lệ chồi rễ u nf số rễ/chồi tăng so với công thức đối chứng Số lượng rễ sau tuần tuổi ll môi trường bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l tương m oi ứng: 6,64; 9,27; 8,15; 7,53; 6,12, chiều dài rễ: 1,64; 2,21; 1,97; 1,86; z at nh 1,83cm Công thức cho số lượng rễ nhiều NAA 0,2mg/l đạt z 9,27rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 2,21cm gm @ Khi bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l cảm ứng l tạo rễ tương ứng đạt 85,6; 88,4; 86,9; 84,4; 83,1%, môi trường đối m co chứng tỉ lệ rễ đạt 25,88% Tại nồng độ NAA 0,2mg/l tỉ lệ phần trăm rễ đạt an Lu 88,4%, công thức bổ sung tăng nồng độ NAA lên 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l giá trị trung bình tiêu giảm dần n va ac th 46 si Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Nồng độ NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi rễ (%) 25,88 ± 0,18 Số rễ /chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ 4,36 ± 0,37 0,31 ± 0,20 RK 0,1 85,6 ± 0,22 6,64 ± 0,39 1,64 ± 0,18 RTB 0,2 88,4 ± 0,16 9,27 ± 0,43 2,21 ± 0,16 RTB 0,3 86,9 ± 0,23 8,15 ± 0,43 1,97 ± 0,15 RTB 0,5 84,4 ± 0,13 7,53 ± 0,36 1,86 ± 0,11 RTB 1,0 83,1 ± 0,19 6,12 ± 0,32 1,83 ± 0,15 RTB lu Chú thích: RK: Rễ Kém; RTB: Rễ trung bình an n va p ie gh tn to oa nl w Hình 3.9 Rễ dừa cạn mơi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau tuần) d an lu Tuy nhiên, đánh chung quan sát thực nghiệm sử dụng chất kích u nf va thích sinh trưởng NAA, chất lượng rễ dừa cạn không tốt, rễ không dài, nhiều rễ con, rễ xốp trắng Để tiếp tục so sánh khả tạo rễ chất lượng ll z at nh auxin IBA oi m rễ chúng tơi tiếp tục thăm dị với chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm 3.5.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi z @ trường MS l gm IBA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin IBA có tác dụng tạo rễ ni cấy in vitro nhiều đối tượng thực vật [1], [2] Đối với dừa m co cạn, chồi dừa cạn có kích thước - 3cm cấy chuyển sang môi trường rễ, môi an Lu trường bổ sung IBA với nồng độ khác n va ac th 47 si Theo nghiên cứu Mohammed F CS (2011), Agnieszka Pietrosiuk (2007), IBA có ảnh hưởng tích cực đến khả tạo rễ chồi dừa cạn so với NAA, tiêu tỷ lệ % chồi tạo rễ, số rễ/chồi chiều dài rễ cao môi trường bổ sung NAA Chúng nghiên cứu mơi trường rễ sử dụng chất kích thích sinh trưởng IBA, kết cụ thể sau tuần nuôi cấy bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Tỉ lệ chồi rễ Số Chiều dài rễ IBA (mg/l) (%) rễ/chồi (cm) 25,88 ± 0,18 4,36 ± 0,37 0,31 ± 0,20 RK 0,1 90,1 ± 0,12 8,31 ± 0,39 2,94 ± 0,25 RT 0,2 96,4 ± 0,13 15,6 ± 0,48 3,21 ± 0,21 RT 0,3 92,3 ± 0,15 13,23 ± 0,46 3,07 ± 0,17 RT 0,5 90,3 ± 0,11 10,72 ± 0,36 2,86 ± 0,21 RT 1,0 91,2 ± 0,17 9,13 ± 0,32 2,73 ± 0,28 RT lu Nồng độ Chất lượng rễ an n va p ie gh tn to nl w Chú thích: RT: Rễ tốt d oa So sánh kết bảng 3.9; 3.10 cho thấy, tỉ lệ chồi phát sinh rễ dừa an lu cạn môi trường bổ sung IBA cao môi trường bổ sung NAA Các cơng va thức thăm dị mơi trường bổ sung IBA tỉ lệ chồi rễ 90% Tỉ lệ ll u nf rễ nồng độ IBA tương ứng 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0mg/l 90,1; 96,4; 92,3; oi m 90,3; 91,2 % Tỉ lệ % rễ cao nồng độ IBA 0,2mg/l đạt 96,4% Tỉ lệ % z at nh rễ giảm dần nồng độ IBA tiếp tục tăng Chỉ tiêu quan trọng đánh giá môi trường tạo rễ thích hợp số rễ/chồi z Từ bảng 3.9; 3.10 cho thấy, môi trường bổ sung IBA đạt kết cao @ l gm so với môi trường bổ sung NAA Cụ thể, môi trường IBA với dải nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0mg/l, số rễ/chồi tương ứng là: 8,31; 15,6; 13,23; 10,72; m co 9,13 Số lượng rễ/chồi cao đạt 15,6 môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l an Lu Trên môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l, số rễ/chồi lớn đạt 9,27 Tỉ lệ n va ac th 48 si giảm nồng độ IBA tăng lên 0,3; 0,5; 1,0 mg/l Số lượng rễ cao lượng rễ phụ lại sử dụng chất kích thích sinh trưởng NAA lu an n va p ie gh tn to Hình 3.10 Rễ dừa cạn mơi trường bổ sung IBA 0,2mg/l môi trường MS (sau tuần) nl w d oa So sánh chiều dài rễ mơi trường bổ sung IBA kích thước lớn an lu môi trường NAA Nếu kích thước rễ mơi trường bổ sung NAA tối u nf va đa đạt 2,21cm, môi trường có bổ sung chất kích thích IBA chiều dài ll tối thiểu đạt 2,73cm tối đa đạt 3,21cm Chất lượng rễ tốt dài, bóng, khơng xốp, m oi đáp ứng yêu cầu rễ, rễ khỏe đâm sâu lan rộng để hút chất dinh z at nh dưỡng Theo quan sát thực nghiệm chất lượng rễ dừa cạn nuôi cấy môi z trường bổ sung IBA tốt NAA gm @ Qua khảo sát chất kích thích sinh trưởng NAA, IBA nhóm auxin l thấy môi trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + m co agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l thích hợp để tạo rễ cho chồi dừa cạn an Lu ống nghiệm n va ac th 49 si 3.5.3 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn mơi trường ½ MS Theo kết nhiều cơng trình nghiên cứu, mơi trường ½MS mơi trường rễ lí tưởng loại nuôi cấy in vitro Đối với dừa cạn, theo cơng trình nghiên cứu Mohammed F CS (2011), Kumar A CS (2013), môi trường rễ dừa cạn hiệu mơi trường ½ MS Trên mơi trường MS, IBA cảm ứng tốt trình rễ dừa cạn Chúng tơi lặp lại thí nghiệm với kích thích sinh trưởng mơi trường ½MS Chồi dừa cạn có kích thước - 3cm, cấy chồi mơi trường ½MS bổ sung IBA tương ứng với nồng độ 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l; lu 1,0mg/l sau tuần nuôi cấy thu kết sau: an va Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ dừa cạn n (sau tuần) Tỉ lệ chồi rễ Số Chiều dài rễ IBA (mg/l) (%) rễ/chồi (cm) 0,1 96,2 ± 0,45 13,31 ± 0,35 3,34 ± 0,18 RT 99, ± 0,14 17,3 ± 0,38 4,23 ± 0,23 RT 97,3 ± 0,15 14,3 ± 0,23 3,61 ± 0,17 RT 3,46 ± 0,15 RT 3,23 ± 0,22 RT p ie gh tn to Nồng độ 95,33 ± 0,25 12,2 ± 0,36 1,0 95,33 ± 0,33 12,13 ± 0,21 u nf va an 0,5 lu d oa nl w 0,3 0,2 Chất lượng rễ Chú thích: RT: Rễ tốt ll m oi Qua bảng số liệu 3.11, so sánh chất lượng rễ dừa cạn tạo môi z at nh trường ½MS cho thấy, số lượng rễ/chồi chất lượng rễ tốt rễ môi trường MS nồng độ chất kích tương ứng Tỉ lệ rễ, số lượng rễ, chiều dài rễ z @ đạt tối đa môi trường ½MS + IBA 0,2mg/l Tỉ lệ rễ đạt 99,6%, số lượng đạt l gm 17,3 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 4,23cm Rễ dài, bóng khỏe Trong phạm vi thí nghiệm quan sát thực nghiệm chúng tơi lựa chọn m co mơi trường ½MS + IBA 0,2mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + 1g/l an Lu than hoạt tính mơi trường tối ưu rễ ống nghiệm dừa cạn n va ac th 50 si lu Hình 3.11 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l an mơi trường ½ MS (sau tuần) va n 3.6 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng Chọn dừa cạn sau ni cấy in vitro có rễ dài, khỏe, xanh, ie gh tn to vườn ươm p thời kì sung sức để đưa mơi trường tự nhiên Tiêu chuẩn con: kích thước nl w khoảng 5- 6cm, rễ dài khoảng - 4,5cm, số đạt 8- 10 d oa Lựa chọn giá thể phù hợp để vườn ươm khâu phải thực an lu tỉ mỉ thận trọng Giá thể phù hợp giá thể cho tỉ lệ sống cao, va sinh trưởng, phát triển tốt Tuy nhiên, dừa cạn tự nhiên thích hợp với ll u nf môi trường đất pha cát [8], [11], nên thử nghiệm loại oi m giá thể kết tỉ lệ sống sinh trưởng sau 45 ngày sau: z at nh Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng dừa cạn (sau 45 ngày) Giá thể Tỉ lệ sống Chiều cao @ (%) (cm) 83,8 ± 0,12 gm Đất thịt trung bình + Cát (2:1) 97,2 ± 0,21 9,04 ± 0,11 Đất thịt + phù sa +cát 96,3 ± 0,13 8,97 ± 0,15 an Lu 6,38 ± 0,16 m co Đất thịt trung bình l 1(ĐC) z Cơng thức n va ac th 51 si Với môi trường đất thịt tỉ lệ sống trung bình đạt 83%, chiều cao ban đầu mang trồng trung bình đạt khoảng 5cm, sau 45 ngày chiều cao thay đổi không đáng kể đạt khoảng 6,38 kích thước nhỏ, gầy Đối với đất pha cát tỉ lệ sống cao đạt 97,2%, tăng trưởng nhanh sau 45 ngày chiều đạt 9,04cm Lá to, xanh thẫm, thân mập Khi loại đất hỗn hợp đất thịt, phù sa, pha cát, loại đất tơi xốp, sinh trưởng nhanh, mập, tỉ lệ sống đạt 96,3% Kiểm tra ngẫu nhiên chiều cao 30 sau 45 ngày đạt 8,97cm Quá trình phạm vi thí nghiệm giá thể khác nhận thấy dừa cạn thích hợp với loại đất pha cát (2:1), loại đất tơi xốp (đất thịt lu + phù sa + cát), đất có khả giữ ẩm, cho tỉ lệ sống cao khả sinh an n va trưởng phát triển tốt p ie gh tn to d oa nl w u nf va an lu A 45 ngày B 60 ngày ll oi m z at nh z m co l gm @ C 90 ngày đến sinh trưởng dừa cạn an Lu Hình 3.12 Ảnh hưởng giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát n va ac th 52 si KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.Kết luận 1.1 Khử trùng hạt dừa cạn cồn 700 thời gian phút, dung dịch javen 60% thời gian 15 phút cho hiệu cao 1.2 Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát triển chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 1.3 Mơi trường MS có bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho lu phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm an 1.4 Phương pháp gây tổn thương trình tạo đa chồi phục vụ chuyển va n gen là: chẻ dọc qua đoạn thân mang mắt chồi bên gây tổn thương tn to mũi dao ie gh 1.5 Mơi trường ½ MS có bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; IBA 0,2mg/l; than p hoạt tính 1g/l; pH = 5,8 thích hợp cho rễ chồi dừa cạn in vitro nl w 1.6 Giá thể thích hợp cho dừa cạn sinh trưởng giai đoạn vườn ươm va an Đề nghị lu ẩm) d oa đất thịt trung bình + cát theo tỉ lệ 2:1 (hoặc dạng đất tơi xốp có khả giữ ll u nf 2.1 Cần tiến hành thí nghiệm kiểm tra sai khác DNA trồng oi m hạt ni cấy in vitro, qua giúp khẳng định tính ổn định mặt z at nh di truyền dừa cạn nuôi cấy in vitro 2.2 Thí nghiệm kết hợp BAP IBA kết tạo chồi đạt tốt nhất, số lượng z chồi nhiều, sinh trưởng chậm đề nghị nghiên cứu thêm phương pháp kéo dài @ m co l gm chồi để rút ngắn thời gian thí nghiệm an Lu n va ac th 53 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thị Thúy Hà (2003), Giáo trình Cơng Nghệ Sinh học, Nxb Nơng Nghiệp Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), “Nghiên cứu chiết tách alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định”, Tạp chí khoa học Cơng lu an nghệ Đại học Đà Nẵng, Số (43), tr 85 - 92 n va Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều tn to hịa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam ie gh Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo p trình cơng nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp Hà Nội nl w Bùi văn Lệ , Nguyễn Ngọc Hồng (2006), “Ảnh hưởng chất điều hòa d oa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế an lu bào dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển KH&CN-ĐHQG va HCM, 9(6), tr 59 - 66 ll u nf Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học oi m Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu z at nh ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp 10 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khơi (1996), Xử lí thống kê kết nghiên cứu z @ thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, Nxb Nơng nghiệp l gm Hà Nội m co 11 Viện dược liệu (2013), Kỹ thuật trồng thuốc, Nxb Nông nghiệp 12 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, an Lu Nxb Y học n va ac th 54 si 13 Nguyễn Văn Vinh (2010), “Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dừa cạn (Catharanthus roseus)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Số 1, tr 81- 86 14 Đỗ Năng Vịnh, Ngơ Xn Bình (2008), Giáo trình cơng nghệ sinh học đại cương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 15 Agnieszka Pietrosiuk, Mirosława Furmanowa, Barbara Łata (2007), “Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques”, Phytochemistry Reviews, vol 6(2-3), pp 459-473 lu 16 Felipe Vázquez - Flota (2008), “Vindoline formation in shoot cultures of an n va Catharanthus roseus is synchronously activated with morphogenesis tn to through the last biosynthetic step”, Annals of Botany,102, pp 409-415 gh 17 Kumar A , Prakash K , Sinha RK , Kumar N.( 2013), “ In vitro plant p ie propagation of Catharanthus roseus and assessment of genetic fidelity of w micropropagated plants by marker assay”, Appl Biochem Biotechnol, vol oa nl 169(3), pp 894-900 d 18 Larraburu E.E., Apostolo N.M., Llorente B.E (2012) “In vitro propagation lu va an of Pink Lapacho: mesponse murface methodology and factorial analysis u nf for optimisation of medium components” Int J Fores Res., vol 2012, ll Article ID 318258, pages m oi 19 Mohammed Faheem, Satyapal Singh, Babeet Singh Tanwer, Moinuddin z at nh Khan and Anwar Shahzad (2011) “In vitro regeneration of multiplication shoots in Catharanthus roseus - An important medicinal plant”, Pelagia z gm @ Research Library, vol 2(1), pp 208-213 of transgenic Catharanthus roseus (L) m co production l 20 Mohsen Zargar, Tahereh Nabavi, Farah Farahaniand (2010) , “Hairy roots plants with Plants Research, vol 4(21), pp 2199 - 2203 an Lu Agrobacterium rhizogenes under in vitro conditions”, Journal of Medicinal n va ac th 55 si 21 Parida R., Mohanty S., Kuanar A., Nayak S (2010) “Rapid multiplication and in vitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissue culture” Electron J Biotechnol, vol.13(4), pp - 22 Taha, H S.; El-Bahr, M K.; Seif-El-Nasr, M M (2009), “In vitro studies on Egyptian Catharanthus roseus (L.) G Don IV: Manipulation of some amino acids as precursors for enhanced of indole alkaloids production in suspension cultures”, Australian Journal of Basic & Applied Sciences, vol 3(4), pp 3137-3144 Tài liệu trang web lu 23 http://www.cpv.org.vn/cpv/Modules/News/NewsDetail.aspx Khơi.dậy tiềm an n va lớn từ dược liệu Việt Nam, tác giả: Vũ Trang tn to 24 http://www.duoclieu.org/2012/04/dua-can-cathranthus-roseus-l-g-don.html gh 25 http://suckhoedoisong.vn/y-hoc-co-truyen/dua-can-vi-thuoc-quy-.htm, tác p ie giả: Lương y Thanh Ngọc w 26 http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.phpq=node/195 oa nl 27 http://vietnamnet.vn/vn/xa-hoi/102565/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thu- d tang- nhanh.html, tác giả: Cẩm Quyên lu va an 28 http://ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_261.htm/Cây.dừa.cạn,.nguyên ll u nf liệu chế tạo thuốc trị ung thư, tác giả: GS Ðoàn Thị Nhu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 56 si PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường MS STT Thành phần Nồng độ( mg/l) MS1 1 lu an n va p d oa nl w FeSO 4.7H2O Na2EDTA MS3 6,2 8.6 22,3 0,025 0,83 0,025 0,25 MS4 27,8 37,3 MS5 va an lu Pirydoxine Thiamin HCl Nicotinic acid(P.P) Myo-inositol glycine 0,5 0,1 0,5 100 ll u nf oi m z at nh 14 15 16 17 18 170 1900 370 1650 H3BO3 ZnSO 4.7H2O MnSO 4.4H2O CoCl2.6H2O KI CuSO 4.5H2O Na2MoO 4.2H2O ie 12 13 MS2 KH2PO KNO NH4NO MgSO 4.7H2O gh tn to 10 11 440 CaCl-2.2H2O z m co l gm @ an Lu n va ac th si