Thiết kế vector mang gen ga20 cdna phân lập từ cây keo

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT KẾ VECTOR MANG GEN GA20 – cDNA ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY KEO NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 307 Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Phong PGS TS Phạm Bích Ngọc Sinh viên thực hiện: Hồng Thị Thúy Mã sinh viên:1453071634 Lớp: K59A – CNSH Khóa học: 2014 - 2018 Hà Nội – 2018 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin cho em bày tỏ cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Phong – Viện CNSH PGS T.S Phạm Bích Ngọc - Viện CNSH – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam, tận tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt cho em thời gian thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn anh chị, cán bộ, kỹ thuật viên phịng Cơng Nghệ Tế Bào Thực Vật – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam môn công nghệ gen di truyền – Viện CNSH – trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em nghiên cứu để hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giảng viên trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, thầy cô bên Viện CNSH Trong trình học tập trƣờng, em nhận đƣợc bảo, hƣớng dẫn nhiệt tình thầy cơ, nhờ giảng dạy kiến thức chun mơn mà em hồn thành đƣợc khóa luận tốt nghiệp Cuối em xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh động viên giúp đỡ em trình học tập nhƣ thực tốt khóa luận Trong q trình thực khơng tránh khỏi sai sót, em mong q thầy giáo góp ý để khóa luận đƣợc hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! ĐHLN, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Hoàng Thị Thúy MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan trạng trồng biến đổi gen 1.1.1 Lịch sử phát triển 1.1.2 Thực trang sử dụng trồng nông – lâm nghiệp biến đổi gen 1.1.3 Cây trồng lâm nghiệp biến đổi gen ( BĐG) 1.2 Tổng quan Gibberellin gen GA20 1.2.1 Tổng quan Gibberellin (GA) 1.2.2 Con đƣờng sinh tổng hợp GA 1.2.3 Tổng quan GA20 10 1.3 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 11 1.4 Vector chuyển gen vào thực vật 15 1.4.1 Tổng quan vector chuyển gen vào thực vật 15 1.5 Một số vector chuyển gen 17 1.5.1 Vector pBI121 18 Chƣơng MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết kế vector chuyển gen pBI121-GA20 21 2.2 2.Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 mang vector pBI121-GA20 21 2.3 Vật liệu nghiên cứu 21 2.3.1 Vật liệu 21 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.4.1 Gắn đôi c-myc vào gen GA20 phản ứng CPR 23 2.4.2 Tách dòng GA20 – c-myc vector pBT 25 2.4.3 Thiết kế vector chuyển gen 29 2.4.4 Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens 34 Chƣơng 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Kết gắn đuôi c-myc vào gen GA20 PCR 37 3.2 Kết tách dòng GA20 – c-myc vector pBT 37 3.3 Kết thiết kế vector chuyển gen GA20 – pBI121 38 3.3.1 Cắt pBI121 vector tách dòng GA20 – c-myc – pBT enzyme SacI SmaI 38 3.3.2.Ghép nối gen GA20 vào vector pBI121 biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α 39 3.4 Tạo chủng Agrobecterium tumefaciens C58 40 3.4.1.Kết biến nạp vector pBI121 – GA20 vào vi khuẩn A.tumefaciens 40 3.4.2 Sàng lọc vi khuẩn mang vector chuyển gen 41 3.4.3 Lƣu trữ chủng vi khuẩn agrobecterium tumefaciens 41 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 K ết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT STT Viết tắt NST CNSH Bt EU ISAAA Viết đầy đủ Nhiễm sắc thể Công nghệ sinh học Bacillus thuringiensis Liên minh Châu Âu Tổ chức quốc tế tiếp thu ứng dụng CNSH nông nghiệp 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 A tumerfaciens LB RB Vir DNA T - DNA 4CL1 E.coli EtBr GUS LB (dung dịch) PCR TAE EDTA GA Da dDNA OD Sol TE Ti – Plasmid kb bp MS Agrobacterium Tumerfaciens Left Border Right Border Virulence Region Deoxyribonucleotide acid Transferred DNA – coumarate: coenzyme A ligase Escheria coli Ethidium bromide B – Glucuronidase gene Luria and Bertani Polymerase chain reaction Tris acetate EDTA Ethylene diamene tetra – acetic acid Gibberellic acid Dalton Deoxyribonucleotide triphosphat Optical density Solution Tris EDTA Tumor inducing plasmid Kilobase Base pair Murashige and Skoog Medium DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cây trồng biến đổi gen 26 nƣớc năm 2016 Hình 1.2: Một số hình ảnh Gibberellin Hình 1.3 Con đƣờng sinh tổng hợp GA Hình 1.4 Vi khuẩn A tumefaciens gây bệnh khối u thực vật 11 Hình 1.5 Cấu tạo plasmid 12 Hình 1.6 Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật 14 Hình 1.7 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium 17 Hình 1.8 Cấu trúc vector pBI121 20 Hình 2.1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 24 Hình 2.2 Quy trình biến nạp DNA vào tế bào E.coli DH5α 27 Hình 3.1 Kết đuôi c-myc vào gen GA20 PCR 37 Hình 3.2 Kết colony – PCR chọn lọc dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp pBT – GA20 – c-myc 38 Hình 3.3 Sơ đồ vị trí cắt gen pBI121 38 Hình 3.4 Điện di sản phẩm cắt vector pBT – GA20 – c-myc vector pBI121 để loại bỏ gen GUS SacI SmaI 39 Hình 3.5 Kết biến nạp vector pBI121 – GA20 vào E.coli 39 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR dòng khuẩn E.coli 40 Hình 3.7 Khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens môi trƣờng chọn lọc, sau biến nạp vector pBI121 – GA20 40 Hình 3.8 Sản phẩm PCR nhân gen GA20 từ plasmid tách dòng 41 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các mồi nhân gen GA20 – c-myc 22 Bảng 2.2 Các mồi dùng Colony – PCR gen pBT 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt vector pBT SacI SmaI 26 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng ghép nối gen GA20 – c-myc vào vector pBT 26 Bảng2.6: Thành phần cắt phản ứng tái tổ hợp 28 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt vector chuyển gen pBI121 cặp enzyme giới hạn SacI, SmaI 29 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt vector tái tổ hợp pBT-GA20 cặp enzyme giới hạn SacI, SmaI 29 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng nối ghép gen GA20 vào vector pBI121 30 Bảng 2.10: Thành phần hóa chất tách plasmid 32 Bảng 2.11: Thành phần phản ứng PCR 33 Bảng 2.12: Thành phần phản ứng cắt vector cặp enzyme giới hạn SacI SmaI 34 Bảng 2.13 Thành phần cắt plasmid cặp enzyme giới hạn SacI SmaI 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học ( CNSH) đại, hƣớng nghiên cứu lâm nghiệp tạo giống biến đổi gen đƣợc nhiều nhà khoa học giới quan tâm nhƣ: tạo kháng sâu, bệnh, côn trùng; nâng cao sản lƣợng gỗ tạo giống tăng khả sinh trƣởng điều kiện bất lợi (hạn hán, lũ, ngập mặn, lạnh,…) Kết tạo đƣợc đặc điểm tốt phục vụ cho mục đích sử dụng ngƣời Ngồi trồng biến đổi gen cịn có tác động lớn đến lĩnh vực khác nhƣ: lĩnh vực y – dƣợc, sản xuất protein trị liệu, vacxin tái tổ hợp Đặc biệt giống lâm nghiệp đƣợc trồng, sản xuất với số lƣợng lớn để phục vụ kinh tế tốc độ sinh trƣởng với chất lƣợng gỗ điều đƣợc ƣu tiên hàng đầu Hiện nghiên cứu làm tăng tốc độ sinh trƣởng trồng dựa vào ba chế chính: chuyển gen tăng khả cố định đồng hóa nitơ, gen sinh trƣởng tổng hợp Gibberellin gen tăng phân chia tế bào Để cải thiện khả sinh trƣởng thực vật ngƣời ta thƣờng chuyển gen mã hóa enzyme đƣờng sinh tổng hợp Gibberellin ví dụ nhƣ: gen GA20, GA3,… Gen GA20 mã hóa cho enzyme gibberellin 20-oxidase enzyme chìa khóa tham gia vào q trình sinh tổng hợp gibberellin cây, thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển vào thực vật tạo giống trồng biến đổi gen có sức sinh trƣởng nhanh Tuy nhiên, muốn chuyển gen thuận lợi vào trồng cần công tác quan trọng thiết kế vector chuyển gen mang gen cần chuyển Nhằm mục tiêu tạo nguồn nguyên liệu ban đầu tối ƣu hóa cho nghiên cứu tạo giống thực đề tài:” Thiết kế vector mang gen GA20 – cDNA phân lập từ keo” CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan trạng trồng biến đổi gen 1.1.1 Lịch sử phát triển Cây trồng chuyển đổi gen đƣợc tạo lần vào năm 1982, việc sử dụng loại thuốc chống kháng sinh Những khu vực trồng thử nghiệm thuốc có khả chống thuốc diệt cỏ Pháp Hoa Kỳ vào năm 1986 Năm 1987, Plant Genetic Systems (Ghent, Bỉ), đƣợc thành lập Marc Van Montaguand Jeff Schell, công ty phát triển trồng thiết kế gen di truyền (thuốc lá) có khả chống chịu côn trùng cách biểu gen mã hóa protein diệt trùng từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt).Trung Quốc quốc gia chấp thuận công nghiệp chuyển đổi gen với thuốc kháng vi rút đƣợc giới thiệu lần đầu vào năm 1992, nhƣng rút khỏi thị trƣờng Trung Quốc vào năm 1997 Cây trồng biến đổi gen đƣợc phê chuẩn bán Mỹ vào năm 1994 cà chua FlavrSavr, có thời gian bảo quản lâu loại cà chua thông thƣờng Năm 1994, Liên minh châu Âu phê chuẩn thuốc có khả chống thuốc diệt cỏ bromoxynil Năm 1995, khoai tây Bt đƣợc phê duyệt an toàn Cơ quan Bảo vệ môi trƣờng, trở thành nông sản kháng sâu đƣợc phê duyệt Hoa Kỳ Các loại trồng chuyển đổi gen sau đƣợc chấp thuận giao dịch Mỹ vào năm 1995: cải dầu với thành phần dầu chuyển đổi (Calgene), ngơ bắp có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) (Ciba-Geigy), kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil (Calgene), kháng côn trùng (Monsanto), đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate (Monsanto), bí kháng vi rút (Asgrow), cà chua chín chậm (DNAP, Zeneca / Peto, Monsanto) Tính đến năm 1996 có tổng cộng 35 phê chuẩn đƣợc cấp cho tám loại công nghiệp chuyển đổi gen loại hoa cẩm chƣớng, với điểm khác quốc gia cộng thêm EU Năm 2000, lần nhà khoa học biến đổi gen thực phẩm để gia tăng giá trị dinh dƣỡng việc sản xuất hạt gạo vàng 1.1.2 Thực trang sử dụng trồng nông – lâm nghiệp biến đổi gen Vào ngày 4/5/2017 Tổ chức quốc tế tiếp thu ứng dụng CNSH nông nghiệp ( ISAAA) phát hành báo cáo thƣờng niên cập nhật tình hình ứng dụng trồng CNSH hay trồng biến đổi gen tồn cầu; báo cáo cho thấy diện tích canh tác trồng biến đổi gen (BĐG) tăng gấp110 lần sau 21 năm thƣơng mại hoá – phát triển từ 1,7 triệu hecta (ha) năm 1996 lên tới 185,1 triệu vào năm 2016 Báo cáo tiếp tục cho thấy lợi ích lâu dài trồng BĐG nông dân, đồng thời nhấn mạnh tiềm phát triển lợi ích số giống đƣợc chấp thuận thƣơng mại hoá thời gian gần ngƣời tiêu dùng “Cây trồng BĐG trở thành nguồn cung nông nghiệp quan trọng, mang lại lợi ích lâu dài cho nơng dân toàn giới suất trồng đƣợc cải thiện với nỗ lực bảo tồn môi trƣờng canh tác”, Chủ tịch ISAAA – Paul S Teng, “Sự chấp thuận thƣơng mại hóa canh tác giống khoai tây táo biến đổi gen gần bƣớc cho thấy lợi ích trực tiếp dành cho ngƣời tiêu dùng thành tựu CNSH tạo sản phẩm bị thối bị hƣ hỏng, góp phần giảm bớt cách bền vững thực phẩm bị lãng phí chi phí mua sắm.” Khi nghiên cứu sâu lợi ích CNSH, báo cáo ISAAA ứng dụng trồng BĐG giúp giảm lƣợng phát thải khí CO2 tƣơng đƣơng với việc ngừng hoạt động 12 triệu ô tô hàng năm; đồng thời giảm bớt tác động tiêu cực từ canh tác nông nghiệp lên môi trƣờng thông qua việc giảm 19% nhu cầu sử dụng thuốc trừ sâu thuốc trừ cỏ Thêm vào đó, quốc gia phát triển, việc canh tác trồng BĐG hỗ trợ giảm thiểu nạn đói giúp nâng cao thu nhập cho khoảng 18 triệu nơng dân gia đình họ, từ giúp cải thiện ổn định tài cho 65 triệu ngƣời “Công nghệ sinh học, cụ thể trồng biến đổi gen giải pháp cần thiết giúp ngƣời nông dân canh tác đƣợc nhiều diện tích đất hơn”, Điều phối viên toàn cầu ISAAA – Randy Hautea – giải thích - Dùng pipet hút lấy 400µl dịch pha lỏng cho vào ống eppendorf 1,5ml khác - Bổ sung 400µl isopropanol lạnh (1:1 v/v) phút 4oC, loại bỏ dịch phía làm khơ tủa máy speedvac - Hịa tan tủa 50µl nƣớc khử ion vơ trùng ( bổ sung 1µl Rnase A, ủ 37oC khoảng 30 phút)  Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại đoạn DNA quan tâm Bảng 2.11: thành phần phản ứng PCR Nồng độ (µl) Thành phần Nƣớc khử ion 14,5 MgCl2 (25mM) 2,5 dNTPs (10mM) Đệm PCR 10X 2,5 Mồi xuôi (10pmol/µl) Mồi ngƣớc (10pmol/µl) Plasmid Taq DNA polymerase (5 đơn vị/µl) 0,5 Tổng thể tích phản ứng 25 Chu trình phản ứng PCR 25 chu kỳ 94oC 94oC phút 50 giây 72oC 72oC phút 10 phút o 59 C 40C ∞ 40 giây Sau khuếch đại gen GA20 từ plasmid PCR, sản phẩm đƣợc điện di gel agarose 1% 33  Cắt kiểm tra plasmid enzyme giới hạn Plasmid sau tinh đƣợc cắt kiểm tra cặp enzyme giới hạn SacI SmaI Vì cặp enzyme giới hạn SacI SmaI enzyme có vị trí cắt thuộc vector pBI121 sát vị trí gen GA20 đƣợc xen vào vector, nên sau xử lý vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai bị cắt thành thành phần vector pBI121 gen GA20 Bảng 2.12: Thành phần phản ứng cắt vector cặp enzyme giới hạn SacI/SmaI Thành phần Thể tích (µl) Plasmid 14 Buffer Tango 10X Hind III SacI H2O deion Tổng 20 Ủ hỗn hợp phản ứng 37oC Kết cắc vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% 2.4.4 Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens 2.4.4.1 Phƣơng pháp tạo tế bào khả biến A.tumefaciens Chủng A.tumefaciens C58 sau đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB đặc, chọn khuẩn lạc để nuôi lắc ml môi trƣờng LB lỏng 28oC Lấy 100µl dung dịch khuẩn tiếp tục ni cấy 100ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 28ºC qua đêm Đo OD đến OD đạt 1- 1,5, thu dịch khuẩn li tâm 5000 vòng/phút 20 phút để thu cặn tế bào Rửa cặn hai lần 10ml 1mM HEPES (N-2-hydroxyethypiperazine- N’- 2- ethanesulfonic acid) pH 7,0 34 Cặn tế bào đƣợc hòa tan 500-700µl 10% glycerol Chia 50µl dịch tế bào vào ống eppendorf, làm lạnh nhanh nito lỏng giữ chủng 85ºC Tế bào khả biến đƣợc sử dụng để tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến phƣơng pháp xung điện 2.4.4.2 Biến nạp vector chuyển gen pBI121-GA20 vào A.tumefaciens Vector chuyển gen mang gen GA20 đƣợc biến nạp vào tế bào A tumefaciens phƣơng pháp xung điện Phƣơng pháp dựa sở tạo lỗ màng có tác dụng điện cực lớn, cho phép phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng xâm nhập vào bên tế bào theo điện trƣờng Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Làm tan tế bào khả biến A.tumefaciens đá 30 phút - Bổ sung 5µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến, trộn đặt đá 15 phút - Dùng pipet chuyển dung dịch sang cuvette dùng máy xung điện đƣợc làm lạnh từ trƣớc - Bắn xung điện 25µF, 400Ω, 2.5kV - Bổ sung 300µl mơi trƣờng LB lỏng vào cuvetter chuyển sang ống eppendorf 2ml lắc 28oC từ 1-1,5 để tế bảo hồi phục - Cấy trải 50µl dịch tế bào biến nạp mơi trƣờng chọn lọc LB đặc có bổ sung rifamycin 100mg/l, kanamicine 100mg/l 2.4.4.3 Tuyển chọn dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen GA20 - Nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens sau biến nạp môi trƣờng LB đặc có bổ sung rifasmicine 100mg/l, kanamicine 100mg/l Sau đó, chọn số khuẩn lạc to trịn để ni mơi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh để tách plasmid kiểm tra - Tách plasmid để kiểm tra: phƣơng pháp giống với tách plasmid E.coli 35 - PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GA20: thành phần hóa học chu trình nhiệt thực giống nhƣ khếch đại plasmid từ E.coli DH5α - Cắt kiểm tra plasmid cặp enzyme giới hạn SacI SmaI Bảng 2.13 Thành phần cắt plasmid cặp enzyme giới hạn SacI SmaI Thành phần H2O deion Buffer 10X Plasmid SmaI SacI Tổng Thể tích (µl) 10 1 20 Phản ứng đƣợc thực 37oC Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% 2.4.4.4 Nuôi cấy lƣu trữ chủng Agrobacterium tumefaciens mang gen GA20 Chọn chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58 biến nạp vector chuyển gen mang gen GA20 10 – 20 dòng khuẩn lạc, ni bảo quản theo quy trình sau: - Ký hiệu tên cho dòng khuẩn lạc; - Lấy khuẩn lạc nuôi cấy 10 ml dung dịch môi trƣờng LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc; - Nuôi qua đêm tủ nuôi khuẩn với nhiệt độ 28oC, lắc 200 vịng/phút; - Hút 700 µl dịch vi khuẩn ni qua đêm + 300 µl glycerol trộn đều; - Làm đông nhanh dung dịch khuẩn nitơ lỏng; - Bảo quản ống chủng - 85oC 36 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết gắn đuôi c-myc vào gen GA20 PCR Kết gắn đuôi c-myc vào gen GA20 sử dụng lần lƣợt cặp mồi cặp mồi GA20-SmaI_F1 GA20 - c-myc_R1; GA20-SmaI_F1 c-myc – Sac_R1 thu đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 1176 bp Băng vạch thu đƣợc cho kết rõ ràng 1176 Hình 3.1 Kết c-myc vào gen GA20 PCR 3.2 Kết tách dòng GA20 – c-myc vector pBT Đoạn gen thu đƣợc tách dịng vector pBT dịng hóa tế bào vi khuẩn E.coli Thực phản ứng CPR để chọn lọc dòng vi khuẩn mang gen plasmid tái tổ hợp pBT – GA20 – c-myc cần thiết Kết thu đƣợc băng có kích thƣớc 1340kb kích thƣớc gen GA20 – c-myc ( 1176kb) khoảng từ gen đến mồi (164kb) 37 1340 bp Hình 3.2 Kết colony – PCR chọn lọc dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp GA20 – c-myc – pBT 3.3 Kết thiết kế vector chuyển gen GA20 – pBI121 3.3.1 Cắt pBI121 vector tách dòng GA20 – c-myc – pBT enzyme SacI SmaI Hình 3.3 Sơ đồ vị trí cắt gen pBI121 Gen GUS có kích thƣớc 1883bp nên sau loại bỏ khỏi vector pBI121 ta thu đƣợc băng vạch có kích thƣớc 12871 ~13kb kích thƣớc gen pBI121 sau đƣợc loại bỏ gen GUS Điện di sản phẩm cắt gel agarose 1% thu đƣợc băng vạch rõ ràng băng có kích thƣớc 2,7kb kích thƣớc vector pBT, băng có kích thƣớc 1,1kb (chính xác 1176kb) kích thƣớc gen GA20 – c-myc 38 12871 bp 2705 bp 1176 bp 1883 bp Hình 3.4 Điện di sản phẩm cắt vector pBT – GA20 – c-myc vector pBI121 để loại bỏ gen GUS SacI SmaI 3.3.2.Ghép nối gen GA20 vào vector pBI121 biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α Sau gel tiến hành nối gen GA20 thu đƣợc với vector pBI121 để tạo vector tái tổ hợp pBI121 – GA20 Sau tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vi khuẩn E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt ( 420C thời gian 90 giây) Hình 3.5 Kết biến nạp vector pBI121 – GA20 vào E.coli 39  Sử dụng colony – PCR để chọn dòng khuẩn mang vector mong muốn Từ hình 3.6 kết việc chọn ngẫu nhiên dòng E.coli để kiểm tra dòng mang vector mong muốn, cho thấy dòng khuẩn xuất băng vạch kích thƣớc gen GA20 – c-myc 1176bp 1176 bp Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR dòng khuẩn E.coli 3.4 Tạo chủng Agrobecterium tumefaciens C58 3.4.1.Kết biến nạp vector pBI121 – GA20 vào vi khuẩn A.tumefaciens Tế bào vi khuẩn sau biến nạp đƣợc ni mơi trƣờng LB đặc có bổ sung rifamimycin 100mg/ml, kanamycin 100mg/ml 280C Hình 3.7 Khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens môi trường chọn lọc, sau biến nạp vector pBI121 – GA20 40 Từ hình 3.7 cho thấy khuẩn lạc nhiều, to trịn, chứng tỏ hiệu biến nạp tƣơng đối cao Đây kết sau 48h nuôi cấy đĩa peptri 3.4.2 Sàng lọc vi khuẩn mang vector chuyển gen Để kiểm tra sàng lọc dòng vi khuẩn chứa gen mong muốn ta tiến hành phản ứng colony – PCR ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc Kết đƣợc biểu hình 3.8 Hình 3.8 Sản phẩm PCR nhân gen GA20 từ plasmid tách dòng Từ kết hình 3.8 cho thấy băng vạch thu đƣợc có kết 1176 bp phù hợp với cấu trúc gen pBI121 – GA20 Điều chứng tỏ chúng tơi tạo đƣợc dịng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen chƣa gen pBI121 – GA20 nhƣ mong muốn 3.4.3 Lƣu trữ chủng vi khuẩn agrobecterium tumefaciens Các chủng sau đƣợc kiểm tra chứa gen pBI121 – GA20 đƣợc bảo quản nhiệt độ - 85oC để bảo quản sử dụng cho thí nghiệm sau 41 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 K ết luận  Đã tạo đƣợc cấu trúc vector chuyển gen mang GA20 (pBI121 – GA20 – c-myc)  Chọn đƣợc dòng vi khuẩn E.coli DH5α mang vector chuyển gen chứa gen GA20  Biến nạp thành công vector pBI121 – GA20 vào vi khuẩn A.tumefaciens C58 4.2 Kiến nghị  Có thể sử dụng vector pBI121 – GA20 làm nguồn vật liệu phục vụ nghiên cứu chọn tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen có sức sinh trƣởng nhanh 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Lê Trọng Bình (2008), phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch (chủ biên) (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXB Nông nghiệp Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trịnh Đình Đạt (2007), Cơng nghệ sinh học, tập 4: Công nghệ di truyền, NXB giáo dục Nguyễn Đức Thành (2003), chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vũ Văn Vụ, Lê Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học, tập 2: Công nghệ sinh học tế bảo, NXB giáo dục Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak (2003), dịch: “Công nghệ sinh học phân tử nguyên lý ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp” NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh Akira Nakayama, Masamoto Nakajima, Isomaro Yamaguchi (2005), “Distribution of Gibberellin and Expressional Analysis of GA 20-oxidase Genes of Monring glory Fruit maturation” Biosci Bitechnol Biochem, 69,pp.334-342 10.Clemente MT and Marquez AJ (1999) Site-directed mutagenesis of Glu297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine Plant Mol Biol 40: 835-845 11.Jia S.R (2004) Transgenic Cotton, Science Press, Beijing/New York 12.Gelvin S.B (2003), “Agrobacterium-mediated plant transformation the biology behind the “Gen-jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Review (27), pp 16-37 13.Gallardo F, Fu J, Cantón FR, García-Gutiérrez A, Cánovas FM and Kirby EG (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenicpoplar Planta 210: 19-26 14.Eriksson EE, Isaelsson M, Olsson O and Moritz T (2000) Increased gibberellin biosynthesis in transgenic tress promotor growth, biomass production and xylem fiber length Nature Biotechnology, 18:784-788 15.Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, Herna´ndez G (2001) Overexpression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations J Exp Bot52: 1071–1081 16.Suzuki S and Nakano M (2002), “Agrobacterium-mediated production of transgenic plants of Muscari armeniacum Leichtl.ex Bak”, Plant Cell Rep (20), pp 835-841 17.Cantón FR, Suarez MF, Jose-Estanyol M and Cánovas F (1999) Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts Plant Mol Biol 40: 623-634 18.Clemente MT and Marquez AJ (1999) Site-directed mutagenesis of Glu297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine Plant Mol Biol 40: 835-845 19.Cren M and Hirel B (1999) Glutamine synthetase in higher phants: Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell Plant Cell Physiol 40: 1187-1193 20.Fuentes SI, Allen DJ, Ortiz-Lopez A, Herna´ndez G (2001) Overexpression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and growth at low nitrogen concentrations J Exp Bot52: 1071–1081 21.Gallardo F, Fu J, Cantón FR, García-Gutiérrez A, Cánovas FM and Kirby EG (1999) Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenicpoplar Planta 210: 19-26 22.Guang-Long Wang, Wang, Fei Ai-Sheng Xiong Xiong, Feng (2015) Que, Zhi-Sheng Morphological Xu, Feng characteristics, anatomical structure, and gene expression: novel insights into gibberellin biosynthesis and perception during carrot growth and development Horticulture Research 2, Article number: 15028 (2015) 23.Stéphanie M, Bernard and Dimah ZH (2009) The importance of cytosolic glutamine synthetase in nitrogen assimilation and recycling New Phytologist 182: 608–620 24.Zhong PJ, Gallardo F, Pascual MB, Sampalo R, Romero J, de Navarra AT and Cánovas FM (2004) Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase New Phytologist164: 137–145 25 Bevan M, Barnes WM, Chilton MD Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T – DNA Nucleic Acids Res 1983 Jan 25;11(2) 26 Lange T, Hedden P, Graebe JE (1994) Expression cloning of a Gibberellin 20-oxidase, a multifunctional enzyme involved in Gibberellin biosynthesis Proc Nalt Acad Sci USA 91: 8552 – 8556 27.A.L Phillips, D.A Ward, S Uknes, N Appleford, T Lange, A.K Huttly, P Gaskin, J.E Graebe, P Hedden (1995) Isolation and expression of three gibberellin 20-oxidase cDNA clones from Arabidopsis Plant Physiol 28 Bala Jamel, Mohd Hasnain Hussain, Mohd Azib Salleh, Noraini Busri (2011) Isolation and Characterization of the GA 20-Oxidase cDNA from Sago Palm (Metroxylon sagu Rottb.) AsPac J Mol Biol Biotechnol Vol 19 (2): 83-93 29 Bernard R Glick., Jack J Pasternak., Cheryl L Patten (2010) Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA ASM Press American Soclety for Microbiology 1752 N St NW Washington, th edition 30 Bhatttacharya A., Kourmpetli S., Davey M.R (2010) Pratical applications of manipulating plant architecture by regulating gibberellin metabolish Plant Growth Regul 29: 249 – 256 31.Biemelt S., Tschierch H., Sonnawald U.(2004) Impact of altered gibberellin metabolish on biomass accumulation, lignin biosynthesis and photosynthesis in transgenic tobacco plants Plant Physiol 135: 254 – 265 32.Bob B Buchanan., Wilhelm Gruissem , Russell L Jones ,(2015) Biochemistry and Molecular Biology of Plants, 2nd Edition American society of plant biologists, pp 770-771 33.Carrera E., Bou J., Garcia - Martinet J., Prad S (2000) Changes in GA20 - oxidase gene expression strongly effect stem length, tuber induction and tuber yield of potato plants Plant Biol (Stuttg) 22(3): 247 – 256 34.Curtis, I.S., Ward, D.A., Thomas, S.G., Philips, A.L., Davey, M.R., Power, J.B., Lowe, K.C., Croker, S.J., Lewis, M.J and Magness, S.L (2000) Induction of dwarfism in transgenic Solanum dulcamara by overexpression of a gibberellin 20-oxidase cDNA from pumpkin Plant Journal 23:329-338 35.Ellen H Colebrook, Stephen G Thomas, Andrew L Phillips and Peter Hedden (2014) The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress The Journal of Experimental Biology 217, 67-75 36 Eriksson E.E., Isaelsson M., Olsson O., Moritz T (2000) Increased gibberellin biosynthesis in transgenic trees promotes growth, biomass production and xylem fiber length Nature Biotechnology 18: 784 - 788 37.Hedden P, Croker SJ (1992) Regulation of gibberellinsbiosynthesisinmaize seedlings See Ref 52a, pp 534–44 38 JaeHong Kim, InSun Yoon, MiYoung Lee1 (2006) Effects of light on the feedback control of GA-20 oxidase gene homolog in DongJinByeo seedlings Journal of Environmental Biology; 27(2) 367-371 39.Jia, Q., Zhang, J., Westcott, S., Zhang, X.Q., Bellgard, M., Lance, R and Li, C (2009) GA-20 oxidase as a candidate for the semidwarf gene sdw1/denso in barley Functional Integrative Genomics 9(2): 255-262 40 Jian Huang, Ding Tang , Yi Shen , Baoxiang Qin , Lilan Hong , Aiqing You , Ming Li , Xin Wang , Hengxiu Yu , Minghong Gu , Zhukuan Cheng (2010) Activation of gibberellin 2-oxidase decreases active gibberellin levels and creates a dominant semi-dwarf phenotype in rice (Oryza sativa L.) J Genet Genomics (37) pp 23−36 41 Jonathan Dayan, Maayan Schwarzkopf, Adi Avni and Roni Aloni (2010) Enhancing plant growth and fiber production by silencing GA 2- oxidase Plant Biotechnology Journal (8), pp 425–435 42.K Nishii, M J Ho, Y W Chou, D Gabotti, C N Wang, A Spada, and M Möller (2014) GA2 and GA20-oxidase expressions are associated with the meristem position in Streptocarpus rexii (Gesneriaceae) Plant Growth Regul., vol 72, no 2, pp 123–140 43.Kauschmann, A., Jessop, A., Koncz, C., Szekeres, M., Willmitzer, L., and Altmann, T (1996).Genetic evidence for an essential role of brassinosteroids in plant development Plant J 9,701–713 44 Kobayashi M, Yamaguchi I, Murofushi N, Ota Y, Takahashi N (1988) Fluctuation and localization of endogenous gibberellins in rice Agric Biol Chem 52:1189–94 45.Koornneef, M., Bentsink, L and Hilhorst, H (2002) Seed dormancy and germination Curr Opin Plant Biol 5, 33–36 Một số trang Web 46.https://vi.wikipedia.org/wiki/Gibberellin 47.https://tailieu.vn/tag/gibberellin.html 48.https://123doc.org/document/971916-tai-lieu-chat-kich-thich-sinh-truongauxin-va-gibberellin-docx.htm 49.http://www.khoaluan.vn/tai-lieu_gibberellin_194672