(Luận văn) bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone trong bã đậu nành bằng phương pháp hplc

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA  lu an va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP gh tn to p ie Đề tài: ĐẦU XÁC ĐỊNH SÁU HỢP CHẤT nl w BƯỚC d oa ISOFLAVONE TRONG BÃ ĐẬU NÀNH BẰNG nf va an lu PHƯƠNG PHÁP HPLC lm ul : Võ Thị Thủy Hà Lớp : 14CHP Chun ngành : Hóa phân tích – Mơi trường Khóa : 2014 z at nh oi Sinh viên thực z : TS Bùi Xuân Vững m co l gm @ GVHD an Lu n va Đà Nẵng , ngày 19 tháng năm 2018 ac th si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập nghiên cứu trường quan tâm giúp đỡ thầy khoa Hóa Học, Trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng, đặc biệt hướng dẫn tận tình TS Bùi Xuân Vững em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn thầy dành thời gian tâm huyết để truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích, kinh nghiệm q báu, ln định hướng, góp ý sửa chữa chỗ sai để từ giúp em biết nắm bắt kĩ lưỡng, chi tiết nội dung, vấn đề liên quan đến khóa luận hồn thành khóa luận cách tốt lu Em xin trân trọng cảm ơn đến thầy giáo phịng thí nghiệm, thầy an khoa Hóa tất bạn bè gia đình giúp đỡ, góp ý bảo tận tình n va suốt thời gian em thực đề tài khóa luận tốt nghiệp gh tn to Cuối em xin cảm ơn thầy cô hội đồng bảo vệ tốt nghiệp dành thời gian quý báu để đọc nhận xét cho đề tài tốt nghiệp em p ie w Em xin chân thành cảm ơn! oa nl Đà Nẵng, ngày tháng năm 2015 d Sinh viên thực hiện: nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) OKR Okara (bã đậu nành) DMSO Dimethyl sulfoxit AOAC Association of Official Analytical Chemists lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu isoflavone 1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm, tính chất, cấu trúc hoạt tính isoflavone a) Nguồn gốc, đặc điểm b) Tính chất, cấu trúc lu 1.1.2 Vai trò, ứng dụng isoflavone an n va a) Tác dụng chuyển hóa xương tn to b) Tác dụng tim mạch p ie gh c) Tác dụng chức nhận thức w d) Tác dụng khối u phụ thuộc hormone oa nl 1.2 Giới thiệu bã đậu nành d 1.2.1 Đặc điểm bã đậu nành[11] lu nf va an 1.2.2 Những nghiên cứu liên quan đến bã đậu nành công nghiệp thực phẩm 1.3 Tổng quan nghiên cứu chiết isoflavone từ bã đậu nành lm ul nước z at nh oi 1.3.1 Các nghiên cứu nước 1.3.2 Các nghiên cứu nước 10 z gm @ 1.4 Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC [8] 11 l 1.4.1 Khái niệm 11 m co a) Định nghĩa sắc ký 11 an Lu b) Sắc ký lỏng hiệu nâng cao-HPLC 11 n va 1.4.2 Nguyên tắc trình sắc ký 12 ac th si 1.4.3 Những yếu tố ảnh hưởng đến lưu giữ cấu tử chất tan 13 1.4.4 Đặc tính sắc kí chất tan 13 a) Tính chất lưu giữ 13 b) Hệ số phân bố K 14 c) Hệ số dung lượng k’ 14 d) Hệ số chọn lọc 15 1.4.5 Hệ thống HPLC 16 a) Bình chứa dung mơi 16 lu an b) Áp suất cột tách 16 n va c) Hệ thống bơm 17 tn to d) Hệ thống tiêm mẫu 17 p ie gh e) Cột sắc ký lỏng hiệu cao 18 w f) Detector 18 oa nl g) Bộ phận ghi tín hiệu 20 d h) Thiết bị in liệu 20 lu nf va an 1.4.6 Các bước tiến hành sắc ký 21 a) Chuẩn bị dụng cụ máy móc 21 lm ul b) Chuẩn bị dung môi pha động 21 z at nh oi c) Chuẩn bị mẫu đo HPLC 21 d) Cách vận hành thiết bị 21 z @ 1.5 Kết luận 22 gm co l CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 m 2.1 Nguyên liệu 23 an Lu 2.2 Hóa chất thiết bị 23 n va 2.2.1 Hóa chất 23 ac th si 2.3 Chuẩn hóa kỹ thuật phân tích 25 2.4 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Khảo sát phương pháp trích ly isoflavone [3], [4] 26 a) Quy trình cơng nghệ chiết isoflavone phương pháp chiết lắc thông thường 26 b) Phương pháp trích ly isoflavone phương pháp lắc có hỗ trợ siêu âm 27 2.4.2 Phương pháp định tính, định lượng isoflavone HPLC [1], [2], [6], [9] 28 a) Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC để phân tích isoflavone 28 lu an n va • Chọn bước sóng 28 • Chọn tốc độ dịng 28 tn to b) Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 29 ie gh c) Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 31 p d) Phân tích định tính isoflavone 31 oa nl w e) Phân tích định lượng isoflavone 31 Quy trình chuẩn bị mẫu đo HPLC 32 • Xác định hàm lượng isoflavone 32 d • nf va an lu 2.4.3 Khảo sát độ lặp lại phép đo [14] 33 lm ul CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 z at nh oi 3.1 Kết khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 34 3.2 Kết khảo sát mẫu đậu nành có isoflavone theo hệ 36 z gm @ 3.3 Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 39 co l 3.4 Khảo sát độ lặp lại phép đo 45 m 3.5 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [14] 48 an Lu 3.6 Kết định tính isoflavone mẫu dịch bã 48 n va 3.5 Kết đo mẫu thực 50 ac th si 3.6 Áp dụng đường chuẩn tính tốn hàm lượng isoflavone bã đậu nành 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Đề xuất 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học isoflavone Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Isoflavone[9] Hình 1.2: Cấu trúc hóa học aglucones Hình 1.3: Cấu trúc hóa học 𝛽- Glucozit Hình 1.4: Quá trình tách sắc kí cột hai chất A B .13 Hình 1.5: Sơ đồ máy HPLC 16 Hình 2.1 Bã đậu nành tươi, bã khô bột bã 23 lu an Hình 2.2 Thiết bị khuấy thiết bị li tâm 24 n va Hình 2.3 Thiết bị lọc chân không thiết bị cô quay chân không 24 to tn Hình 2.4 Máy lắc thiết bị sấy 25 p ie gh Hình 2.5 Tủ lạnh thiết bị cất nước 25 w Hình 2.6 Thiết bị HPLC .25 oa nl Hình 2.7 Quy trình chiết isoflavone phịng thí nghiệm 26 d Hình 2.8 Quy trình chiết isoflavone phương pháp khuấy có hỗ trợ siêu âm lu nf va an phòng thí nghiệm 27 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ .34 lm ul 35 z at nh oi Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 35 Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu chuẩn isoflavone theo hệ 35 z gm @ Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn thay đổi thành phần pha động theo hệ .36 l Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu cao hạt đậu nành .36 m co Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu dịch hạt đậu nành chiết cồn 80% 37 an Lu Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu hạt khô .37 n va Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu cao bã đậu nành .38 ac th si Hình 3.9 : Sắc ký đồ mẫu dịch bã đậu nành .38 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc dện tích peak vào nồng độ Daizdin 41 Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào glycitin 42 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào genistin 42 Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc Daidzein 43 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ glycitein 43 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ genistein 44 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu dịch bã chiết etanol 51 lu Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc 52 an n va Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC siêu âm kết hợp lắc 53 p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Danh sách isoflavones[9], [3] Bảng 2.1 Nồng độ chất chuẩn làm việc (µg/ml) 31 Bảng 3.1 Kết đo chuẩn STD OKR1 39 Bảng 3.2 Kết đo chuẩn STD OKR2 39 Bảng 3.3 Kết đo chuẩn STD OKR3 40 lu Bảng 3.4 Kết đo chuẩn STD OKR4 40 an n va Bảng 3.5 Kết đo chuẩn STD OKR5 41 tn to Bảng 3.7 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Daidzin 45 ie gh Bảng 3.8 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Glycitin 45 p Bảng 3.9 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Genistin 46 w oa nl Bảng 3.10 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Daidzein 46 d Bảng 3.11 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Glycitein 47 lu nf va an Bảng 3.12 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Genistein 47 Bảng 3.13 Kết LOD LOQ 48 lm ul Bảng 3.14 Kết đo dịch bã chiết cồn 80% 51 z at nh oi Bảng 3.15 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc 52 Bảng 3.15 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC siêu âm kết hợp lắc 53 z gm @ Bảng 3.16 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy 54 co l Bảng 3.17 Hàm lượng isoflavone 55 m Bảng 3.18 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy 56 an Lu Bảng 3.19 Hàm lượng isoflavone g bã khô 56 n va Bảng 3.20 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy 57 ac th si Bảng 3.11 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Glycitein Thời gian lưu Glycitein STT Thời gian lưu 39.473 39.483 39.528 Các thơng số thống kê Giá trị trung bình: Xtb= 39.499 Độ lệch chuẩn SD = 0.265 39.132 39.879 Độ lệch chuẩn tương đối lu an n va RSD(%) = 0.67% tn to p ie gh Bảng 3.12 Độ lặp lại hệ thống HPLC với mẫu Genistein nl w STT Thời gian lưu Genistein Thời gian lưu d oa Các thông số thống kê lu 47.840 47.836 47.940 Giá trị trung bình: nf va an Xtb= 47.813 lm ul Độ lệch chuẩn 47.902 co l gm ➢ Nhận xét: RSD(%) = 0.32% @ Độ lệch chuẩn tương đối z 47.549 z at nh oi SD = 0.154 m Theo kết khảo sát nhận thấy độ lệch chuẩn tương đối chất nhỏ áp dụng để phân tích mẫu thật an Lu 1% Như vậy, hệ thống sắc ký HPLC có độ lặp lại tốt, quy trình phân tích ổn định n va ac th 47 | P a g e si 3.5 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [14] Giới hạn phát xem nồng độ thấp chất phân tích mà hệ thống phân tích cịn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu LOD = × 𝑆𝑌/𝑋 a Giới hạn định lượng xem nồng độ thấp (xQ) chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu lu an LOQ = × LOD n va Trong đó: tn to p ie gh ▪ a hệ số góc phương trình hồi quy ▪ SY/X độ lệch chuẩn mẫu trắng, xác định theo hàm LINEST excel 2016 ➢ Kết LOD LOQ trình bày bảng 3.13 w d oa nl Bảng 3.13 Kết LOD LOQ LOD (µg/ml) LOQ (µg/ml) 6.124951 0.94745 3.15817 4.601053 0.74115 2.47050 nf va an lu SY/X z at nh oi Phương trình hồi quy y = 19.394x + 2.4436 Glycitin y = 18.624x - 1.7143 Genistin y = 29.025x - 7.686 3.724970 0.38501 1.28337 Daidzein y = 29.087x - 6.4813 5.299281 0.54656 1.82187 Glycitein y = 24.644x + 1.7139 2.575494 Genistein y = 38.833x - 5.7301 14.51576 lm ul Daidzin z gm @ 0.313521 1.045069 l 3.737979 m co 1.121394 an Lu n va 3.6 Kết định tính isoflavone mẫu dịch bã ac th 48 | P a g e si ➢ Mẫu dịch cốt bã: Mẫu xử lý chuẩn bị theo quy trình 2.4.2.5.1 ➢ Mẫu dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn isoflavone pha Acetonitril ➢ Điều kiện sắc ký: Pha động : - Pha động B : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric Pha động C : Acetonitrile lu - Pha tĩnh : octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18) - Thể tích tiêm mẫu : 10µl - Tốc độ dòng pha động: 1,5ml/phút - Detector : UV bước sóng 260nm - Nhiệt độ buồng cột : 400C an n va ➢ Kết sắc ký đồ mẫu dịch cốt bã mẫu dung dịch chuẩn thể hình p ie gh tn to 3.16 3.17 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z gm @ Hình 3.16: Sắc ký đồ isoflavone mẫu dung dịch chuẩn m co l an Lu n va ac th 49 | P a g e si lu an va Hình 3.17: Sắc ký đồ isoflavone mẫu dịch cốt bã n ➢ Nhận xét: gh tn to Dựa vào kết sắc ký đồ mẫu dịch chuẩn isoflavone mẫu dịch thử, định danh hợp chất isoflavone mẫu thử theo thời gian lưu Kết cho thấy: Thời ie p gian lưu píc là: daidzin (17 phút), glycitin (19 phút), genistin (24 phút), nl w diadzein (36 phút), glycitein (39 phút), genistein (47 phút) d oa 3.5 Kết đo mẫu thực nf va an lu ❖ Kết đo dịch bã chiết cồn 80%, tỉ lệ bã khô/dung môi=20/1 60oC trình bày bảng 3.14 với mẫu chuẩn bị sau: lm ul 50g bã khô chiết cồn 80%, tỉ lệ bã khô/ dung môi 20/1 60oC theo quy z at nh oi trình chiết khảo sát thu 60ml dịch chiết Lấy xác 4ml dịch chiết, thêm vào 5ml Acteonitril Lắc 60 phút với tốc độ dòng 150 vòng/ phút Sau đó, chuyển tồn dịch vào ống ly tâm, tráng bình 1ml nước cất cho vào ống ly tâm Ly tâm với z gm @ tốc độ 5000 vòng/ phút vòng phút Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định mức 10ml (bảo quản -180C) Lọc qua màng PTFE 0,2 µm đo HPLC m co l an Lu n va ac th 50 | P a g e si lu an n va Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu dịch bã chiết etanol Thời gian lưu Diện tích peak 17.461 228.6 19.222 70.3 24.934 322.1 38.085 2043.1 41.372 298.0 z at nh oi 2807.5 p ie gh tn to Bảng 3.14 Kết đo dịch bã chiết cồn 80% Daidzin nl w 49.090 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu với thao tác lắc z ❖ lm ul Genistein nf va Glycitein an Daidzein lu Genistin d oa Glycitin @ m co l gm mục 2.4.2 thể bảng 3.15 hình 3.19 an Lu n va ac th 51 | P a g e si lu an n va Hình 3.19 Sắc ký đồ mẫu bã khơ chiết theo AOAC với thao tác lắc to Diện tích peak 18.014 14.8 Glycitin 19.994 3.10 24.494 9.20 38.570 213.6 41.835 22.40 p ie Thời gian lưu w gh tn Bảng 3.15 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với thao tác lắc Daidzin z at nh oi lm ul 49.457 272.6 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC với quy trình xử lý mẫu phương z ❖ nf va Genistein an Glycitein lu Daidzein d oa nl Genistin @ m co l gm pháp siêu âm kết hợp lắc mục 2.4.2được thể bảng 3.16 hình 3.20 an Lu n va ac th 52 | P a g e si lu an n va Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu bã khô chiết theo AOAC siêu âm kết hợp lắc Diện tích peak 18.072 43.8 19.919 17.6 24.655 33.7 38.597 396.7 41.429 72.9 386.1 p ie Thời gian lưu z at nh oi gh tn to Bảng 3.15 Kết đo mẫu bã khô chiết theo AOAC siêu âm kết hợp lắc Daidzin nl w lm ul Genistein nf va Glycitein an Daidzein lu Genistin d oa Glycitin z gm @ ➢ Nhận xét: 49.506 Kết phân tích cho thấy có ảnh hưởng siêu âm đến kết isoflavone l Mẫu xử lý siêu âm kết hợp lắc cho kết hàm lượng isoflavone cao so m co với mẫu xử lý với thao tác lắc an Lu 3.6 Áp dụng đường chuẩn tính tốn hàm lượng isoflavone bã đậu n va nành ac th 53 | P a g e si ❖ Mẫu dịch cốt bã chiết cồn 80% Hàm lượng isoflavone mẫu tính theo cụng thc: (àg/g) = ì ì 𝑉 (3.1) 𝑚𝑚ẫ𝑢 𝑘ℎơ Trong đó: ▪ CX nồng độ chất phân tích tính theo phương trình hồi quy (µg/ml) ▪ V thể tích dịch chiết (ml) V= 60ml ▪ F hệ số pha loãng Trong trường hợp F=10/4 ▪ mbã khô = 50g ➢ Kết nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy lu an Excel 2016 trình bày bảng 3.16 va n Bảng 3.16 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy tn to CX (µg/ml) p ie gh 11.66 Glycitin 3.68 oa nl w Daidzin 10.83 d Genistin an lu 12.02 z at nh oi Genistein lm ul Glycitein 70.02 nf va Daidzein 72.44 z @ m co l bày bảng 3.17 gm ➢ Kết hàm lượng isoflavone tính theo cơng thức 3.1 Excel 2016 trình an Lu n va ac th 54 | P a g e si Bảng 3.17 Hàm lượng isoflavone Hàm lượng µg/g 34.98 Glycitin 11.60 Genistin 34.09 Daidzein 211.39 Glycitein 36.07 Genistein 217.33 Tổng hàm lượng isoflavone 545.46 lu Daidzin an n va p ie gh tn to Mẫu bã khô chiết theo AOCA với thao tác lắc w ❖ oa nl Hàm lượng isoflavone mẫu tính theo cơng thức: d 𝐶 = 𝐶𝑋 × 𝑚𝑏ã 𝑘ℎơ (3.2) nf va an lu Trong đó: 𝑉 ▪ V thể tích dịch chiết (ml) ▪ m bã khô = 1g z at nh oi lm ul ▪ CX nồng độ chất phân tích tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml) ➢ Kết nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy z m co l gm @ Excel 2016 trình bày bảng 3.18 an Lu n va ac th 55 | P a g e si Bảng 3.18 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy CX (µg/ml) 0.64 Glycitin 0.07 Genistin 0.05 Daidzein 7.12 Glycitein 0.84 Genistein 7.17 lu Daidzin an n va tn to ie gh ➢ Kết hàm lượng isoflavone tính theo cơng thức 3.2 Excel 2016 trình p bày bảng 3.19 oa nl w Bảng 3.19 Hàm lượng isoflavone g bã khô d Hàm lượng µg/g z at nh oi Daidzein 3.51 lm ul Genistin 8.64 nf va Glycitin an lu Daidzin 7.83 102.20 z @ Glycitein 11.34 l gm Genistein 96.80 230.32 an Lu bã khô m co Tổng hàm lượng isoflavone 1g n va ac th 56 | P a g e si ❖ Mẫu bã khô chiết theo AOAC siêu âm kết hợp lắc Hàm lượng isoflavone mẫu tính theo cơng thức: 𝐶 = 𝐶𝑋 × 𝑉 (3.3) 𝑚𝑏ã 𝑘ℎơ Trong đó: ▪ CX nồng độ chất phân tích tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml) ▪ V thể tích dịch chiết (ml) ▪ m bã khô lu ➢ Kết nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy an Excel 2016 trình bày bảng 3.20 va n Bảng 3.20 Nồng độ hợp chất isoflavone tính theo phương trình hồi quy tn to p ie gh CX (µg/ml) 2.13 Glycitin 0.85 d oa nl w Daidzin 0.90 Daidzein 2.89 z at nh oi Genistein 13.42 lm ul Glycitein nf va an lu Genistin 10.09 z ➢ Kết hàm lượng isoflavone tính theo cơng thức 3.3 Excel 2016 trình m co l gm @ bày bảng 3.21 an Lu n va ac th 57 | P a g e si Bảng 3.21 Hàm lượng isoflavone 1g bã khô Hàm lượng µg/g lu an 28.76 Glycitin 14.04 Genistin 19.31 Daidzein 187.11 Glycitein 39.02 Genistein 136.22 n va Daidzin tn to Tổng hàm lượng isoflavone 1g ie gh 424.46 p bã khô d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 58 | P a g e si CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Kết đề tài “Bước đầu xác định sáu hợp chất isoflavone bã đậu nành phương pháp HPLC” cho kết luận sau: Chọn điều kiện phù hợp để tách xác định đồng thời sáu hợp chất isoflavone daidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein, genistein máy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) với detector UV/Vis lu an n va Cột tách: Đường kính 4,6mm - Thể tích vịng mẫu: 10 µl - Bước sóng: 260nm - Pha tĩnh: octadecyl silane liên kết với silicagel (ODS ; C18) - Thành phần pha động: Pha động A : Nước chứa 0,05 % acid phosphoric Pha động B : Acetonitril Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút p - ie gh tn to - Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu – chiết chất tối ưu nl w oa Cân 1.0619g mẫu ẩm (tương đương 1g mẫu khô) cho vào bình tam giác 100ml, d thêm vào 8.5ml Acetonitril Đem siêu âm vịng 10 phút Sau đó, lắc 60 phút với lu nf va an tốc độ 140 vịng/ phút nhiệt độ phịng Chuyển tồn dung dịch vào ống ly tâm dùng 5ml nước cất để tráng bình (nước tráng cho vào ống ly tâm) Ly tâm với tốc lm ul độ 5000 vòng/ phút thời gian phút Cuối cùng, chuyển dịch chiết vào bình định z at nh oi mức 25ml (bảo quản -180C) Lọc qua màng PTFE 0,2 µm đo HPLC Xác định LOD, LQD cho hợp chất isoflavone z 4.2 Đề xuất @ gm Như vậy, với kết thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ co l lặp lại tốt, thích hợp cho việc phân tích đồng thời sáu hợp chất isoflavone mẫu đậu m nành Tơi hi vọng nghiên cứu góp phần vào việc ứng dụng phương chung mẫu đậu nành mẫu hạt bã khác an Lu pháp HPLC để xác định hợp chất isoflavone nói riêng hợp chất khác nói n va ac th 59 | P a g e si TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ”Determination of Total Soy Isoflavones in Dietary Supplements, Supplement Ingredients, and Soy Foods by High-Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Detection: Collaborative Study” Published in final edited form as: J AOAC Int 2008 ; 91(3): 489–500 [2] Griffith AP, Collison MW J Chromatogr A 2001;913:397–413 [3] Lena Jankowiak, Olivera Trifunovic, Remko M Room, Atze J van der Goot (2013), The potential of crude okara for isoflavone production [4] Trương Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ngọc Thư (2016) Nghiên cứu điều kiện chiết lu isoflavone từ bã đậu nành dung mơi ethanol, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển an n va nông thôn, số chuyên đề “Nông nghiệp xanh”, 219-224 tn to [5] Trương Thị Minh Hạnh, Trần Thị Ngọc Thư (2016) Research on conditions for isoflavones extration from okara using ultrasound in combination with conventional gh p ie shaking, Kỷ yếu hội thảo khoa học toàn quốc 2016 “Tiến kỹ thuật thực phẩm kỹ w thuật sinh học: từ nghiên cứu đến sản xuất”, 11/2016, 199-207 oa nl [6] P A Murphy et al/ J Chromatogr B777 (2002) 129–138 d [7] Đỗ Thị Hoa Viên (2004) Quy trình chiết tách phytoestrogen từ đậu tương Báo cáo lu nf va an kết nghiên cứu Đề tài KC 04-17-2004 “Nghiên cứu giải pháp công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức khỏe nhân dân từ nguồn tài lm ul nguyên sinh vật Việt Nam”, 10-16 Sư phạm, 2012 z at nh oi [8] Bùi Xuân Vững, “Lý thuyết sắc kí lỏng hiệu cao, Khoa Hóa” - Trường Đại học z [9] “Comprasion of extraction solvents and techniques used for the assay of isoflavones @ gm from soybean” D.L Luthria et al./Food Chemistry 105 (2007) 325–33 co l [10] “Nghiên cứu số giải pháp nâng cao hiệu suất chuyển hóa isoflavone đậu tương từ dạng glycoside sang dạng aglycone”, Nguyễn Thị Việt Hà, 2012 m an Lu n va ac th 60 | P a g e si [11] Lại Mai Hương CTV (2008),” Nghiên cứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ”, Báo cáo nghiệm thu, Trường Đại học Bách Khoa, TPHCM [12] Kaufman PB, Duke JA, Brielmann H, Boik J, Hoyt JE (1997) “A comparative survey of leguminous plants as sources of the isoflavones genistein and daidzein: Implications for human nutrition and health” J Altern Compl Med 3:7-12 [13] Báo cáo kết đề tài khoa học công nghệ “Bước đầu xác định hàm lượng daidzein, genistein 17 acid amin đậu tương sản phẩm chế biến”, 2007 [14] “Method Development and Validation of Analytical Procedures”, Kapil Kalra, Dev lu Bhoomi Institute of Pharmacy and Research, Dehradun, Uttarakhand, India an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th 61 | P a g e si