Thông tin tài liệu
i Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng dƣới hƣớng dẫn PGS TS PGS TS Các số liệu trình bày luận án trung thực Một số kết đƣợc công bố riêng đồng tác giả, phần cịn lại chƣa lu an đƣợc cơng bố cơng trình khác va Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận án này! n to 03 năm 2014 p ie gh tn nl w d oa Hoàng Phú Hiệp ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Lê Quang Huấn, PGS TS Nguyễn Bích Nhi hướng dẫn, bảo tận tình từ bước tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp lu – an va n thực đề tài luận án tn to Tôi xin cảm ơn Bộ môn Di truyền SHHĐ, Khoa Sinh-KTNN, Trường Đại gh p ie học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ suốt w thời gian học tập, nghiên cứu oa nl Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè tơi tạo điều kiện động viên d suốt q trình học tập hồn thành luận án lu va an Tôi xin trân trọng cảm ơn!!! ll u nf Thái Nguyên, ngày 05 tháng 03 năm 2014 oi m Nghiên cứu sinh z at nh z Hoàng Phú Hiệp m co l gm @ an Lu n va ac th si iii Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN E COLI O157:H7 1.1.1 Đặc điểm chung chủng vi khuẩn E coli O157:H7 lu an 1.1.2 Độc tố Shiga-like toxin: Bản chất tác hại va n 1.1.3 Nguyên nhân diễn biến ngộ độc 11 gh tn to 1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Việt Nam 13 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN p ie 1.2 w E COLI O157:H7 14 oa nl 1.2.1 Phƣơng pháp PCR dựa DNA 14 d 1.2.2 Kỹ thuật LAMP 18 lu KHÁNG THỂ 23 ll u nf 1.3 va an 1.2.3 Sử dụng kháng thể tái tổ hợp phát E coli O157:H7 19 oi m 1.3.1 Mảnh kháng thể 25 z at nh 1.3.2 Kháng thể tái tổ hợp 26 1.3.3 Kỹ thuật phage display 27 z gm @ 1.3.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng kháng thể Việt Nam 32 Vật liệu nghiên cứu 35 m co 2.1 l Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 an Lu 2.1.1 Sinh phẩm 35 n va ac th si iv 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Các cặp mồi đƣợc sử dụng 36 2.2 Thiết bị 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 ứu DNA 37 2.3.1 P 2.3.2 Kỹ thuật bộc lộ thực khuẩn thể (phage display) 43 ứu protein 45 2.3.3 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 51 lu Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 52 an n va : 52 tn to 3.1 XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN 52 gh 3.1.1 Xác định chủng vi khuẩn E coli O157:H7 kỹ thuật phân tích p ie gen mã hóa 16S rRNA 52 nl w 3.1.2 Sử dụng đoạn gen Stx1 Stx2 để xác định E coli O157:H7 58 NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỐI VỚI an lu 3.2 d oa 3.1.3 Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E coli O157:H7 63 va VI KHUẨN E COLI O157:H7 VÀ TÁCH DÒNG XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ll u nf GEN MÃ HĨA KHÁNG THỂ 69 oi m 3.2.1 Sàng lọc kháng thể từ thƣ viện Griffin.1 70 z at nh 3.2.2 Chọn dòng phage kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn E coli O157: H7 72 3.2.3 Nhân gen mã hóa kháng thể PCR 74 z gm @ 3.2.4 Giải trình tự gen mã hoá kháng thể 75 79 m co 3.3.1 l 3.3 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP 79 an Lu 3.3.2 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu gen mã hóa kháng thể 80 n va ac th si v 3.3.3 82 3.3.4 ểu gen mã hóa kháng thể 83 TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA KHÁNG THỂ 3.4 TÁI TỔ HỢP 85 3.4.1 85 3.4.2 pháp lai blot 88 3.4.3 Kiểm tra hoạt tính kháng thể tái tổ hợp ELISA 90 ạt nano 91 3.4.4 lu an 93 n va to gh tn 94 95 p ie d oa nl w PHỤ LỤC 108 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv vi THUẬT NGỮ VIẾT TẮT lu an n va p ie gh d oa nl w lu oi m z at nh z m co l gm @ CDR Cfu ddNTP DNA dNTP E coli EDTA EHEC ELISA EtBr FDA HRP HC HUS IPTG Kana Kb kDa LAMP LB mAb OD PBS PCR PEG rRNA SDS SDS-PAGE STEC TAE TE TEMED v/p VH VL ll 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 u nf CDC va Tên đầy đủ Ampicillin Base pair Centers for Disease Control and Prevention- Trung tâm Kiểm sốt Phịng chống Dịch bệnh Mỹ Complementarity Determining Region- Vùng định tính bổ trợ Colony forming unit Dideoxynucleotide Deoxyribonucleic Acid Deoxynucleotide Escherichia coli Ethylene Diamine Tetra acetic Acid Enterohaemorrhagic E coli- E coli gây xuất huyết ruột Enzyme-linked immunosorbent assay Ethidium Bromide Food and Drug Administration Horseradish peroxidase Hemorrhagic Colitis- Viêm đại tràng xuất huyết Hemolytic Uremic Syndrome- Hội chứng dung huyết suy thận Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside Kanamycin Kilo base pair Kilo Dalton Loop-mediated Isothermal Amplification Lauria Bertani Monoclonal antibody- kháng thể đơn dòng Optical Density Phosphate buffer saline Polymerase Chain Reaction Polyethylene Glycol Ribosomal RNA Sodium Dodecyl Sulphate SDS- Polyacrylamide gel electrophoresis Shiga-like toxin producing Escherichia coli Tris - Acetate – EDTA Tris – EDTA N, N, N’, N’- Tetramethyl ethylenediamine Vòng/phút Variable heavy - Vùng biến đổi chuỗi nặng Variable light - Vùng biến đổi chuỗi nhẹ an Ký hiệu Amp bp tn to STT an Lu n va ac th si v vii Số hiệu bảng 1.1 Tên bảng Trang hông số hệ gen vi khuẩn E coli O157:H7 06 lu an n va Đặc điểm mảnh kháng thể 26 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 36 2.2 Thành phần phản ứng PCR 39 2.3 Thành phần phản ứng xử lý DNA enzme giới hạn 40 2.4 Thành phần phản ứng nối ghép 40 2.5 Thành phần chu trình nhiệt phản ứng LAMP 42 Thành phần gel polyacrylamide 46 gh tn to 1.2 p ie 2.6 Kết so sánh trình tự gen HQ658163 với trình tự gen 16S 3.1 56 nl w rRNA từ GenBank Kết so sánh trình tự gen Stx1 với trình tự gen Stx1 từ oa 61 d 3.2 Kết so sánh trình tự gen Stx2 với trình tự gen Stx2 từ 62 u nf GenBank va 3.3 an lu GenBank Kết phản ứng ELISA xác định độ nhạy kháng thể tái ll m 3.4 90 oi tổ hợp kháng thể chuẩn z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi viii Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 kính hiển vi điện tử 03 1.2 Hình ảnh vi khuẩn E coli O157:H7 mơi trƣờng có MUG 04 1.3 Bản đồ 05 1.4 Cấu trúc độc tố Shiga-like toxin 07 1.5 Nguyên lý gây chết tế bào Shiga-like toxin 08 1.6 Nguyên lý gây bệnh E coli O157:H7 12 1.7 Cấu trúc chung số loại kháng thể 24 1.8 Sơ đồ cấu tạo mảnh kháng thể đơn chuỗi 25 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm luận án 52 3.2 Hình ảnh điện di tách DNA tổng số 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA 53 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra kết tách chiết DNA plasmid 54 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid enzyme giới hạn BamHI 55 ie Sơ đồ hình thể mối quan hệ E coli O157:H7 với chủng lu Số hiệu hình 1.1 an n va gh tn to p Trang (genome) vi khuẩn E coli O157:H7 ẩn E coli O157:H7 53 khác đƣợc xây dựng sở so sánh trình tự gen 16S RNA chủng w 3.6 Tên hình 57 oa nl E coli O157:H7 nghiên cứu (mã số HQ658163) chủng khác Ngân hàng Gen Quốc tế d 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 Stx2 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 với cặp mồi vector pJET 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET 60 3.10 Vị trí trình tự cặp mồi FIP/BIP 64 3.11 Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số 64 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP 65 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA 66 3.14 Sản phẩm LAMP nhuộm 68 ll u nf va an lu 58 oi m z at nh z SYBR Green I 59 @ 71 l với dòng tế bào E coli O157:H7 gm Khả gắn kết hỗn hợp phage thu đƣợc sau vòng sàng lọc 3.15 3.16 72 an Lu 3.17 với E coli O157:H7 m co Sơ đồ nguyên lý kỹ thuật ELISA dùng xác định lực phage Kết phản ứng ELISA đánh giá lực hỗn hợp phage vòng 73 n va ac th si ix sàng lọc Kết đánh giá lực dòng phage 20 với tế bào E coli O157:H7 3.18 74 tế bào E coli ATCC 25922 3.19 Kết điện di sản phẩm PCR dòng 20 với cặp mồi LABF/LABR 75 3.20 Cấu trúc 3D kháng thể tái tổ hợp 77 3.21 Hình ảnh điện di sản phẩ 80 3.22 Thiết kế vector pET28a-TRX biểu gen mã hóa kháng thể 81 -PAGE 3.23 82 3.24 kháng thể tái tổ hợp 83 3.25 Khảo sát nhiệt độ biểu kháng thể tái tổ hợp 84 lu Hình ảnh điệ an 3.26 kháng thể tái tổ - 86 va hợp n Hình ảnh kết điện di SDS-PAGE trình tinh protein tái tổ 87 hợp phƣơng pháp Hybrid tn to 3.27 gh Hình ảnh điện di kết phản ứng Western blot kháng thể tái tổ hợ ie 3.28 88 p -tag Hình ảnh kết phản ứng Dot blot kháng thể tái tổ hợp với kháng 89 thể chuẩn mã số AB75244 (Hãng Abcam) oa nl Hình ảnh phức d 3.30 w 3.29 kháng thể- silica bắt tế bào E coli O157:H7 91 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngộ độc thực phẩm xảy sử dụng thức ăn, nƣớc uống không đƣợc bảo quản cách dẫn đến sản phẩm bị hƣ thối nhiễm khuẩn hóa chất độc hại Các nghiên cứu gần xác định nguyên nhân nhiều trƣờng hợp ngộ độc thức ăn vi khuẩn E coli E coli thuộc nhóm vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae, có nhiều tự nhiên, ruột ngƣời gia súc Trong đƣờng ruột, chúng diện chủ yếu đại tràng nên đƣợc gọi vi khuẩn đại tràng E coli nhiễm vào đất, lu nƣớc… từ phân động vật Khi gặp điều kiện thuận lợi cho phát triển chúng an gây bệnh Đa số chủng E coli chủng độc hại, nhiên có vài va n chủng độc nhƣ chủng E coli O157:H7 tìm thấy ruột phân tn to loài gia súc, đặc biệt phân bò, chất thải bị sản phẩm nhƣ Các bệnh có liên quan đến E coli tiêu chảy, viêm phổi, viêm đƣờng dẫn tiểu p ie gh thịt bò, sữa bò chƣa khử trùng [49] số bệnh khác Triệu chứng bị nhiễm trùng vi khuẩn thƣờng khác nhau, nhƣng w oa nl nhìn chung, bệnh nhân hay có triệu chứng nhƣ: nơn, đau bụng, sốt, xuất huyết d dƣới da, tăng huyết áp, tiêu chảy thƣờng có máu Đại đa số bệnh nhân phục hồi sau lu an đến ngày Vì vi khuẩn E coli phổ biến, nên hàng năm khắp giới u nf va có ngƣời mắc bệnh vi khuẩn Các chuyên gia ƣớc tính Mỹ năm có ll khoảng 70 nghìn ngƣời mắc bệnh liên quan đến E coli O157:H7 [106] oi m Ở Việt Nam, theo thống kê Cục Vệ sinh An tồn Thực phẩm, năm 2010 có z at nh 175 vụ ngộ độc với 5664 ngƣời mắc, có 3978 ngƣời phải nhập viện 51 ngƣời tử vong Năm 2011 có 148 vụ ngộ độc, có 4700 ngƣời mắc với 3663 z ngƣời phải nhập viện 27 ngƣời tử vong Năm 2012 có 168 vụ ngộ độc, có @ gm 5541 ngƣời mắc với 4335 ngƣời nhập viện 34 ngƣời tử vong Nhƣ vậy, ba m co l năm liên tiếp có 491 vụ ngộ độc với 112 ngƣời tử vong Trong năm 2013 nƣớc ta xảy nhiều vụ ngộ độc nghiêm trọng tháng cuối năm Số liệu thống kê an Lu quý III năm 2013 cho thấy, 40 vụ ngộ độc thực phẩm 23 vụ vi sinh vật gây Chủng vi khuẩn E coli O157:H7 đƣợc xác định lần Việt Nam n va ac th si 105 88 Smith G.P., Schultz D.A and Ladbury J.E (1993), "A ribonuclease Speptide antagonist discovered with a bacteriophage display library", Gene, 128(1), pp 37-42 89 Sorderlind E., Vergeles M and Borrebaeck C A (1995), "Domain libraries: synthetic diversity for the novo design of antibody V- regions.", Gene, 160(2), pp 269- 272 90 Steinhauer C., Wingren C., Hager A C and Borrebaeck C A (2002), "Single framework recombinant antibody fragments designed for protein chip applications", Biotechniques, Suppl, pp 38-45 91 Sulochana K N and Ge R (2007), "Developing antiangiogenic peptide drugs lu for angiogenesis-related diseases", Curr Pharm Des., 13(20), pp 2074-2086 an va 92 Tan Duc Nguyen, Thin Thanh Vo and Hung Vu-Khac (2011), "Virulence n factors in Escherichia coli isolated from calves with diarrhea in Vietnam", J to gh tn Vet Sci., 12(2), pp 159- 164 93 Tjandra J J., Ramadi L and McKenzie I F (1990), "Development of human p ie anti-murine antibody (HAMA) response in patients", Immunol Cell Biol., 68 Tordsson J M., Ohlsson L G., Abrahmsén L B., Karlström P J., Lando P d oa 94 nl w ( Pt 6), pp 367-376 an lu A and Brodin T N (2000), "Phage-selected primate antibodies fused to superantigens for immunotherapy of malignant melanoma", Cancer va Tornetta M., Fisher D., O'Neil K., Geng D., Schantz A., Brigham-Burke M., ll 95 u nf Immunol Immunother, 48(12), pp 691-702 m oi Lombardo D., Fink D., Knight D., Sweet R and Tsui P (2007), "Isolation of z at nh human anti-idiotypic antibodies by phage display for clinical immune response assays", J Immunol Methods, 328(1-2), pp 34-44 z Wang F., Jiang L and Ge B (2011), "Loop-mediated Isothermal gm @ 96 Amplification Assays for Detecting Shiga Toxin-producing Escherichia coli l in Ground Beef and Human Stools", J Clin Microbiol., 50(1), pp 91- 97 m co an Lu n va ac th si 106 97 Weisburg W G., Barns S M., Pelletier D A and Lane D J (1991), "16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study", J Bacteriol., 173(2), pp 697-703 98 Winter G., Griffiths A D., Hawkins R E and Hoogenboom H R (1994), "Making antibodies by phage display technology", Annu Rev Immunol., 12, pp 433- 455 99 Woo P C., Lau S K., Teng J L., Tse H and Yuen K Y (2008), "Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories", Clin Microbiol Infect., 14(10), pp 908-934 lu 100 Zhang W., Bielaszewska M., Kuczius T and Karch H (2002), an va "Identification, characterization, and distribution of a Shiga toxin gen n variant (stx(1c) in Escherichia coli strains isolated from humans", J Clin to gh tn Microbiol., 40(4), pp 1441-1446 TÀI LIỆU INTERNET ie abbott (2006), Annual report, p 101 nl w http://www.abbott.com/static/content/microsite/annual_report/2006/humira.h oa tml, ngày 20/9/2010 Bộ Y tế (2011), Chiến lƣợc quốc gia an toàn thực phẩm giai đoạn 2011- d an lu 102 20120 tầm nhìn 2030 (Dự thảo 9), va u nf http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/congdan/DuThaoVanB ll an?_piref135_27935_135_27927_27927.mode=detail&_piref135_27935_13 m oi 5_27927_27927.id=532, ngày 23/12/2013 z at nh 103 Feng P., Weagant S.D and Jinneman K (2011), BAM: Diarrheagenic Escherichia coli, z 080.htm, ngày 09/09/2012 l 104 gm @ http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070 Gwartney A (2011), Escherichia coli showing flagella, m co http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=6731, an Lu ngày 05/11/2010 n va ac th si 107 105 Henahan S (2011), Bad Burger Bacteria Genome, http://www.accessexcellence.org/WN/SUA14/ecoli2001.php, ngày 05/11/2010 106 Schneider K.R., Schneider R.G., Hubbard M.A and Chang A (2013), Preventing Foodborne Illness: E coli O157:H7, http://edis.ifas.ufl.edu/fs097, ngày 05/11/2013 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 108 PHỤ LỤC Phụ lục 16S rRNA-F: lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 109 Phụ lục 2: 16S rRNA-R: lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 110 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 111 Phụ lục 3: So sánh trình tự chủng E coli O157:H7 mã số HQ658163 với chủng chủng E coli O157:H7 mã số AB035923 >>EM_PRO:AB035923; AB035923 Escherichia coli O157:H7 yrd (6560 nt) initn: 7419 init1: 7419 opt: 7419 Z-score: 4641.5 bits: 873.6 E(): banded Smith-Waterman score: 7419; 99.4% identity (99.4% similar) in 1500 nt overlap (1-1500:998-2497) 10 Sequen 20 30 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCT ::::::::::: :::::::::::::::::: EM_PRO AATTCTTTGAGCATCAAACTTTTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT lu an 970 980 990 va 40 1000 50 1010 60 1020 70 80 90 n Sequen GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG to :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: tn EM_PRO GGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTG gh 1030 1040 1050 1060 1070 1080 p ie 100 110 120 130 140 150 Sequen ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT nl w :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: 1090 d oa EM_PRO ACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGAGGGATAACTACT 1100 lu an 160 1110 1120 170 180 1130 1140 190 200 210 va Sequen GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC u nf :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTC 1160 ll 1150 1170 1180 1190 1200 230 oi m 220 240 250 260 270 z at nh Sequen TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGC 1220 1230 1240 z 1210 1250 1260 290 300 310 gm @ 280 320 330 l Sequen GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG m co :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAG 1270 1280 350 1300 360 1310 370 1320 380 an Lu 340 1290 390 n va ac th si 112 Sequen ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA 1330 1340 400 1350 1360 410 420 1370 1380 430 440 450 Sequen TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAG 1390 1400 460 1410 1420 470 480 1430 1440 490 500 510 Sequen TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 lu an 520 530 540 550 560 570 va Sequen CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG n :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: tn to EM_PRO CCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCG 1510 1520 1540 590 600 1550 1560 610 620 630 Sequen CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC p ie gh 580 1530 :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: nl w EM_PRO CACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATC 1570 1580 1590 1600 1610 1620 d oa lu an 640 650 660 670 680 690 Sequen TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT va :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: u nf EM_PRO TGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAAT 1640 1650 1660 ll 1630 1670 1680 710 oi m 700 720 730 740 750 z at nh Sequen GCGTAGAGATCTGGAAGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT ::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCT 1700 1710 1720 z 1690 1730 1740 770 780 790 gm @ 760 800 810 l Sequen CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: m co EM_PRO CAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC 1750 1760 830 1780 840 1790 850 1800 860 an Lu 820 1770 870 n va ac th si 113 Sequen GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCG 1810 1820 880 1830 1840 890 900 1850 1860 910 920 930 Sequen ACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA :::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO ACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA 1870 1880 940 1890 1900 950 960 1910 1920 970 980 990 Sequen AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACAT 1930 1940 lu 1000 1950 1960 1010 1020 1970 1030 1980 1040 1050 an Sequen CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG va :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: n EM_PRO CCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATG 2000 tn to 1990 2020 1070 1080 2030 1090 2040 1100 1110 Sequen GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: p ie gh 1060 2010 EM_PRO GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA 2060 2070 2080 2090 2100 d oa nl w 2050 1120 1130 1140 1150 1160 1170 lu an Sequen TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: va EM_PRO TCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG 2120 u nf 2110 2130 2140 2150 2160 ll 1190 1200 1210 1220 1230 oi m 1180 Sequen GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC z at nh ::::::::::::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTAC 2170 2180 2190 2200 2210 2220 z 1250 1260 @ 1240 1270 1280 1290 gm Sequen AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGG l ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: :: : EM_PRO AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCG 2240 1310 2260 1320 2270 1330 2280 1340 an Lu 1300 2250 m co 2230 1350 Sequen TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA n va ac th si 114 :::::::::::::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGA 2290 2300 1360 2310 2320 1370 1380 2330 1390 2340 1400 1410 Sequen TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO TCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG 2350 2360 1420 2370 2380 1430 1440 2390 1450 2400 1460 1470 Sequen AGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT ::::::::::::: :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: EM_PRO AGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGAT 2410 2420 1480 2430 2440 1490 2450 2460 1500 lu Sequen TCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA an :::::::::::: ::::::::::::::::: n va EM_PRO TCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 115 Phụ lục 4: Stx1: lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 116 Phụ lục 5: Stx2 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 117 Phụ lục 6: gen mã hóa đoạn kháng thể: lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 118 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN lu an n va tn to p ie gh ESCHERICHIA COLI d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va - 2014 ac th si 119 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN lu an n va ESCHERICHIA COLI p ie gh tn to w d oa nl : 62 42 01 21 ll u nf va an lu oi m z at nh m co l gm @ PGS z : an Lu n va - 2014 ac th si
Ngày đăng: 19/07/2023, 05:09
Xem thêm:
