(Luận văn) nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm vắc xin vô hoạt nhị giá nd ib phòng bệnh newcastle và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gia cầm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ NHUẬN lu an NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ THỬ NGHIỆM VẮC XIN va n VƠ HOẠT NHỊ GIÁ ND-IB PHỊNG BỆNH NEWCASTLE VÀ p ie gh tn to BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GIA CẦM d oa nl w an 64 01 01 va Mã số: Thú y lu Ngành: ll u nf Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Bùi Trần Anh Đào oi m z at nh TS Trịnh Quang Đại z m co l gm @ an Lu NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu tơi thực Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, tơi thực có giúp đỡ đồng nghiệp Công ty chưa công bố cơng trình khoa học Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận văn lu an va n Trần Thị Nhuận p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Thầy PGS.TS Bùi Trần Anh Đào tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu hồn thành luận văn lu Tơi xin chân thành cảm ơn tới TS Trịnh Quang Đại Ban Giám đốc Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung Ương tồn thể cán cơng nhân viên Nhà máy vắc xin sinh phẩm thú y giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn an n va tn to Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân, bạn bè – người ln tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ vượt qua khó khăn, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn ie gh Hà Nội, ngày tháng năm 2020 p Tác giả luận văn oa nl w d Trần Thị Nhuận ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Trích yếu luận văn .x Thesis abstract xii Phần Mở đầu lu an n va Tính cấp thiết đề tài .1 1.2 Mục tiêu đề tài .2 1.3 Phạm vi nghiên cứu .2 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 tn to 1.1 2.1 p ie gh Phần Tổng quan tài liệu Lịch sử bệnh Newcastle giới w 2.1.1 Giới thiệu chung bệnh Newcastle Lịch sử bệnh Newcastle Việt Nam 2.1.3 Virus gây bệnh Newcastle 2.1.4 Truyền nhiễm học bệnh .10 2.1.5 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Newcastle 10 2.1.6 Phương pháp chẩn đoán bệnh Newcastle 11 2.1.7 Vắc xin phòng bệnh Newcastle 11 2.2 Giới thiệu chung bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm 14 2.2.1 Lịch sử bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm giới 14 2.2.2 Lịch sử bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm Việt Nam 15 2.2.3 Virus gây bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm 15 2.2.4 Truyền nhiễm học bệnh .17 2.2.5 Triệu chứng, bệnh tích bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm .18 2.2.6 Phương pháp chẩn đoán bệnh 18 2.2.7 Vắc xin phòng bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm 19 2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin 20 d oa nl 2.1.2 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si 2.3.1 Trên giới .20 2.3.2 Tại Việt Nam .21 2.4 Những yêu cầu để sản xuất vắc xin vô hoạt nhị giá ND-IB 21 2.4.1 Yêu cầu Chủng giống sản xuất 21 2.4.2 Yêu cầu kháng nguyên .23 2.4.3 Yêu cầu chất bất hoạt 23 2.4.4 Yêu cầu chất bổ trợ 23 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu .26 lu an Địa điểm nghiên cứu 26 3.2 Thời gian nghiên cứu 26 3.3 Đối tượng/vật liệu nghiên cứu 26 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 26 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 26 3.4 Nội dung nghiên cứu 27 n va 3.1 tn to Đánh giá đặc tính sinh học chủng giống để sản xuất vắc xin 27 3.4.2 Xác định liều vắc xin đơn giá 27 p ie gh 3.4.1 Sản xuất thử nghiệm 29 nl w 3.4.4 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB .28 3.4.3 Kiểm nghiệm vắc xin 29 3.4.6 Thử nghiệm vắc xin 29 3.5 Phương pháp nghiên cứu 30 3.5.1 Phương pháp xác định hiệu giá virus ND (LaSota) phản ứng HA d oa 3.4.5 u nf va an lu ll (Haemagglutination) 30 Phương pháp xác định hiệu giá virus ND (LaSota) trứng gà có phơi oi m 3.5.2 3.5.3 z at nh (EID 50 ) .31 Phương pháp xác định số độc lực virus Newcastle não gà 01 z ngày tuổi (ICPI - Intracerebral Pathogenicity Index) 31 @ Phương pháp xác định số độc lực virus Newcastle tiêm tĩnh mạch gm 3.5.4 l gà tuần tuổi (IVPI - Intravenous Pathogenicity Index) 32 Phương pháp xác định hiệu giá virus IB-H120 trứng gà có phơi .32 3.5.6 Phương pháp sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) phôi trứng gà .33 3.5.7 Phương pháp sản xuất kháng nguyên IB (H120) phôi trứng gà 34 m co 3.5.5 an Lu n va ac th iv si 3.5.8 Phương pháp bất hoạt virus ND, IB kiểm tra sau bất hoạt 34 3.5.9 Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ .35 3.5.10 Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin 35 3.5.11 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể kháng virus ND huyết gà sau sử dụng vắc xin phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI (haemagglutination inhibition) 38 3.5.12 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể kháng virus IB huyết gà sau sử dụng vắc xin phản ứng ELISA 40 3.5.13 Phương pháp xử lý số liệu 40 Phần Kết thảo luận 41 lu an Kết Khảo sát đặc tính sinh học chủng giống để sản xuất vắc xin 41 4.1.1 Kết Khảo sát đặc tính sinh học giống Virus ND (chủng LaSota) 41 4.1.2 Kết khảo sát đặc tính sinh học giống virus IB-H120 44 4.2 Kết xác định liều vắc xin đơn giá 48 n va 4.1 tn to Kết sản xuất kháng nguyên ND (LaSota) IB-H120 .48 4.2.2 Kết lựa chọn chất bất hoạt virus 49 p ie gh 4.2.1 Kết xác định hàm lượng kháng nguyên có liều vắc xin 4.2.3 nl w đơn .51 Kết Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB 57 4.3.1 Kết phối trộn nghiệm thức vắc xin vô hoạt 57 4.3.2 Kết đánh giá nghiệm thức vắc xin động vật thí nghiệm 58 4.3.3 Kết nghiên cứu Quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB với chất d oa 4.3 u nf va an lu ll bổ trợ dầu 58 Kết kiểm nghiệm vắc xin vô hoạt ND-IB 60 4.4.1 Kết kiểm tra cảm quan, tiêu vật lý 60 4.4.2 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin vô hoạt ND-IB 61 4.4.3 Kết kiểm tra an toàn 61 4.4.4 Kết kiểm tra hiệu lực 62 4.5 Kết thử nghiệm vắc xin vô hoạt ND-IB Công ty Cổ phần Thuốc oi m 4.4 z at nh z l gm @ m co thú y Trung Ương 63 an Lu n va ac th v si Phần Kết luận kiến nghị .66 5.1 Kết luận 66 5.1.1 Đặc tính sinh học chủng giống sản xuất vắc xin 66 5.1.2 Xác định liều vắc xin đơn giá .66 5.1.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB .66 5.1.4 Sản xuất thử nghiệm 66 5.1.5 Kiểm nghiệm vắc xin 66 5.1.6 Thử nghiệm vắc xin 67 5.2 Đề nghị .67 Tài liệu tham khảo 68 lu Phụ lục 72 an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT lu an n va Nghĩa đầy đủ ARN : Acid ribonucleic CEF : Chicken embryo fibroblast CEK : Chicken embryo kidney CK : Chicken kidney CPE : Cytopathic Effect EID 50 : 50% Egg Infective Doses ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent assay FAO : Food and Agriculture Organization HA : Hemagglutination Assay HI : Haemagglutination inhibition p ie gh tn to Chữ viết tắt IB : Infectious Bronchitis : Infectious Bronchitis Virus d oa ICPI nl w IBV : Intracerebral Pathogenicity Index an lu : Intravenous Pathogenicity Index MDT : Mean Dead Time ND : Newcastle Disease NDV : Newcastle Disease Virus PBS : Phosphate Buffered Saline ll u nf va IVPI oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC BẢNG lu an n va Nghiệm thức phối trộn vắc xin 29 Bảng 3.2 Sơ đồ thực phản ứng HA .30 Bảng 3.3 Xác định số ICPI 32 Bảng 3.4 Xác định số IVPI 32 Bảng 3.5 Sơ đồ thực phản ứng HI (haemagglutination inhibition) .39 Bảng 4.1 Kết xác định hiệu giá virus ND chủng LaSota qua tiếp đời 41 Bảng 4.2 Kết xác định hiệu giá virus Newcastle chủng LaSota 42 Bảng 4.3 Kết số độc lực ICPI virus LaSota gà ngày tuổi .43 Bảng 4.4 Kết số độc lực IVPI virus LaSota gà tuần tuổi .44 Bảng 4.5 Kết theo dõi tình trạng phơi gà sau gây nhiễm virus IB-H120 .45 Bảng 4.6 Kết xác định hiệu giá giống IB- H120 đời 46 Bảng 4.7 Kết tổng hợp hiệu giá giống virus IB-H120 qua tiếp đời .47 Bảng 4.8 Kết EID 50 giống IB- H120 lần 48 Bảng 4.9 Kết sản xuất kháng nguyên LaSota IB-H120 49 p ie gh tn to Bảng 3.1 w Bảng 4.10 Kết kiểm tra virus sau bất hoạt phôi trứng 50 oa nl Bảng 4.11 Kết kiểm tra tính đáp ứng miễn dịch virus sau vơ hoạt gà d thí nghiệm D21 .50 lu an Bảng 4.12 Kết kiểm tra virus ND (LaSota) thang liều sau bất hoạt va phôi trứng .51 ll u nf Bảng 4.13 Kết kiểm tra virus IB-H120 thang liều sau bất hoạt phôi m trứng .52 oi Bảng 4.14 Kết kiểm tra vắc xin đơn hiệu giá kháng nguyên sau phối z at nh trộn với nhũ dầu 52 Bảng 4.14 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc xin đơn thang liều sau z @ phối trộn với chất bổ trợ dầu 53 l gm Bảng 4.15 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus ND (LaSota) phương pháp HI 53 m co Bảng 4.16 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể IBV phương pháp Elisa 54 an Lu Bảng 4.17 Kết kiểm tra vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu 55 n va ac th viii si Bảng 4.18 Kết kiểm tra tiêu an toàn vắc xin đơn sau phối trộn với chất bổ trợ dầu .55 Bảng 4.19 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể LaSota phương pháp HI .56 Bảng 4.20 Kết đánh giá hiệu lực bảo hộ vắc xin LaSota vô hoạt 56 Bảng 4.21 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus IB .57 Bảng 4.22 Kết kiểm tra nghiệm thức sau phối trộn loại kháng nguyên với chất bổ trợ dầu .57 Bảng 4.23 Kết đánh giá nghiệm thức động vật thí nghiệm 58 Bảng 4.24 Kết sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB quy mơ phịng thí nghiệm 60 Bảng 4.25 Kết kiểm tra vắc xin vô hoạt ND-IB sau phối trộn 60 lu Bảng 4.26 Kết kiểm tra vô trùng lô vắc xin vô hoạt ND-IB 61 an Bảng 4.27 Kết kiểm tra độ an tồn vắc xin vơ hoạt ND-IB .62 n va Bảng 4.28 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin vô hoạt ND-IB 63 tn to Bảng 4.29 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể (HI, ELISA) gà sau sử p ie gh dụng vắc xin vô hoạt ND-IB 65 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ix si 4.3.3.2 Kết sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB quy mơ phịng thí nghiệm Trong sản xuất vắc xin vô hoạt, việc lựa chọn chất bổ trợ phù hợp đem lại hiệu sử dụng động vật mang ý nghĩa quan trọng Chúng sử dụng chất bổ trợ nhũ dầu Montanide ISA 71RVG công ty Seppic cung cấp, tỷ lệ 60:40, quy mô sản xuất từ 2000-3000 liều Kết trình bày qua bảng 4.25 Bảng 4.25 Kết sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB quy mơ phịng thí nghiệm Ngày SX Chất bổ trợ Số lượng Số liều 02/01/2020 Dầu Montanide 1000ml 2000 10/01/2020 Dầu Montanide 1500ml 3000 05/02/2020 Dầu Montanide 1500ml 3000 Lô VX lu an n va 4.4.1 Kết kiểm tra cảm quan, tiêu vật lý gh tn to 4.4 KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM VẮC XIN VÔ HOẠT ND-IB p ie Trong nghiên cứu này, lô vắc xin vô hoạt thực lấy 07 mẫu (lọ 20ml) để kiểm tra tiêu Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.26 nl w Bảng 4.26 Kết kiểm tra vắc xin vô hoạt ND-IB sau phối trộn Chỉ tiêu oa Tiêu chuẩn d Stt Kết kiểm tra Vắc xin màu trắng sữa, 3/3 lô Vắc xin màu trắng va an lu kiểm tra Cảm quan sữa, đồng nhất, khơng phân lớp, khơng đơng vón, lớp, khơng đơng vón, không ll u nf đồng nhất, không phân m khơng lắng cặn, khơng lắng cặn, khơng có dị vật oi Độ nhớt 30-45 mPa.s Lô 01: 42 mPa.s Lô 02: 40 mPa.s z z at nh có dị vật “Pha nước” đồng 3/3 lô vắc xin không bị phân hóa với nhau, khơng bị lớp an Lu phân lớp m co Độ ổn định l gm @ Sau li tâm “Pha dầu” Lô 03: 40 mPa.s n va ac th 60 si Với số liệu bảng 4.26 cho thấy 03/03 lô vắc xin màu trắng sữa, đồng nhất, không phân lớp, không đơng vón, khơng lắng cặn, khơng có dị vật, khơng bị phân lớp; độ nhớt dao động 40 – 42 mPa.s nằm giới hạn cho phép 4.4.2 Kết kiểm tra vô trùng vắc xin vô hoạt ND-IB Vắc xin kiểm tra theo tiêu chuẩn TCVN 8684: 2011 Mỗi loại môi trường kiểm tra ống, mẫu kiểm tra 1-2% dung tích mơi trường Các loại môi trường kiểm tra theo dõi ngày 370C, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng (250C-300C) Vắc xin đạt tiêu chuẩn vô trùng sau 7-10 ngày theo dõi khơng có vi khuẩn, nấm mốc mọc môi trường kiểm tra lu Đối với môi trường thạch nấm, đọc kết sau 14 ngày.Kết kiểm tra vơ trùng trình bày bảng 4.27 an va n Bảng 4.27 Kết kiểm tra vô trùng lô vắc xin vô hoạt ND-IB to tn ống gh Thạch máu PPLO TSB Sabouraud - Marconkey an d oa nl w tra Thạch Thioglycollate lu xin Thạch kiểm p ie Vắc Kết kiểm tra vô trùng Số Lơ va Ghi chú: âm tính ll u nf Kết kiểm tra cho thấy: Trong thời gian theo dõi, 06 loại môi trường sử dụng cho lô vắc xin Kết kiểm tra mơi trường khơng có vi khuẩn mọc, điều chứng tỏ 03 lơ vắc xin đảm bảo vô trùng oi m z at nh 4.4.3 Kết kiểm tra an toàn z Chỉ tiêu an toàn không gây phản ứng nghiêm trọng động vật sử dụng điều quan trọng đỗi với loại vắc xin Để kiểm tra an toàn, sử dụng gà 21 ngày tuổi, tiêm cho gà 02 liều vắc xin vào ngực, theo dõi gà tiêm vắc xin thời gian tuần Gà đối chứng không sử dụng vắc xin nuôi cách ly với khu thí nghiệm Kết trình bày bảng 4.28 m co l gm @ an Lu n va ac th 61 si Bảng 4.28 Kết kiểm tra độ an tồn vắc xin vơ hoạt ND-IB Thí nghiệm Lơ thí nghiệm Lơ Đối chứng Các tiêu Lô Lô Lô Gà thí nghiệm (con) 10 10 10 10 Lứa tuổi (ngày) 21 21 21 21 Liều lượng sử dụng (liều) 2 Không sử theo dõi dụng vắc xin Đường sử dụng lu an va Tiêm bắp Tiêm bắp Tiêm bắp Thời gian theo dõi (ngày) 21 21 21 21 Số gà sống (con) 10 10 10 10 Tỷ lệ sống (%) 100 100 100 100 Khỏe mạnh Khỏe mạnh Khỏe Khỏe mạnh n Biểu lâm sàng to tn mạnh Phản ứng cục tồn Khơng Khơng Khơng ie gh Không p thân d oa nl w Kết theo dõi tiêu an toàn lô vắc xin gà 21 ngày tuổi cho thấy: Tồn gà thí nghiệm dùng liều vắc xin vào lúc 21 ngày tuổi theo đường tiêm bắp với 10 gà đối chứng không sử dụng vắc xin khỏe mạnh, phát triển bình thường khơng có biểu lâm sàng bệnh Newcastle bệnh IB Tất gà lơ thí nghiệm không xảy phản ứng viêm cục tồn thân Như vậy, 03 lơ vắc xin sản xuất nói đạt tiêu an tồn gà thí nghiệm ll u nf va an lu oi m 4.4.4 Kết kiểm tra hiệu lực z at nh Có phương pháp kiểm tra hiệu lực vắc xin: phương pháp trọng tài (công cường độc) phương pháp thay (huyết học) Trong nghiên cứu này, kiểm tra hiệu lực vắc xin sử dụng phương pháp thay z @ m co l gm Chúng tiến hành kiểm tra hiệu lực 03 lô vắc xin vô hoạt nhũ dầu gà tuần tuổi chưa miễn dịch sở vắc xin Newcastle vắc xin viêm phế quản truyền nhiễm an Lu Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin vơ hoạt ND-IB trình bày bảng 4.29 n va ac th 62 si Bảng 4.29 Kết kiểm tra hiệu lực vắc xin vô hoạt ND-IB Lô Đối chứng Thí nghiệm Các tiêu theo dõi Lơ thí nghiệm Lơ Lơ Lơ Gà thí nghiệm (con) 10 10 10 10 Lứa tuổi (ngày) 21 21 21 21 Liều lượng sử dụng (liều) 1 Không sử dụng vắc xin Tiêm bắp Tiêm bắp Tiêm bắp 21 21 21 Đường sử dụng Thời gian theo dõi (ngày) Biểu lâm sàng 21 lu Gà khỏe Gà khỏe Gà khỏe mạnh, phát mạnh, phát mạnh, phát triển bình triển bình triển bình thường thường thường an n va Gà mạnh, triển thường khỏe phát bình 9.3 9.0 9.0 1.3 Hiệu giá kháng thể IB S/p trung bình (ELISA) 0.75 0.76 0.75 0.14 Tỷ lệ gà (HI ≥ 1:16; ELISA: dương tính) (% 90 90 90 10 p ie gh tn to Hiệu giá kháng thể ND trung bình (GMT ) oa nl w d Với số liệu bảng 4.29, cho thấy có 90% gà có hiệu giá HI ≥ 1:16 (kháng thể lu an kháng virus Newcastle); ELISA (s/p ≥0.2): dương tính (kháng thể kháng virus u nf va IB), chứng tỏ vắc xin có đáp ứng miễn dịch gà tương đối tốt ll 4.5 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM VẮC XIN VÔ HOẠT ND-IB TẠI CÔNG oi m TY CỔ PHẦN THUỐC THÚ Y TRUNG ƯƠNG z at nh Sau kiểm tra chất lượng vắc xin đạt yêu cầu tiêu: vơ trùng, an tồn, hiệu lực; chúng tơi tiến hành thử nghiệm vắc xin đàn gà thí nghiệm z với quy mơ nhỏ Cơng ty Cổ phần Thuốc thú y Trung Ương @ gm Mục đích thử nghiệm vắc xin nhằm đánh giá đáp ứng miễn dịch, phản l ứng phụ không mong muốn xảy điều kiện chăn nuôi thông thường m co Hai đàn gà tuần tuổi (Lương Phượng trắng gà Ai cập), đàn 100 an Lu con, 50 miễn dịch sở 50 chưa miễn dịch sở n va ac th 63 si Lô thí nghiệm 1: 50 gà Lương Phượng chưa miễn dịch sở Lơ thí nghiệm 2: 50 gà Lương Phượng miễn dịch sở Lô thí nghiệm 3: 50 gà Ai Cập chưa miễn dịch sở Lơ thí nghiệm 4: 50 gà Ai Cập miễn dịch sở Gà nuôi khu vực riêng biệt khu chăn ni động vật thí nghiệm phạm vi Cơng ty với điều kiện chăm sóc, ni dưỡng, điều kiện chuồng nuôi Trước sử dụng vắc xin, tiến hành lấy máu, kiểm tra kháng thể kháng virus Newcastle phản ứng HI, kiểm tra kháng thể kháng virus IB phản ứng ELISA lu an n va ie gh tn to Khi gà 21 ngày tuổi, tiến hành sử dụng vắc xin theo đường tiêm bắp, liều vắc xin theo quy định Sau sử dụng vắc xin, thời điểm 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 ngày; bắt ngẫu nhiên lô 20 con, chắt lấy huyết thanh, kiểm tra kháng thể kháng virus Newcastle phản ứng HI, kiểm tra kháng thể kháng virus IB phản ứng ELISA p Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.30 oa nl w Theo kết bảng 4.30, xác định tỷ lệ gà sống lơ thí nghiệm theo thứ tự 96%, 96%, 98% 100% d Ở giống gà có chênh lệnh rõ rệt hiệu giá kháng thể kháng virus Newcaste virus IB gà miễn dịch sở tiêm vắc xin gà chưa miễn dịch sở từ thời điểm 14 ngày đến 56 ngày sau tiêm vắc xin va an lu ll u nf Cả lơ thí nghiệm, gà sau sử dụng vắc xin, hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle IB tăng dần đạt cao thời điểm 42 ngày sau sử dụng vắc xin, lơ thí nghiệm hàm lượng kháng thể kháng virus Newcastle là: 7,2 log2; 8,3 log2; 7,3 log2; 8,1 log2 Sau hàm lượng kháng thể lô giảm dần oi m z at nh z m co l gm @ Về độ dài miễn dịch vắc xin, kiểm tra biến động kháng thể newcastle IB gà 21 ngày tuổi tiêm mũi vắc xin, sau tháng hiệu giá kháng thể newcastle IB đạt ngưỡng bảo hộ gà miễn dịch sở gà chưa miễn dịch sở an Lu n va ac th 64 si lu an va n Bảng 4.30 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể (HI, ELISA) gà sau sử dụng vắc xin vô hoạt ND-IB to tn Thí nghiệm Lơ Thí nghiệm Lơ Thí nghiệm Lơ Thí nghiệm Lơ Thí nghiệm 50 48 96 20 2,70 ± 0,15 0,05 ± 0,01 5,20 ± 0,19 0,32 ± 0,11 6,40 ± 0,19 0,51 ± 0,11 6,80 ± 0,18 0,72 ± 0,18 6,70 ± 0,18 0,95 ± 0,10 50 48 96 20 5,30± 0,21 0,25 ± 0,10 5,80± 0,17 0,55 ± 0,13 7,20± 0,17 0,75 ± 0,15 7,90± 0,25 0,85 ± 0,16 7,90± 0,25 1,23 ± 0,13 50 49 98 20 1,40± 0,12 0,06 ± 0,02 4,90 ± 0,14 0,32 ± 0,10 6,20± 0,16 0,48 ± 0,13 6,90 ± 0,12 0,71 ± 0,12 6,50 ± 0,24 0,93 ± 0,16 50 50 100 20 4,70± 0,26 0,25 ± 0,15 5,7± 0,16 0,56 ± 0,12 7,10± 0,21 0,79 ± 0,12 7,70± 0,22 0,86 ± 0,15 7,80± 0,26 1,22 ± 0,12 7,20 ± 0,15 1,02± 0,15 6,80 ± 0,14 0,94 ± 0,09 6,50 ± 0,12 0,75 ± 0,05 8,30± 0,26 1,31 ± 0,18 7,60± 0,36 1,02 ± 0,15 7,30± 0,24 0,95 ± 0,14 7,30 ± 0,11 1,02 ± 0,15 6,70 ± 0,22 0,92 ± 0,08 6,30 ± 0,21 0,71 ± 0,02 8,10± 0,23 1,31 ± 0,18 7,40± 0,21 1,01 ± 0,13 7,10± 0,14 0,93 ± 0,16 p ie gh Các tiêu theo dõi d oa nl w Gà thí nghiệm (con) Số gà sống (con) Tỷ lệ sống (%) Số mẫu lần kiểm tra kháng thể Hiệu giá kháng thể trước sử ND (log2) dụng vắc xin IB (s/p trung bình) Sau sử dụng vắc xin 14 ngày ND (log2) IB (s/p trung bình) Sau sử dụng vắc xin 21 ngày ND (log2) IB (s/p trung bình) Sau sử dụng vắc xin 28 ngày ND (log2) IB (s/p trung bình) Sau sử dụng vắc xin 35 ngày ND (log2) IB (s/p trung bình) ll fu an nv a lu oi m z at nh m o l.c gm Sau sử dụng vắc xin 56 ngày @ Sau sử dụng vắc xin 49 ngày ND (log2) IB (s/p trung bình) ND (log2) IB (s/p trung bình) ND (log2) IB (s/p trung bình) z Sau sử dụng vắc xin 42 ngày an Lu n va ac th 65 si PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Đặc tính sinh học chủng giống sản xuất vắc xin - Đặc tính sinh học giống virus Newcastle chủng LaSota dùng để sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB thích nghi trứng gà có phơi, ổn định qua đời cấy chuyển; hiệu giá virus giống 108,5/0,1ml, số độc lực virus tiêm não gà ngày tuổi ICPI = 0,175; số gây chết gà tiêm tĩnh mạch gà tuần tuổi IVPI = lu - Đặc tính sinh học giống virus IB chủng H120 dùng để sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB ổn định qua đời cấy chuỷen, thích nghi trứng gà có phơi, hiệu giá virus giống 105,68/0,1ml an 5.1.2 Xác định liều vắc xin đơn giá n va gh tn to - Chất bất hoạt tối ưu sử dụng sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB formalin, 0,2% Vắc xin phối trộn với chất bổ trợ dầu (Montanide ISA 71RVG (Seppic) p ie - Nồng độ kháng nguyên có liều vắc xin LaSota: 108EID 50 /liều, nồng độ kháng nguyên có liều vắc xin IB-H120: 106EID 50 /liều nl w 5.1.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin vô hoạt ND-IB d oa - Lựa chọn nghiệm thức cho kết tối ưu dùng để phối trộn vắc xin vô hoạt dựa kết đánh giá nghiệm thức phối trộn vắc xin với chất bổ trợ dầu Liều virus sử dụng phối trộn vắc xin 8.105 EID 50 /liều virus IB-H120 16.107 EID 50 /liều kháng nguyên virus Newcastle chủng Lasota u nf va an lu ll - Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin vơ hoạt ND-IB quy mơ phịng thí nghiệm oi m z at nh 5.1.4 Sản xuất thử nghiệm - Sản xuất 03 lô vắc xin vô hoạt nhũ dầu ND-IB quy mô 2000-3000 liều z @ 5.1.5 Kiểm nghiệm vắc xin m co l gm - lô vắc xin nhũ dầu phòng bệnh Newcastle bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm đạt tiêu chuẩn vô trùng, tiêu vật lý, an toàn gà tuần tuổi với liều gấp đôi liều quy định an Lu - Cả lô vắc xin đạt tiêu chuẩn hiệu lực, vắc xin bảo hộ 90% bệnh Newcastle viêm phế quản truyền nhiễm gà tuần tuổi n va ac th 66 si 5.1.6 Thử nghiệm vắc xin - Vắc xin thử nghiệm diện hẹp thưc gà tuần tuổi có miễn dịch sở chưa có miễn dịch sở, sau 56 ngày sử dụng vắc xin bảo hộ với bệnh Newcastle viêm phế quản truyền nhiễm 5.2 ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu thêm việc sử dụng vắc xin vô hoạt ND-IB cho lứa tuổi khác nhau, nghiên cứu độ dài miễn dịch gia cầm sử dụng vắc xin - Tiếp tục hoàn thiện triển khai thử nghiệm vắc xin nước loại để so sánh, đánh giá chất lượng vắc xin sản xuất nước với vắc xin nhập ngoại - Tiến hành triển khai thử nghiệm vắc xin diện rộng lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 67 si TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Garib S O., Gruys E., Gielkens A L J & Koch G (2003) Detection of antibodyforming cells directed against Newcastle disease virus and their immunoglobulin class by double immunoenzyme histochemistry Aldous E W., Mynn J K., Banks J & Alexander D J (2003) A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene Avian Pathol 32: 239-256 Alexander D J (1988) Newcastle Disease Virus — an Avian Paramyxovirus Newcastle Disease Developments in Veterinary Virology 8: 11-22 lu an n va Bùi Trần Anh Đào (1999) Kiểm soát cảm nhiễm virus gây bệnh Newcastle, Gumboro viêm phế quản truyền nhiễm gà thịt Hiệu phịng bệnh hiệu kinh tế chương trình vaccin phịng bệnh thành phố Hồ Chí Minh Luận văn thạc sĩ, Khoa sau đại học, Đại học Nông lâm TPHCM p ie gh tn to Bùi Ngọc Anh (2013) Nghiên cứu xác định độc lực số chủng biến chủng virus Newcastle lưu hành số tỉnh phía Bắc Việt Nam Đề tài nghiên cứu cấp Bộ, 06/2012 - 12/2013 w d oa nl Cavanagh D., Davis P J & Mockett, A.P (1988) Amino acids within hypervariable region of avian coronavirus IBV (Massachusetts serotype) spike glycoprotein are associated with neutralization epitopws Virus Res 11: 141-150 an lu u nf va Cavanagh D., Davis P J & Cook J K (1992) Infectious bronchitis virus: evidence for recombination within the Massachusetts serotype Avian Pathology 21(3): 401-408 ll Cumming, R.B (1970) Avian infectious bronchitis Adv.vet.Sci.Comp.Med.14: 105-148 m oi Czegledi A., Ujvari D., Somogyi E., Wehmann E., Werner O & Lomniczi B (2006) Third genome size category of avian paramyxovirus serotype (Newcastle disease virus) and evolutionary implications Virus Res 120: 36-48 z at nh z Diel D G., Da Silva L H., Liu H., Wang Z., Miller P J & Afonso C L (2012) Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: proposal for a unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes Infect Genet Evol 12: 1770-1779 m co l gm @ an Lu Eck J.H.H (1983) Effects of experimental infection of fowl with EDS 76 virus, infectious bronchitis virus, and/or fowl adenovirus on laying performane Vet Q 5: 11-25 n va ac th 68 si Kim L M., King D J., Curry P E., Suarez D L., Swayne D E., Stallknecht D E., Slemons R D., Pedersen J C., Senne D A., Winker K & Afonso C L (2007) Phylogenetic diversity among low-virulence newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates J Virol 81: 12641-12653 Liang R., Cao D J., Li J Q., Chen J., Guo X., Zhuang F F & Duan M X (2002) Newcastle disease outbreaks in western China were caused by the genotypes VIIa and VIII Vet Microbiol 87: 193-203 Lindblad E (2004) Aluminium adjuvants in retrospect and prospect Vaccine 22: 3658-3668 lu Loke C F., Omar A R., Raha A R & Yusoff K (2005) Improved protection from velogenic Newcastle disease virus challenge following multiple immunizations with plasmid DNA encoding for F and HN genes Vet Immunol Immunopathol 106: 259-267 an n va gh tn to Mai Hồng Việt (1999) Thử nghiệm quy trình phịng bệnh cho gà vắc xin Niucatxơn chịu nhiệt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 6(4): 41-47 p ie Maminiaina O F., Gil P., Briand F X., Albina E., Keita D., Andriamanivo H R., Chevalier V., Lancelot R., Martinez D., Rakotondravao R., Rajaonarison J J., Koko M., Andriantsimahavandy A A., Jestin V & Servan d A (2010) Newcastle disease virus in Madagascar: identification of an original genotype possibly deriving from a died out ancestor of genotype IV PLoS One 5: e13987 d oa nl w an lu ll u nf va Miller P J., Haddas R., Simanov L., Lublin A., Rehmani S F., Wajid A., Bibi T., Khan T A., Yaqub T., Setiyaningsih S & Afonso C L (2015) Identification of new sub-genotypes of virulent Newcastle disease virus with potential panzootic features Infect Genet Evol 29: 216-229 oi m z at nh Nagy E., Krell P J., Dulac G C & Derbyshire J B (1991) Vaccination against Newcastle disease with a recombinant baculovirus hemagglutinin-neuraminidase subunit vaccine Avian Dis 35: 585-590 z gm @ Nguyễn Bá Hiên (2013) Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 376-386 m co l Nguyễn Bá Huệ, Nguyễn Thu Hồng & Trần Thị Hường (1980) Các chủng vi-rút cường độc Niu-cát-xơn gây vụ dịch lớn xí nghiệp nước ta hướng phòng bệnh Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y 1968-1978 Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 19-30 an Lu n va ac th 69 si Nguyễn Thị Phương Duyên, Thân Thị Hạnh & Đỗ Văn Khiên (1988) Kết sản xuất thử nghiệm vắc xin Niucátxơn chịu nhiệt khu vực miền Trung Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 5(4): 43-48 Nguyễn Thu Hồng (1990) Kết nghiên cứu sử dụng vắc xin thích hợp phịng bệnh Niu-cát-xơn sở chăn nuôi tập trung Việt Nam Kết nghiên cứu Khoa học kỹ thuật Thú y 1985 -1989 80-85 Nguyễn Thu Hồng, Nguyễn Thị Yên Hưng & Nguyễn Thúy Duyên (1998) Nghiên cứu lịch sử sử dụng vắc xin V4 phòng bệnh Niucatxơn cho gà chăn ni tập trung Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 5(1): 52-60 Oie (2008) Avian Infectious Bronchitis, chapter Oie (2015) Newcastle disease Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2015, OIE Terrestrial Manual 2012, Chapter 2.3.14 lu an Phan Văn Lục (1994) Một số đặc điểm dịch tễ bệnh Newcastle lịch vắc-xin phịng bệnh thích hợp cho sở chăn ni gà công nghiệp Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam n va p ie gh tn to Razmarai N., Toroghi R., Babaei H., Khalili I., Sadigh-Eteghad S & Froghy L (2012) Immunogenicity of commercial, formaldehyde and binary ethylenimine inactivated Newcastle disease virus vaccines in specific pathogen free chickens Archives of Razi Institute 67(1): 21-25 d oa nl w Roussan D A., Khawaldeh G Y & Shaheen I A (2009) Infectious bronchitis virus in Jordanian chickens: Seroprevalence and detection The Canadian Veterinary Journal 50: 77-80 lu u nf va an Seyfi A S., M.R.,, Mayahi M., Assasi K & Charkhkar S (2004) A survey of the prevalence of infectious bronchitis virus type 4/91 in Iran Acta Vet Hung 52(2): 163-166 ll Sherif N A Y (2005) Determination of formalin in animal and poultry inactivated vaccines using different methods Beni-Suef Vet Med J 15(2): 34-39 oi m z at nh Shimazaki Y., Horiuchi T., Harada M., Tanimura C., Seki Y., Kuroda Y., Yagyu K., Nakamura S & Suzuki S (2008) Isolation of 4/91 type of infectious bronchitis virus as a new variant in Japan and efficacy of vaccination against 4/91 type field isolate Avian Diseases 52: 618-622 z @ m co l gm Tsai H J., Chang K H., Tseng C H., Frost K M., Manvell R J & Alexander D J (2004) Antigenic and genotypical characterization of Newcastle disease viruses isolated in Taiwan between 1969 and 1996 Vet Microbiol 104: 19-30 an Lu Trần Đình Từ (1996) Nghiên cứu phát triển vắc xin chịu nhiệt phòng bệnh Newcastle Kết nghiên cứu Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 1994-1995 Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 119-146 n va ac th 70 si Trần Đình Từ (2005) Nghiên cứu phát triển Vắc xin Niucatxon chịu nhiệt Công ty thuốc Thú y TƯ2 Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 12(4): 98-99 Trần Ngọc Bích, Nguyễn Phúc Khánh & Nguyễn Tấn Rõ (2016) So sánh khả truyền kháng thể thụ động từ gà mẹ sang gà giống gà thả vườn vắc xin phòng bệnh Newcastle Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 23(3): 50-54 Trần Thanh Vân (1996) Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng biến chủng gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tỉ lệ chết sản xuất trứng đàn gà bố mẹ giống thịt Hubbard High - Yield Luận văn thạc sĩ, Khoa sau đại học, Trường Đại học Nông lâm TPHCM Trần Văn Hà (2004) Học tập kinh nghiệm "5 điều kết ước phòng toi" (Niucatxon) để ngăn ngừa dịch cúm gà Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y 11(22): 93-94 lu Võ Thị Trà An, Nguyễn Thị Kim Yến & Hồ Hoàng Dũng (2012) Phân lập, xác định serotype virus viêm phế quản truyền nhiễm từ gà thịt Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y an n va gh tn to Winterfield R W & Hitchner S B (1962) Etiology of an infectious nephritisnephrosis syndrome of chickens Am J Vet Res 23: 1273-1279 p ie Wit J J S d., Cook J K A & Van Der Heijden H M J F (2011) Infectious bronchitis virus variants: a review of the history, current situation and control measures Avian Pathology 40(3): 223-235 w d oa nl Yu L., Wang Z., Jiang Y., Chang L & Kwang J (2001) Characterization of newly emerging Newcastle disease virus isolates from the People's Republic of China and Taiwan J Clin Microbiol 39: 3512-3519 lu ll u nf va an Zhu J., Hu S., Xu H., Liu J., Zhao Z., Wang X & Liu X (2016) Characterization of virulent Newcastle disease viruses from vaccinated chicken flocks in Eastern China BMC Vet Res 12: 113 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 71 si PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vắc xin vô hoạt ND-IB lu an n va Thực gây nhũ vắc xin máy đồng H120 hóa IKA p ie gh tn to Bệnh tích phơi nhiễm vi rút IB – d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Sản xuất kháng nguyên trứng gà có phơi n va ac th 72 si lu an n va Đọc kết phản ứng HI p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co an Lu n va ac th 73 l gm @ Đọc kết phản ứng ELISA si lu an n va p ie gh tn to Thử nghiệm vắc xin gà d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Lô Gà đối chứng z m co l gm @ an Lu n va ac th 74 si