Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft Word NCsanxuatcacsanphamhuyetuong 25 02 2008 doc Bé khoa häc c«ng nghÖ Bé y tÕ B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi nghiªn cøu khoa häc ®éc lËp cÊp nhµ n−íc nghiªn cøu quy tr×nh s¶n xuÊt vµ chuÈn ho¸ c¸c[.]
Bé khoa häc c«ng nghƯ - Bé y tÕ - B¸o c¸o tỉng kÕt Đề tài nghiên cứu khoa học độc lập cấp nhà nớc nghiên cứu quy trình sản xuất chuẩn hoá sản phẩm huyết tơng đạt tiêu chuẩn quốc tế sử dụng cho điều trị Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH đỗ trung phấn Cơ quan chủ trì : Viện Hut häc - trun m¸u tw viƯn tr−ëng: pgs.ts ngun anh trí Cơ quan chủ quản : Bộ y tế 6832 14/5/2008 Hà Nội, 12/ 2007 lời cảm ơn Thay mặt tập thể nhóm nghiên cứu, xin chân thành cảm ơn: - Cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ (KHCN), Bộ Y tế đà ủng hộ tạo điều kiện để hoàn thành đề tài Đây đề tài cấp nhà nớc thứ làm chủ nhiệm tập thể Viện HHTM Trung ơng thực - Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Bệnh viện Bạch Mai GS.TS Trần Quy - Nguyên bệnh viện trởng giai đoạn đầu 2001 - 2003; BGĐ PGS.TS Nguyễn Anh Trí - Viện trởng Viện HHTM Trung ơng đà giúp đỡ tạo điều kiện cho hoàn thành nội dung đề tài Viện HHTM Trung ơng Bệnh viện Bạch Mai - Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Trung tâm Bảo quản mô ghép Đại học Y Hà Nội đà tạo điều kiện để đề tài thực đông khô sản phẩm huyết tơng đạt kết - Xin chân thành cảm ơn BGĐ Bệnh viện Nhi Trung ơng đà ủng hộ tạo điều kiện để Khoa Hoá sinh Huyết học tham gia nghiên cứu chúng tôi, với trách nhiệm giám sát chất lợng sản phẩm - Xin chân thành cảm ơn BGĐ Khoa Truyền nhiễm - Học viện Quân y đà tạo điều kiện để đánh giá tác dụng hỗ trợ huyết tơng giàu antiHBs điều trị bệnh nhân viêm gan cấp có kết - Sau xin chân thành cảm ơn toàn thể cán công nhân viên, ngời cho máu tình nguyện Viện HHTM Trung ơng đà nhiệt tình, với trách nhiệm cao đà hoàn thành đề tài có kết Đề tài đà đem lại cho Viện HHTM số trang bị, quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm huyết tơng, kiến thức tay nghỊ cđa sè c¸n bé - KTV trùc tiÕp tham gia thực đề tài Chúng coi sở vật chất quý giá để phát triển đề tài tơng lai Hà Nội, ngày 28/12/2007 Thay mặt tập thể nhóm nghiên cứu GS.TSKH.NGND Đỗ Trung Phấn Các thành viên tham gia nghiên cứu thuộc đề tài nghiên cứu sản xuất sản phẩm huyết tơng (Giai đoạn 2004 - 2007) Chủ nhiệm đề tài: GS.TSKH Đỗ Trung Phấn Th ký đề tài: ThS Phạm Tuấn Dơng Các thành phần tham gia nghiên cứu: gồm nhóm sau đây: Nhóm: Vận động thu gom máu chất lợng cao - Ths Nguyễn Đắc Thuận Viện HHTM TW - ThS TrÇn Ngäc QuÕ - - BS Nguyễn Mạnh Quân - Nhóm: Sàng lọc bệnh nhiễm trùng - PGS TS Bạch Khánh Hoà Viện HHTM TW - TS Bïi Mai An - - KTV: TrÇn Thị Ngọc Anh - Nhóm: Sản xuất sản phẩm huyết tơng - ThS Phạm Tuấn Dơng Viện HHTM TW - CN Đỗ Thị Hiền - - CN Trần Thị Thuỷ - - CN Võ Thị Diễm Hà - Nhóm: Đông khô sản phẩm huyết tơng - TS Ngô Duy Thìn Trờng ĐH Y Hà Nội - TS Lê Đình Mùi - - ThS Lê Thị Hồng Nhung - - ThS Ngun ThÞ Thu Thủ - Nhóm: Kiểm tra chất lợng sản phẩm - TS Hoàng Hạnh Phúc BV Nhi Trung ơng - TS Trần Thị Hồng Hà - - TS Nguyễn Thị Nữ Viện HHTM TW - BS Lê Xuân Hải - Nhóm: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng - Nguyễn Anh Trí Viện HHTM TW - ThS Bạch Quốc Khánh - - TS Phạm Quang Vinh ĐH Y Hà Nội- BV Bạch Mai - Nguyễn Thị Lan Bệnh viện Bạch Mai - TS Hoàng Vũ Hùng Học viện Quân y Các quan tham gia ViƯn Hut häc Trun m¸u Trung ơng Bệnh viện Bạch Mai Trờng Đại học Y Hà Nội (Trung tâm bảo quản Mô - Bộ môn Mô học) Học viện Quân y (Khoa Truyền nhiƠm, Qu©n y viƯn 103) BƯnh viƯn Nhi Trung ơng (Khoa Hoá sinh Huyết học) Chữ viết tắt ACD Acid Citrate dextrose CD Cluster of differentiation CFU Colony forming unite CM Carboxyl methyl CPD Citrate - Phosphate dextrose CPD-A1 Citrate - Phosphate dextrose - Adenine DIC Disseminated Intravaseular Coaglulation DEAE Dimethylaminoethyl ELISA Enzym leankaged sorbant Assay FDP Fresh Dried plasma FFP Fresh frozen plasma G-CSF Granulocyte - colony Stimulating factor GEMM Granulocyte - Erythrocyte - Monocyte - Megakaryocyte HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HIV Human immunodeficiency virus HHTM Hut häc - Trun m¸u HLA Human leukocyte Antigen HST Huyết sắc tố HTTĐL Huyết tơng tơi đông lạnh IMIG Intramuscular Immunoglobulin IVIG Intravascular Immunoglobulin KHCN Khoa häc - C«ng nghƯ KHKT Khoa häc - Kü tht LDH Lactate dehydrogenase PEG Polyethaylen - glycol TM Tun m¸u SP S¶n phÈm WHO World Health Organization Mơc lơc Trang Đặt vấn đề - mục tiêu - nội dung nghiên cứu Tổng quan 2.1 Lịch sử phát triển truyền máu sản xuất sản phẩm máu 2.2 Máu thành phần máu 2.3 Các thành phần huyết tơng 2.4 Các phơng pháp chiết tách thành phần huyết tơng 2.5 Bảo quản huyết tơng sản phẩm huyết tơng 2.6 Giám sát quản lý chất lợng sản phẩm huyết tơng 2.7 Một số sản phẩm huyết tơng có giá trị cao điều trị 2.8 Tình hình sử dụng sản phẩm huyết tơng giới 2.9 Khả sản xuất sử dụng sản phẩm huyết tơng Việt Nam 2.10 Mét sè vÊn ®Ị míi vỊ protein hut tơng: proteome - proteomics 2.11 Hớng phát triển tơng lai Đối tợng phơng pháp 3.1 Đối tợng 3.1.1 Ngời cho máu 3.1.2 Động vật thực nghiệm 3.2 Chất liệu nghiên cứu trang thiết bị, hoá chất cần thiết 3.2.1 Chất liệu nghiên cứu: Huyết tơng 3.2.2 Trang bị, hoá chất 3.3 Phơng pháp 3.3.1 Tuyển chọn huyết tơng chất lợng cao an toàn 3.3.2 Sản xuất sản phẩm huyết tơng: sản phẩm quy trình sản xuất 3.3.2.1 Huyết tơng tơi đông khô 3.3.2.2 Sản xuất yếu tố VIII cô đặc 3.3.2.3 Sản xuất - globulin 3.3.2.4 Sản xuất Albumin chất lợng cao 3.3.2.5 Sản xuất - globulin giàu anti - HBs 3.3.3 Đông khô bảo quản sản phẩm huyết tơng 3.3.4 Chỉ tiêu chất lợng sản phẩm 3.3.5 Kiểm tra chất lợng sản phẩm 3.3.6 Xây dựng quy trình công nghệ 3.3.7 Xử lý kết 3.3.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu chung 3 15 23 24 25 28 30 31 33 35 35 35 35 35 35 35 36 36 39 39 40 40 41 42 43 46 49 49 49 49 Kết 4.1 Các sản phẩm huyết tơng thu đợc 4.1.1 Huyết tơng tơi chất lợng cao 4.1.2 Huyết tơng tơi đông khô 4.1.3 Yếu tố VIII cô đặc từ huyết tơng ngời 56 56 56 58 61 4.1.4 γ - globulin tõ hut t−¬ng nghÌo F-VIII 4.1.5 Albumin tõ hut t−¬ng nghÌo F-VIII 64 70 4.1.6 - globulin giàu anti-HBs 4.2 Các quy trình công nghệ đà hoàn thiện 4.3 Kết đào tạo báo khoa học 4.4 Đánh giá mức độ hoàn thành tiêu nghiên cứu Bàn luận 5.1 Chất lợng huyết tơng tơi (FFP) 5.2 Chất lợng huyết tơng đông khô 5.3 Kết sản xuất yếu tố VIII cô đặc 5.4 Chất lợng - globulin sản xuất từ huyết tơng nghèo F-VIII 5.5 Chất lợng albumin sản xuất từ huyết tơng nghèo F-VIII 75 79 102 103 104 104 105 107 109 111 5.6 Vấn đề sản xuất -globulin giàu anti-HBs từ huyết tơng ngời 5.7 Đông khô bảo quản sản phẩm huyết tơng 5.8 Phơng pháp chiết tách sản phẩm huyết tơng Kết luận Các sản phẩm huyết tơng đà thu đợc Hiệu phơng pháp đông khô sản phẩm huyết tơng Các quy trình công nghệ đà hoàn thiện Các báo khoa học đà công bố Kết đào tạo 113 114 115 117 117 117 118 118 118 ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 119 Kiến nghị 120 Tài liệu tham khảo 121 Đặt vấn đề mục tiêu - nội dung nghiên cứu Viện HHTM đà hoàn thành đề tài độc lập cấp nhà nớc: Nghiên cứu lây truyền mẹ virus viêm gan B virus truyền qua đờng truyền máu, KY01/15 nghiệm thu 06/ 1996 Nghiên cứu sản xuất chuẩn hoá sản phẩm máu sử dụng cho điều trị bệnh, KHCN 11/ DA5 nghiệm thu 03/ 2004 (10) Hai đề tài đà thiết thực góp phần nâng cao chất lợng máu an toàn TM, trực tiếp phát triển truyền máu phần vừa có hiệu kinh tế cao, tiết kiệm vừa nâng cao hiệu điều trị, làm thay đổi tập quán TM toàn phần nhiều thập kỷ từ 1954 BS lâm sàng Trong sản phẩm máu, sản xuất, chuẩn hoá sử dụng sản phẩm tế bào máu bao gồm HC, tiểu cầu, bạch cầu hạt, tế bào gốc (CD34), sản phẩm huyết tơng - nguồn nguyên liệu lớn, quí có nhiều thành phần tách riêng biệt sử dụng cho điều trị, tới ta cha làm đợc, nhiều nớc giới kể nớc khu vực nh Thái Lan, Indonesia việc sản xuất albumin, globulin miễn dịch đợc quan tâm đặc biệt ngân hàng máu Vì vậy, với nớc ta yêu cầu thực tiễn cấp bách Sản xuất sản phẩm huyết tơng đợc 1950 sau Cohn đa phơng pháp tách protein huyết tơng ethanol có kết Trên 50 năm qua, phơng pháp đà phát triển nhiều nớc, theo thời gian phơng pháp Cohn (27) đà đợc bổ sung hoàn thiện Bằng phơng pháp này, đà tách đợc albumin, globulin miễn dịch, yếu tố VIII, fibrinogen, số yếu tố đông máu khác (31,59) Tuy nhiên, tồn phơng pháp sản phẩm cha đợc hoàn toàn tinh khiết, nh albumin châu Âu đạt 90% (53,55) Mỹ đạt 95% (59) Nhng phơng pháp đơn giản, trang bị lại thực đợc lợng lớn huyết tơng, ethanol có tác dụng khử trùng kể HIV, sản phẩm tạo an toàn sau loại ethanol Trong n−íc, tíi ch−a cã tµi liƯu nµo thông báo sản xuất sản phẩm huyết tơng nội địa Xuất phát từ tình hình trên, đề tài nghiên cứu sản xuất số sản phẩm huyết tơng sử dụng cho điều trị bệnh Mục tiêu nội dung nghiên cứu A Mục tiêu: Nâng cao chất lợng sàng lọc an toàn máu để thu đợc nguyên liệu huyết tơng chất lợng cao an toàn Nghiên cứu quy trình điều chế quy mô phòng thí nghiệm xây dựng tiêu chuẩn chất lợng chế phẩm huyết tơng bao gồm: huyết tơng khô, khối yếu tố VIII cô đặc, -globulin, albumin Nghiên cứu điều kiện thích hợp bảo quản chế phẩm nói Bớc đầu nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng sản phẩm máu nhằm đánh giá hiệu điều trị B Nội dung: Nâng cao chất lợng thu gom huyết tơng: Ngời cho máu an toàn, sàng lọc bệnh nhiễm trùng Nghiên cứu điều chế huyết tơng đông khô: Thể tích 200ml/ chai, nồng độ protein > 5g/ l, pH 6-7, n−íc tån d− < 2%, thời gian bảo quản > năm Nghiên cứu qui trình điều chế khối cô đặc yếu tố VIII; độ đạt > 85%, thể tích 10 - 20ml/lọ, nồng độ F-VIII từ - 15 đơn vị, lợng yếu tố VIII đv/ lọ: >70 UI; sau đông khô chất lợng ổn định Thời gian bảo quản > năm Nghiên cứu qui trình chiết tách chuẩn hoá -globulin (phơng pháp Cohn ethanol): Độ tinh khiết đạt > 95%, thể tích - 10 ml/lä, nång ®é γglobulin 5g/l, pH - 6; loại dùng tiêm bắp (IMIG); thời gian bảo quản > năm Nghiên cứu qui trình chiết tách chuẩn hoá albumin (phơng pháp Cohn ethanol): độ tinh khiết đạt > 80%, thể tích - 10 ml/lọ, nång ®é albumin - 10 g/l; pH - 6, thời gian bảo quản > năm Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng nhằm đánh giá hiệu điều trị sản phẩm 2 Tổng quan 2.1 Lịch sử phát triển truyền máu sản xuất sản phẩm máu Lịch sử truyền máu tóm tắt kiện sau đây: (Xem phụ lục 1) Đầu kỷ XVII xuất phát từ lời kêu cứu bệnh nhân thiếu máu, lời thỉnh cầu họ đà làm thức tỉnh thầy thuốc lu ý đến nghiên cứu truyền máu Đồng thời, W Harvey phát minh hệ tuần hoàn, ông cho máu chạy mạch máu Nh lấy máu truyền trả lại Trên sở Richard Lower (1662) đà lấy máu động vật truyền cho ngời, nhng kết bệnh nhân tử vong Do nghiên cứu TM bị cấm 150 năm (từ kỷ XVII đến hết kỷ XVIII) Đầu kỷ XIX Bundell làm sống lại nghiên cứu TM Ông lấy trực tiếp máu ngời truyền cho ngời kết khoảng 50% sống 50% chết Thành công đà mở tia hi väng míi cho TM Tuy nhiªn tư vong TM điều bí ẩn Sang đầu kỷ XX: Landsteiner tìm hệ nhóm máu ABO, kết ông đà giải thích nguyên nhân chết TM kỷ trớc Blundell cộng tác më lng ¸nh s¸ng míi cho ph¸t triĨn cđa TM, với phát minh đà cứu sống hàng vạn - vạn ngời toàn giới Từ 1950 kết nghiên cứu chất chống đông túi chất dẻo đà mở chiến lợc tách thành phần máu TM thành phần vừa có hiệu quả, vừa an toàn tiết kiệm 1960 - 1970 J Daussett phát minh hệ kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA) từ mở trang ghép quan truyền máu an toàn Từ 1980 vấn đề bệnh nhiễm trùng HIV TM đà lên thành vấn đề toàn cầu an toàn TM Tới vấn đề TM đại đà phát triển mạnh nớc, TM thành phần, sàng lọc bệnh nhiễm trùng, loại bạch cầu trớc bảo quản, truyền tế bào gốc điều trị bệnh (Xem phụ lục 1) 2.2 Máu thành phần máu (Tóm tắt) (11) - Máu thể lỏng chiếm 1/13 trọng lợng thể, 1,3 -1,8 lít/m2 diện tích thể, 60-70ml/kg cân nặng Máu tập trung nhiều (khoảng 40%) Kết nghiên cứu sản xuất albumin cđa chóng t«i hiƯn cho thÊy chóng ta cã thể sản xuất albumin đạt chất lợng cao với độ tinh khiết > 95% (H.4.7), hiệu suất đạt 26g/lít huyết tơng (bảng 3/17) Theo kế hoạch, albumin sản xuất đạt yêu cầu chất lợng 95% (kế hoạch 90%), số lợng 8360ml dung dịch albumin 5% (kế hoạch 500ml) Kết sở để sản xuất lợng lớn hàng năm tính b»ng "g" nh− hiƯn mµ tÝnh b»ng "kg" VỊ quy trình sản xuất albumin, quy trình trải qua nhiều bớc loại dần thành phần không nằm mục tiêu từ chọn lọc huyết tơng, đến tủa nhiệt độ thấp; tủa với ethanol nồng ®é, pH kh¸c nhau, nhiƯt ®é kh¸c nhau, lùc ion khác để có albumin tinh khiết hiệu suất cao Kết đạt đợc yêu cầu đề ra, tạo đợc albumin chất lợng cao độ tinh khiết 96% (bảng 4.7; bảng 4.17) Kết vợt tiêu đặt (>90%), tơng tự tiêu quốc tế đặt ra; (Châu Âu > 85%) (71), tiêu chuẩn Mü > 95% (59) Theo nhãm nghiªn cøu sư dơng albumin plasma Châu Âu, phơng pháp Cohn cho sản xuất albumin phơng pháp (23, 53, 61, 66) Từ phân đoạn thành phần nhóm thành phần phơng pháp Cohn tiếp đến dùng phơng pháp đại để chiết tách thành phần khác chi tiết (sơ đồ 2.4, tr.22) kể proteome biến đổi gen ngời gen bệnh lý (3, 37, 59, 61) Riêng sản xuất albumin tác giả cho phơng pháp Cohn tủa với ethanol cải tiến phơng pháp kinh tế nhất, hiệu chất lợng, sản xuất lợng lớn albumin (23, 31, 52, 61) Về phần mình, qua kết nghiên cứu nghĩ ta sản xuất albumin đạt tiêu chuẩn quốc tế (63) tạo sản phẩm nớc sử dụng cho điều trị phơng pháp Cohn cải tiến (59) 5.6 Vấn đề sản xuất -globulin giàu anti-HBs từ huyết tơng ngời Đây sản phẩm đặc thù Việt Nam nớc ta có tỷ lƯ ng−êi nhiƠm viªm gan virut B cao nhÊt thÕ giíi 15 - 20, cã n¬i tíi 30% (2, 5, 9), số có tới 40% có kháng thể bảo vệ anti-HBsAg, mặt khác chơng trình phòng chống viêm gan B, cháu sơ sinh phải vacxin viêm gan B để tạo kháng thể đặc hiệu HBsAg, nguồn nguyên liệu cho sản xuất anti-HBs từ huyết tơng giàu anti HBs lớn Kết nghiên cứu cho thấy có tới 40% ngời cho máu tình nguyện có anti-HBs, số ng−êi cã møc kh¸ng 113 thĨ anti-HBs cao tõ 3+ trở lên chiếm 24% (bảng 4.18) Thu gom máu thu gom huyết tơng ngày tăng, nguồn huyết tơng cung cấp cho sản xuất sản phẩm huyết tơng ngày thuận lợi, vấn đề thực tiễn đặt cần nghĩ tới.Trong nghiên cứu nhận thấy 59% ngời cho máu tình nguyện cha có kháng thể anti-HBs bảo vệ nhiễm virut viêm gan B (bảng 4.18, tr.75) Nên chăng, để bảo vệ an toàn cho máu cần vaxin cho đối tợng 5.7 Đông khô bảo quản sản phẩm huyết tơng Để bảo quản sản phẩm máu tơi, trì chất lợng chúng, có nhiều phơng pháp đợc áp dụng Phơng pháp thờng dùng bảo quản nhiệt độ lạnh 40C bảo quản đợc máu nhiều sản phẩm dợc, thực phẩm từ - ngày đến 35 ngày có chất bảo quản hỗ trợ (máu) nhiệt độ -200C, -350C -800C bảo quản sinh phẩm, vaxin, protein, yếu tố đông máu, enzyme dài ngày Nếu nhiệt độ -1960C nitơ lỏng (liquidnitrogen) bảo quản đợc tế bào sống nhiều ngày, - 10 năm lâu (22, 61, 63) Nhờ phơng pháp bảo quản lạnh mà sản phẩm tơi trì đợc chất lợng kể sản phẩm huyết tơng chất nhạy với nhiệt nh yếu tố đông máu, bổ thể (74) Tế bào gốc, mô ghép, mô xơng đợc bảo quản lạnh dới dạng ngân hàng cung cấp sản phẩm cho ghép quan tổ chức Trong truyền máu, vấn đề bảo quản máu sản phẩm máu luôn đợc đặt lên hàng đầu, thờng xuyên đợc kiểm tra chuẩn hoá trang bị điều kiện bảo quản, nh nhân viên làm công tác bảo quản Máu sản phẩm đợc bảo quản ngân hàng máu Bên cạnh phơng pháp bảo quản lạnh, phơng pháp đông khô sản phẩm tơi đợc áp dụng dạng đông khô huyết tơng sản phẩm trì đợc chất lợng, mặt khác sản phẩm đông khô lại dễ vận chuyển bảo quản đợc dài ngày, thuận lợi cho việc cung cấp sản phẩm đông khô cho tuyến sở, huyết tơng, yếu tố VIII, albumin, -globulin Tuy nhiên, đông khô sản phẩm huyết tơng, đặc biệt -globlin làm tăng tác dụng kháng 114 bổ thể IgG, gây ngng kết (72) Để khắc phục tác động nhà sản xuất bổ sung vào sản phẩm chất có tác dụng làm ổn định hoạt tính sản phẩm nh sucrose, glycin, sortitol chúng đợc gọi chất ổn định (stabilizer) Tác giả Sisti (68) đà dùng sucrose bổ sung vào dịch -globulin (IgG) thấy tác dụng kháng bổ thể, tợng ngng kết không xuất hiện, độ an toàn sản phẩm đợc bảo đảm Một số tác giả Châu Âu (47, 56, 75) a dùng phơng pháp loại bỏ phần Fc IgG pepsin; phần mang thụ thể tiếp nhận bổ thể ngng kết Loại bỏ Fc hoạt tính sinh học -globulin không thay đổi, sản phẩm tạo có độ an toàn cao dùng tiêm tĩnh mạch (56, 57) Trong nghiên cứu sản xuất bảo quản sản phẩm huyết tơng, giám sát chất lợng sản phẩm trớc sau đông khô tiêu số lợng, thành phần huyết tơng, chất lợng huyết tơng Kết cho thấy số lợng chất lợng huyết tơng đợc đông khô máy đông khô LY-3TTE đợc bảo tồn so với trớc đông khô (P < 0,05) (bảng 4.11; 4.15) Chúng cha có điều kiện kiểm tra hoạt tính kháng bỉ thĨ vµ ng−ng kÕt Trong b−íc tiÕp theo, vÊn đề đợc giải đáp Trong nghiên cứu đà xác định đợc điều kiện cần thiết nh thời gian chạy máy, thể tích dịch đông khô, nhiệt độ lạnh phòng đông khô (-450C đến -500C), áp lực chân không (0,04 mbat) để đạt đợc lợng nớc tồn d tối đa (độ ngậm nớc) sản phẩm đông khô 2%, đạt tiêu chuẩn quốc tế (58, 63) Đây thành công nớc đông khô sản phẩm huyết tơng Máy TTE - Hà Lan sử dụng tốt cho đông khô sản phẩm huyết tơng 5.8 Phơng pháp chiết tách sản phẩm huyết tơng Nh phần tổng quan đà giới thiệu, có nhiều phơng pháp dùng để chiết tách sản phẩm huyết tơng, phơng pháp có tính đợc dùng có hiệu phơng pháp Cohn mô tả từ 1949 đợc tác giả sau cải tiến rút ngắn công đoạn sản xuất (29, 53, 59) Bằng phơng pháp Cohn với thay ®ỉi vỊ nång ®é ethanol tõ 8% ®Õn 40%, môi trờng pH thay đổi từ 7,2 đến 4,8, vỊ nhiƯt ®é thay ®ỉi tõ ®Õn - 50C; u tè VIII, fibrinogen tđa ë ®iỊu kiƯn nång ®é 8%, pH 7,2, lực ion 0,14 Dựa vào điều kiện tủa thành phần huyết tơng tơi chiết tách đợc nhiều sản phẩm: Yếu tố VIII cô đặc, -globulin, albumin riêng biệt, tạo nhóm thành phần nh nhóm tủa VIII + 115 fibrinozen, V.Willebrand; nhóm yếu tố đông máu; nhóm albumin + -globulin (H.2.4; tr.22) Từ nhóm tách riêng thành phần phơng pháp đại hơn, độ tinh khiết cao nh sắc ký, hấp phụ miễn dịch, điện di chiều, khối phổ v.v Nhờ giải trình tự gen cấu trúc phân tử, để từ tổng hợp chuyển gen tạo khối lợng lớn (41, 60, 62) Trong nghiên cứu nhận thấy phơng pháp Cohn đà cải tiến (31, 59) tách đợc sản phẩm quan trọng: Albumin, -globulin, F-VIII Chất lợng hiệu suất sản xuất albumin -glbulin đạt tiêu chuẩn đặt Ngoài phơng pháp Cohn có số u điểm khác mà phơng pháp khác đợc, phơng pháp đơn giản, dễ thực hiện, rẻ tiền mà thu đợc sản phẩm có chất lợng, ethanol có tác dụng diệt trùng kể HIV (31), phơng pháp có khả xử lý mét khèi l−ỵng lín tõ 500 - 1000 lÝt hut tơng cho lần sản xuất (59) Do vậy, nhiỊu n−íc ph¸t triĨn vÉn sư dơng tèt nh− Anh, Đức, Nhật Với điều kiện nớc ta, phơng pháp Cohn thích hợp cho sản xuất sản phẩm yếu tố VIII cô đặc, -globulin albumin Đây kết đợc mô tả nớc đáng khích lệ Kết làm sở phát triển sản xuất lớn sản phẩm huyết tơng, trực tiếp góp phần phát triển truyền máu thành phần nớc ta theo hớng truyền máu đại 116 Kết luận Qua nghiên cứu sản xuất sản phẩm huyết tơng, đề tài thu đợc kết sau đây: Đà sản xuất chuẩn hoá đợc sản phẩm huyết tơng đạt tiêu chuẩn quốc tế 1.1 Đề tài hoàn thành số lợng khối lợng sản phẩm huyết tơng ngời, bao gồm: - Huyết tơng tơi đông khô đạt 2500ml, nồng độ protein 61g/lít (chỉ tiêu 4000ml, nồng độ 55g/lít) - Albumin độ tinh khiết cao (96%); số lợng 8360ml, dạng 5% (chỉ tiêu độ tinh khiết đạt 90%, 500ml dạng dùng 5%) - -globulin độ tinh khiết 93%, nồng độ 16,5% đạt 380ml (chỉ tiêu 95%, 200ml nồng độ 16,5g), - Yếu tố VIII cô đặc 80UI/đvị/lọ, đạt 33đv/lọ 5ml (chỉ tiêu 70UI/lọ x 30đv/lọ5ml) - -globulin giàu Anti-HBs độ tinh khiết đạt 93% hiệu giá: 1:128; 6,5g (đây sản phẩm kế hoạch đề tài) 1.2 Trong huyết tơng ngời cho máu tình nguyện HBsAg (-) có tỷ lệ đáng kể (24%) có anti-HBs với hiệu giá cao 1: 128, nguồn nguyên liệu có giá trị cung cấp cho sản xuất -globulin - Anti-HBs từ huyết tơng ngời 1.3 Đông khô phơng pháp thích hợp cho bảo quản sản phẩm huyết tơng Đông khô không ảnh hởng đến số lợng chất lợng sản phẩm huyết tơng bao gồm huyết tơng tơi, yếu tố VIII cô đặc, -globulin, albumin, mà tạo điều kiện thuận lợi cho vận chuyển bảo quản dài ngày sản phẩm Nhiệt độ bảo quản sản phẩm huyết tơng đông khô 40C đến -200C Đà hoàn thiện quy trình sản xuất sản phẩm huyết tơng (xem phần quy trình cụ thể) Các quy trình áp dụng để sản xuất sản phẩm: F-VIII cô đặc, albumin, -globulin, huyết tơng tơi đông khô -globulin anti-HBs đạt tiêu chuẩn quốc gia quốc tế 117 Quy trình tuyển chọn huyết tơng chất lợng cao, an toàn Quy trình sản xuất huyết tơng tơi đông khô Quy trình sản xuất Albumin đạt chất lợng cao Quy trình sản xuất -globulin Quy trình sản xuất yếu tố VIII cô đặc Quy trình sản xuất -globulin giàu Anti-HBs (ngoài kế hoạch) Quy trình bảo quản sản phẩm huyết tơng Đà có báo khoa học công bố báo nghiên cứu Y học (2007, 2008): Nghiên cứu xây dựng quy trình đông khô huyết tơng dùng cho điều trị Nghiên cứu y học, 2007, 49, No3: 65 - 68 Kết sản xuất albumin đạt tiªu chuÈn - Nghiªn cøu y häc, 2007, 52, N05: - Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sản xuất -globulin huyết tơng ngời, sản xuất -globulin giàu anti-HBs đạt tiêu chuẩn - Nghiên cứu y học, 2008 (đang in), V053, N01: 67 - 71 Kết đào tạo - 01 Luận văn tiến sĩ: Sử dụng huyết tơng giàu Anti-HBs điều trị bệnh viêm gan B cÊp, Häc viƯn Qu©n y (thùc hiƯn 2001) - 01 Khoá luận tốt nghiệp Bác sĩ Y khoa: Quy trình đông khô huyết tơng tơi, 2007, Đại học Y Hà Néi - Dù kiÕn cã: + 01 luËn ¸n tiÕn sĩ: Nghiên cứu sản xuất chuẩn hoá sản phẩm huyết tơng: VF-VIII; -glbulin, albumin + 01 luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu sản xuất kháng thể giàu anti HBs từ huyết tơng ngời cho máu 118 ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Kết sản xuất sản phẩm huyết tơng trực tiếp góp phần phát triển truyền máu thành phần vừa an toàn, hiệu kinh tế, thiết thực góp phần phát triển truyền máu đại nớc ta, kết đợc mô tả nớc ta Các sản phẩm huyết tơng tơi đông khô, yếu tố VIII cô đặc, albumin, -globulin dạng sản phẩm tơi đợc bảo quản dới dạng đông khô, thuận lợi cho việc cung cấp tới tuyến sở thuộc vùng sâu, vùng xa, hải đảo, có khả dự trữ dài ngày cho thảm hoạ, cho an ninh quốc phòng mà số ta cha có Các sản phẩm huyết tơng ta nhập ngoại giá cao, nhiều bệnh nhân khả mua đợc, ta có lợng lớn huyết tơng chất lợng tốt, huyết tơng ngời Việt Nam có nhiều loại kháng thể chống bệnh vùng nhiệt đới mà huyết tơng ngời nớc (châu Âu) có đợc Vì kết mở h−íng cã ý nghÜa khoa häc, thùc tiƠn vµ kinh tế cao chơng trình sản xuất sản phẩm huyết tơng nớc Sản xuất sản phẩm huyết tơng với sản phẩm máu giai đoạn trớc mà sử dụng có hiệu quả, nhằm mục đích chuẩn hoá sản phẩm máu nh sản phẩm huyết tơng tơi đạt trình độ quốc tế, mặt, góp phần nâng cao chất lợng truyền máu cho nhân dân ta, mặt khác không phần quan trọng tạo điều kiện héi nhËp qc tÕ HiƯn ta giao l−u lín, ngời nớc làm việc du lịch ta bị bệnh cần truyền máu, ta sẵn sàng có máu đạt tiêu chuẩn quốc tế để chăm sóc cho họ, họ qua Singapore, Thái Lan điều trị Nh ta vừa ngoại tệ, vừa giảm uy tín hội nhập Sản xuất sản phẩm huyết tơng điều kiện để tiếp cận với khoa học công nghệ sinh học cao, thiết thực góp phần bồi dỡng cán phát triển chuyên ngành huyết học - truyền máu Với qui trình công nghệ đà hoàn thiện sản xuất sản phẩm thĨ, cã thĨ tiÕp tơc hoµn thiƯn vµ më rộng quy mô sản xuất mức bán công nghiệp, sớm tạo sản phẩm cho ngời bệnh 119 8- Kiến nghị Đề nghị đợc tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phần thử nghiệm lâm sàng, để làm phần đề nghị Bộ cho cấp lại kinh phí 130 triệu đà thu hồi 2001 Cho phép xây dựng đề cơng dự án sản xuất chuẩn hoá mở rộng, để có kết thí nghiệm lâm sàng nhanh chóng tiếp cận giai đoạn (RD) với sản phẩm: huyết tơng tơi đông khô, yếu tố VIII cô đặc, -globulin giàu anti-HBs, Albumin 120 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt: Vũ Triệu An CT (2003): Giá trị sinh học miễn dịch Trong: giá trị SH ngời Việt Nam bình thờng thập kỷ 90/ kỷ XX Nhà xuất Y học 2003: 89 - 91 Bùi Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn (1999): Viêm gan virut B Bệnh học truyền nhiễm Nhà xuất Y học, Tr.113 - 130 Phan Văn Chi (2003): Proteomics nghiên cứu ứng dụng Tạp chí CNSH, 1:11-24 Phan Văn Chi (2006): Proteomics - Khoa häc vỊ hƯ Protein Nhµ xuất Viện KHCN Việt Nam, Hà Nội 2006 Lê Đăng Hà (1999): Một số đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng hiệu viêm gan virut B Thông tin Y Dợc học, số 10: 12-17 Nguyễn Thị Hà CT (2003): Giá trị sinh học hoá sinh Trong: giá trị SH ngời ViƯt Nam b×nh th−êng thËp kû 90/ thÕ kû XX Nhà xuất Y học 2003: 79 - 88 Hoàng Vũ Hùng (2001): Bớc đầu nghiên cứu ảnh hởng plasma giàu antiHBs bệnh nhân viêm gan virut B cÊp Ln ¸n TiÕn sÜ Y khoa, Häc viƯn Quân y, 2001 Đỗ Trung Phấn (2003): Tế bào gốc tạo máu, "Bệnh lý tế bào gốc tạo máu" Nhà xuất Y học, 2003 Tr.1-30 Đỗ Trung Phấn (2003): Các virut truyền qua đờng truyền máu Trong: Cuốn sách "An toàn truyền máu" Nhà xuất Y KHKT, 2000, Tr.93- 154 10 Đỗ Trung Phấn, Phạm Tuấn Dơng CT (2003): sản xuất chuẩn hoá sản phẩm máu sử dụng cho điều trị bệnh Dự án KHCN - Cấp nhà nớc mà số: KHCN-11-DA5 nghiệm thu 2004 11 Đỗ Trung Phấn (2006): Sinh hoá - sinh lý máu Bài giảng HHTM sau Đại học Nhà xuất Y học Việt Nam, T83 - 90 12 Vũ Thị Phơng (2001): Sinh hoá máu Trong: Hoá sinh, Nhà xuất Y học, 2001, Tr.698- 716 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Y khoa, Đại học Y Hà Nội, 2004 121 13 Vũ Thị Phơng: Nghiên cứu đặc điểm chuyển hoá glucose hồng cầu, khả chống ôxy hoá ngời nhiễm chì, bệnh tan máu máu bảo quản Đề tài cấp Bộ Y tế, nghiệm thu 9/03/2005 14 Trần Ngọc Quế, Đỗ Trung Phấn (2003): T×nh h×nh nhiƠm HIV, HCV, HBV häc sinh, sinh viên cho máu Viện HHTM Luận văn Thạc sĩ Y khoa, 2003, Đại học Y Hà Nội 15 Ngô Duy Thìn, Trịnh Bình, Phạm Tuấn Dơng, Đỗ Trung Phấn cộng tác (2007): Nghiên cứu xây dựng quy trình đông khô huyết tơng tơi dùng cho điều trị bệnh máy đông khô LY3-TTE/DM8, Hà Lan Nghiên cứu y häc, 49:69-72 TiÕng Anh: 16 Ala F.A (1992): Frozen Fresh plasma and albumin consumption in the united Kingdom Ed by Rossi U et al, Pub by Italian Society of bood transfusion, 1992: 17-30 17 Anderson N.L, Anderson N.G (2002): The human plasma proteome: History, character and diagnostic prospects Mol cell-proteomics, 1:845-867 18 Anonimous (1979): ion exchange chromatography Principles and methods Uppsala, Sweden, pharmacia Orebro p1-112 19 Bekaltcheva I., O' sullivan A.M., Hmel P., Ogbu H (2007): Freeze dried Whole plasma: Evaluating Sucrose, Trehalose,Sorbitol, manitol vµ glycine as Stalibizers Med-Res USA (2007) (abtracts) 20 Bharucha Z (1998): Organization and management of blood transfusion service: Policies and plans Communicore, Mumbai 1998 21 Boltho M.V (1992): Achievements of the Council of Europe in the Promoting of Self - Sufficiency for factor VIII and albumin in Europe Prometing of the third SIITS AICT Synposium of Europe, Rome, Italy 1992: 9-15 22 Brozovic M., Gurd L.Y., Robertson I., Bangham D.R (2006) Stability of Prothrombin and factor VII in Freeze - dried Plasma Abstract of Nat Inst for Med Res Mill-Hill, London (2006) 23 Bucci E (1992): The role of private industry in the processing of plasma and the production of Albumin in Europe In: Production and clinical use of plasma Council of Europe, 1992 122 24 Carlson T.H (1996): Composition of Plasma In: Pincibles of Transfusion Medicine Ed by Rossi E.C et al Williams - Wilkin 1996, 383 - 393 25 Coan MH., Brockway W.J (1995): Preparation and properties of αproteinase inhibitor concentrate from human plasma Vox, Sang; 48: 333 - 342 26 Cohn H (1993): Avoiding the misuse of fresh frozen plasma Brish Med J., 307: 395 - 396 27 Cohn E.J., Gurd F.R.N (1950): Qualitative procedures for separation of protein components of human plasma: J Am Chem Soc., 72: 465 - 474 28 Crowley J.P., Kestin A (1996): Transfusion of plasma and plasma derivatives In: Princibles of Transfusion Medicine 29 Curling J.M (1980): Methods for plasma protein fraction London, Academic press, 1980 30 Dahlback B., Stenflo J., (2001): Protein C anticoagulation system In: Molecular Basis of blood Diseases Pub by saunder company, Philadenphia, 2001, p = 614 - 635 31 Drohan W N; Hoyer L.W (1994): Plasma Protein Products In: Scientific Basis of Transfusion Medicine Ed by Anderson and Ness Pub by Saunder company, Philadenphi-London-Tokyo, Sydney 1994, P381-402 32 Flesch B (2006): Can HLA class II antibodies Trigger TRALI Vox Sang., 91 (Suppl 2): 33 George J., Broze Jr (2001): Regulation of Blood coagulation: Tissue factor Inhibitor, anti-thrombin, heparin cofactor II Pub by Saunder company, Philadenphia, 2001, p = 657 - 669 34 Griggnani F Gelmeti V., Fanelli M.,et.al (1999): Formation PML/RAR-α high motecular Weight nuclear complexes through the PML coiled - coil region is essential for the PML/RAR-α mediated retinoic acid response Oncogene, 18: 6313-21 35 Harrison J.F.M., Bloom A.L (1991): The Pharmacokinetics of recombinant factor VIII Semin Hematol 1991, 28: 29-35 123 36 Horowitz B., Lippin A., Chang N.Y (1984): Preparation of anti hemophilic factor and fibronectin from human plasma cryoprecipitate Transfusion, 24: 357 - 362 37 Hortin G-L.,Jortani S.A., Ritchie J.C., et.al (2006): Proteomics: A new diagnostic Frontier Chin.chem., 57: 1218 - 22 38 Insangraka P.B., Pundhawong S., Pintadit P (1987): Freeze dried Plasma: a solution for the Storage of blood Products in developing countries Med.Res Thailand (1987) (abstaract) 39 IVIG Consensus report (1997): Present and Future uses of IVIG The consensus working group, Canada, Toronto, 1977 40 Krousley J P., Kestin A (1996): Transfusion of Plasma In: Princible of Transfusion Medicin, p = 415 - 422 Ed by Rossi E.C et al pub Williams - Wilkins (1996) 41 Lawn R.M., Adelman J., Bocks (1981): The sequence of human Serun albumin cDNA and its expression in E.coli Nucleic acid Res., 9: 6103 42 Maslauka K., Michur H et al (2006): leukocyte antibodies in Blood donors and their consequences in recipients Vox Sang., 91: 43 McClelland B (2001): Effective use of blood components In: Practical Transfusion Medicine Ed by Murphi and Panpilon Black well Science, 2001, p: 65 - 75 44 Miller I.L., Bly G.G., Watson M.L (1951): The dominant role of the liver in plasma protein Synthesis J Exp Medicin, 94: 437 - 452 45 Mobini N., Sarela A., Ahmen R (1995): IVIG in therapy of autoimmune and systemic inflammatory disorders nnal of Allergy, Asthama, immuno., 74: 119 - 125 46 Murphi M.F (2001): Febrile reaction and transfusion - related Acute lung Injury (TRALI) In: Practical Transfusion Medicine Ed by Murphi and Panphilon Pub by Blackwell Science, London, 2001, p = 157 - 162 47 Nydegger UrS.E.: (1996): Immunoglobulin in chinical Medicine Principles of Transfusion Medicine Ed.by Rossi E.C 1996, P=453-463 124 48 Newman J., JohnSon A.J (1971): Methods for the production of clinically effective intermediate and high purity factor VIII concentrates Br J.Hematol 21: 1- 20 49 Ourth D.D (1974): Neutralization of diphtheria toxin by human Immunsglobulin classes and subunits Immunochem.; 11: 223 - 225 50 Report (1979): Variable involved in cryoprecipitate production and their effect on factor VIII activity Br J Hematol., 43: 287 - 295 51 Roifman C.M., levison H., Enfand F.W (1987): High dose versus low dose intavenous Immunoglobulin in hypogamaglobulinemia and chromic lung disease Lancet, 1: 1075 - 1077 52 Rossi E.C., Simon T.L., Moss G.S., Gould S.A (1996): Transfusion into the nex millennium In: Princibles of Transfusion Medicine Pub by Williams - Wikin, Baltimore, 1996, p = 383 - 393 53 Rossi U., Vanken W.G., Orlando M (1992): Therapy with Plasma and Albumin: Production and clinical use Italian Society of Blood Transfusion, Council of Europe, 1992 54 Sadler J.E., Davie E.W (2001): Hemophilia A, Hemophilia B, von Willebrand Disease (F-VIII, F-IX, V-Will) Pub by Saunder company, Philadenphia, 2001: p = 614 - 635 55 Schmitt H (1992): Production and clinical use of plasma and Albumin in the Federal republic of Germany In: “Therapy with plasma and Albumin: Production and clinical use Ed by Rossi U et al Italian Soc, of Blood Transfusion 1992, p = 31 - 42 56 Schroeder D.D., Tankersley D.L (1981): A new separation of Modified Immune serum globulin (human) suitable for intravenous administration II fanctional characterization Vox Sang 40: 383 - 394 57 Schwich H.G.: Haup H (1984): The plasma protein: Structure, fanction, genetic control Academic press (New York): 4: 167 - 200 125 58 Sward Nilson A.M., Person P.O (2006): Factors influencing F-VIII activity in Freeze Frozen Plasma VOX Sang 90: 30-39 59 Van Aken W.G (1996): Preparation of plasma derivatives Princibles of Transfusion Medicine, p = 403 - 413 Pub by Williams - Wilkin, Baltimore, 1996 60 Velander W.H., Johnson J.L (1992): High level expression of a heterologous protein in milk of Transgenic Swine using the cDNA encoding human protein C Proc Natl Acad Sci USA 89: 12003 - 61 Williamson L.M (2001): Production and storage of blood compoments In: Practical Transfusion Medicine Ed by Murphi and Panpilon Pub blackwell - Science, 2001, p = 231 - 243 62 Wright G., Carver A et al (1991): High level expression of active human alpha - antitrypsin in the milk of transgenic sheep Bio - Technology, 9: 830 - 63 WHO Expert of Committee on Biologcal Standardization (1994) : Requirements for the collection, Processing, quality Control of blood, blood Components and Plasma derivatives WHO technical reports, Series1994: 31-99 64 Yeh C.J., Wu C.F., Hsu W.T., Liu T.C (2006) Transfusion audit of Fresh - frozen plasma in Southern Taiwan Vox Sang 91: 270 - 274 65 Zada A.P., Getetu M.H., Pulikan J.A., et.al (2006): Proteomics analysis of Acute Promyelocytic leukemia: PML - RAR-α leads to decreased Phosphorylation of OP18 at Serine 63 Proteomics, 6: 5705-19 66 Zucchelli P., Orlando M (1992): The situation of Plasma and albumin Production and clinical Use: in Italy Council of Europe, Italian Society of Immunohematology and Bliod Transfusion, Rome, 1992 67 Sisti A.M (1994): Development of method to obtain Preparation of IVIG Master thesis University, National of Cardoba, 1994 126 68 Sisti A.M., Vitali M.S., Manfredi M.J., Zarzur J.A (2001): Preparation of liophilized and liquid Intravenous inmunoglobulin G: Sevelopment and Scale - Up Vox Song., 80: 216 - 224 69 Yocum A.K., Busch C.M., Felix C.A and Blair I.A (2006): Proteomics Based stragets to Identify Biomarkers and Pharmacological Targets in leukeunia with t (4,11) translocation J.Proteomics Res., 5: 2743-53 70 Bé Y tÕ (2007): Quy chÕ trun m¸u 2007 71 Human Plasma for fractionation (1998): Council of Europe for Blood Transfusion, Strasbourg, 1998: 339 - 341 72 Dong A., Prestelski S.J., Carpenter J.F (1995): Infrared Spectroscopic Studies of liophlizention and temprature - indued protein aggregation J.Pharm Sci., 84: 415 - 424 73 Myllyla G (1998): Factors determining quality of plasma Vox.Sang., 74: 507 - 511 74 Smith J.F., Ness P.M., Moraff G., Luban N.L.C (2000): Retention of Coagulation factors in plasma frozen after extended holding at 1-60 C Vox.Sang, 78: 28 - 30 75 Reid K.G., Cuthberson A.D., Jones A.D.L., Meintosh R.V (1998): Potential Contribution of mild pepsin treatment at pH4 to the viral safety of human Immunoglobulin Products Vox Sang., 55: 75 - 80 76 Contreras M., Hewitt P.E., (1999): Clinical transfusion In the Post Graduate Hematology Ed by Victor Hoffbrand et.al Pub by Butter Worth, Oxford, Boston, 1999, p = 215-234 127