Nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng sắn ở đông yên quốc oai hà nội

Ả : “Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng Sắn Đông Yên – Quốc Oai – Hà Nội” T T T ù V ấ Qúy ầy V y S ứ s q ì T q ấ ì ự sự ì ú V s H s V V T s y T S y s T H y ữ s ầy GS.TS ù V - V ữ T T V s ì ữ ú q ý ỡ ự ú ứ s y ù s s s T ì ự è ú ỡ ! Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2018 Sinh viên u n n p HƯƠ G T 1.1 G QU V GHI U Enzyme amylase ú 1.1.1 1.1.2 V s y s 10 1.1.3 ụ 1.1.4 Tì ì 1.2 y s y s s 10 ứ y s 11 Enzyme cellulase 12 y 1.2.1 s 12 ụ 1.2.2 1.2.3 V s y s 13 y s 13 y 1.2.4 1.2.5 Tì ì ứ HƯƠ G s 14 I U GV ụ 2.1 s 14 HƯƠ G H GHI U 16 ứ 16 ứ 16 2.2 2.3 V 2.4 T 16 ụ ụ ấ 16 ụ g ụ 2.4.1 2.4.2 H 16 ấ 16 ứ 17 2.5 2.5.1 17 2.5.2 17 2.5.3 s 2.5.4 ứ 2.5.5 ầ ấ 3.2.1 s s T QU V TH T 3.2 s HƯƠ G 3.1 ữ s 2.5.6 ự q VSV s y y 19 19 s y s U y 20 21 23 s ấ 23 y s s 23 23 q 3.2.2 3.2.3 Q s s y y s 24 s s s 25 q 3.3 s y s 3.3.1 s 27 27 q 3.3.2 3.3.3 Q s s ấ ấ 3.4.1 3.4.3 Q s T U s 27 s y s s 30 s 30 q 3.4.2 y s s s s 28 q 3.4 y s y y s s ấ s 30 s s s ấ s 32 V I GH 34 34 34 À ỆU HA KHẢO A H 1.1 s VSV s 3.1 T 3.2 3.7 s ấ 23 q 24 s V q 3.5 3.6 ấ cellulase 14 ầ 3.3 3.4 Ả 26 27 s X T1 29 q 30 s 2 33 A H H H Hì 1.1 Cấu trúc không gian c α-amylase Hì 1.2 ấu trúc khơng gian c β-amylase Hì 1.3 ấu trúc không gian c a glucoamylase Hì 1.4 Cấu trúc khơng gian c a enzyme pullulanase Hì 1.5 Cấu trúc khơng gian c a oligo-1,6-glucosidase Hì 1.6 Quá trình th y phân tinh b i xúc tác c a m t s lo i enzyme amylase 10 Hì 1.7 Hì 2.1 S Hì 3.1 Hì Hì 3.2 Si Hì 3.3 Hì Hì 3.4 S tác dụng c a cellulase 13 y s 23 y s 3.6 S s X s y s ấ V 24 27 y s Hì h 3.5 Hì Hì ấ 17 s X 27 30 s S 30 Ấ y y ù y ẽ s ự ấ y : sử ụ ầ ự …H y 300.000 ấ ự s y s 500 ấ US Q sử ụ q ấ s s ấ ấ y s s ấ Ở ù s c ta l s ấ y ấ ấ y ú.V ứ ứ s VSV ứu, nhà máy E y y ụ s ầ q sử ụ V y Vì ứ s ự V ấ s y s ú y ấ s ụ ấ q ý y sẵ V ự y ữ ự ầ s s sử ụ V ì ự ự ì s VSV s y ú tài: “Nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào số chủng vi sinh vật phân lập từ đất trồng Sắn Đông Yên – Quốc Oai – Hà Nội” HƯ UA Ấ H U 1.1 Enzyme amylase 1.1.1 K n m tn v t y s y y y ấ s y ú y y s y y s y s s s s ỗ y s y s : ử ự p Pullulanase -1,6-glucosidase hay s ys y y y y s y γ- y s ; : E y s y α-dextrin 6- E y α- OH – RH + R’ H y s y c: ứ : R.R.’ + H – OH Amylase E ứ ys ì amylase β-amylase glucoamylase (amyloglucosidase y ữ y y ầ ỗi polysaccharide tn a) v t enz me α-amylase (1,4-α-glucan glucanhydrolase) α- y s ỗ nhau, ầ α- y s α-amylase y s Ty y acid aspartic (Asp) ấ α- y s y T Glu) s ¼ : - 10 ys (Cys) T α- y s α- y s ứ -COOH NH3 trung tâm α- y s H4)2SO4 25 - 30%, α- y s 60% α- y s y ấ globuline ẳ ù G H ù y α- y s αữ 48 H y s ụ y T y ẳ H Bacillus acidocadarius H Bacillus licheniformis - 5,7 35 y α-amylase ùy 60 -70o y 80 - 90o s H nh 1.1 Cấu trúc không gian α-amylase (http://luanvan.net.vn/luanvan/luan-van-nghien-cuu-thu-nhan-enzym-a-amylase-tu-truc-khuan-co-kho74448/) ụ : α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) α-1,4ấ s y αQ y s ự ỉ y ys ì y y y ấ α-a y s : q ì y q G dextrin hóa G y s y s Maltotetrose, maltotriose maltose T ụ s α- α- s y s y s y s ỉ y ấ T y y ấ tose K α- y s ấ y ì Vì y s y tn b) y s y v y y y s t ụ β-mylase (α-1,4 glucan- maltohydrolase) E y β- y s y ứ -SH βs C1 y y s y y ứ s ụ y ụ y β- Es s y y β- 60.000 E y y s ỉ ỗ y β- y s H ữ H=3-4 β-amylase 50 - 65o β-amylase 70o β- ấ y y s β- ẹ ỉ y s y s ụ ụ +2 ữ α- H nh 1.2 Cấu trúc không gian β-amylase (http://luanvan.net.vn/luanvan/de-tai-tong-quan-ve-enzyme-ngoai-bao-bacillus-subtilis-38776/) ụ β- y s : β- α-1 y β- ầ ụ y s 54 - 58% y s ầ β T E y y s y α-1,6 y y s β-amylos β- ỉ ầ ầ Q ì y y y ử s y y α-1 y s ứ y ầ ẳ tn v c) t lu o m l se (α-1,4 glucan- glucohydrolase) y ữ ú T ấ ys y s ấ ấ ữ 27.000 112.000 y s ứ y s T ấ HƯ Thành phần s l 3.1 c từ ất khu v T K UẢ À HẢO U ng vi sinh v t có mẫu ất thu th p ơn n s VSV ấ ù Sử ụ s ứ CFU/g = A.1/k.1/V q ảng 3.1 hành ph n mật độ chủng vsv từ m u đất l ẫu n n k uẩn m VSV( CFU/g) k uẩn ấm m ất ẫu 3,1.106 4.106 2,4.106 ẫu 2,6.106 4,2.106 1,7.106 ẫu 2,5.106 3,7.106 2.106 S ấ 4.1 7.106 - 4.106 CFU ấ 5.106 – 3,1.106 CFU X ấ ứ ấ 1,7.106 – 2,4.106 CFU/g 3.2 K t p n l p v k uẩn oạt t n m l se v ellul se 3.2.1 Phân lâp v k uẩn T ấ s ầ ầ : K1, K2, K3, K4 K1 K2 K4 K3 33 H nh 3.1 H nh ảnh khu n lạc chủng vi khu n đ phân lập đ 23 c ỉ 3.2.2 K t k ả n n s n enz me m l se v cellulase S ự ụ v k uẩn ỗ lugol 1%, y s 1% V q cellulase thu s : H nh 3.2 Sinh t ng h p amylase trái cellulase phải chủng VK ảng 3.2 ết đo đ ng k nh v ng phân giải Hoạt t n enz me H n vsv - d (mm) Amylase Cellulase VK K1 16,5 ± 0,18 14,3 ± 0,12 VK K2 17,4 ± 0,18 15,3 ± 0,21 VK K3 17,8 ± 0,15 - VK K4 18,3 ± 0,23 16,8 ± 0,14 t - T q s y s s õ Tấ y s s 4 i enzyme, s y s H = 18 cellulase 24 y ấ H = 16,8 (mm) ấ y s V y y s H = 16 se H = 14,3 (mm) u n s t s 3.2.3 sn ểm s n oạt t n o S s K4, K2 q n v k uẩn s y ự ấ VK s s ì Tì V q 3.3 25 ấ ú ảng 3.3 Các đ c m sinh h c chủng K4, K2 ểm Ch n g VK Mau sắ Hình dạng Bắt Kích t ớc Vi (mm) n B m t m u Gram Hin dạn d KH R Kh Tr VKK4 Tron 0,3-0,7 + Hi X Tr ụ Vi VK K2 Tron 0,2- 0,4 Nhẵ Hi + ầ ỗ s 26 Hin ản k uẩn lạ Hin ản d k n ển v 3.3 K t p n l p k uẩn oạt t n m l se v ellul se n l p k uẩn 3.3.1 T ấ ầ T1 ầ T2 T2 T1 H nh 3.3 H nh ảnh khu n lạc chủng phân lập đ 3.3.2 K t k ả n n s n enz me m l se v cellulase S ự ụ c k uẩn ỗ gol 1%, y s 1% q cellulase thu s : H nh 3.4 Sinh t ng h p amylase trái cellulase phải chủng XK ảng 3.4 ết đo đ ng k nh v ng phân giải Hoạt t n enz me H n vsv Amylase - d (mm) Cellulase XK T1 10,3 ± 0,11 15,2 ± 0,1 XK T2 9,6 ± 0,17 - ú - 27 T q y s ì 3.5 3.4 T2 T1 H = 10 C T2 s T1 s H=96 H = 15 , T2 cellulase u n s t s tn sn s k ấ T1 3.3.3 ểm s n n k uẩn oạt o S s T1 s y ấ, XK s q s Q ự s ấ ì ú ì q s 28 ảng 3.5 Các đ c m sinh h c chủng XK T1 ểm Chun Dan Kích u sắ k uẩn Hình dạng t ớc Mép m t B b o tử (mm) Tr L M T XK T1 0,7 – 1,5 ụ s thành dày màu dày ụ 29 Tron Hin ản k uẩn lạ Hin ản b o tử d kn ển v 3.4 K t p n l p nấm s oạt t n m l se v ellul se 3.4.1 Phân lâp nấm s T ấ s ầ ầ : N1, N2, N3 N1 N2 N3 H nh 3.5 H nh ảnh khu n lạc chủng nấm s i phân lập đ 3.4.2 K t k ả n n s n enz me m l se v o ellul se S ự ụ c nấm s ỗ gol 1%, y s congo red % V q cellulase thu s : H nh 3.6 Sinh t ng h p amylase trái cellulase phải chủng NS ảng 3.6 ết đo đ n vsv ú ng k nh v ng phân giải Hoạt t n enz me H - d (mm) Amylase Cellulase - ấ 9,2 ± 0,19 ấ 12,8 ± 0,23 16,6 ± 0,32 ấ 13,3 ± 0,15 15,13 ± 0,27 30 T s ì y s S s y s y ấ y y s ấ.V H = 13 3 H=92 H = 16 3s y cellulas h 31 u n s t s 3.4.3 S s ấ mylase Q n nấm s s y ự ấ ú s ì s ấ s q ì S 32 o s s oạt t n s n s N3 s ểm s n s ì ấ q 3.7 ảng 3.7 Các đ c m sinh h c củả chủng N2 N3 ểm ng ấm u ắ ấ T sữ T ấ Hn K dạn t H m t cm T s ụ H n ản s tử T 2- 2,5 T s o y s 2,5- T 3cm s 33 nấm H n ản s b o tử nấm d KH K U ÀK H K t lu n T ữ q ứ s s VSV mylase amylase ỷ VSV V s ấ s amylase y , ấ ấ ấ ất ấ 100% amylase K4 : s VSV VSV s s s s 11%, : ấ 33,3 % ,2 22 2% VSV s V VSV K nn s ấ ị ự s ứ ụ VSV ự ấ cellulase y s ứ ữ ứ : y VSV s X y enzyme emy s ấ s s s VSV s y s y protease, chitinase 34 ỆU HA TÀI KHẢO Ệ y y sinh vật h c H X ì Q y ứ y V Ty (2001) Vi ụ Q y y 2003 “ sinh t ng h p đ c m cellulase Aspergillus H niger RNNL-363”, Báo q S ấ H Y 304-307 (2007), Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm s i phân lập từ ngập m n C n Gi ” s s T S TpHCM T ì Q y ì T y S T 2007 “ uy n ch n nghiên cứu ảnh h ởng yếu tố môi tr ng lên khả sinh t ng h p cellulase chủng Penicilium SP DTQ-H 1” T Gs.Ts y s ứ ấ H c 2004 - “ Ô G Q GHỆ E ZY E” - G T H H 2003 “ nh chất khả thuỷ phân tinh bột sắn số amylase vi sinh vật” T S 25 ấ S A H Abada E A E - Production and Characterization of a Mesophilic Lipase Isolated from Bacillus stearothermophilus AB-1, Pakistan Journal of Biological Sciences 11 (2008) Annamalai N., Elayaraja S., Vijayalakshmi S and Balasubramanian, T - Thermostable, alkaline tolerant lipase from Bacillus licheniformis using peanut oil cake as a substrate, African Journal of Biochemistry Research (2011) 176-181 Hiroshi T, Satoshi T, Makoto O, Yoshihiko A, Takahisa K, Mitsuo S “G O, f s f basidiomycete Irpex lacteus and its cDNA expression in S y s s ” s 69 (2005) (7), p 1262-1269 10.Baldwin, Toby M "Study on extracellular alpha amylase of Aspergillus genus, United States Patent Application.( 2008) ị ỉ Webs tes http://www.Sigmaaldrich.com/Area-ofInterest/Biochemicals/Enzymehttp://En.wikipedia.org/wiki/Amylase,cellulase#column http://luanvan.net.vn/default Ơ H tr ờn OẠ p n l p nấm s Ơ RƯ Ử tr ờn nuô l n nấm s Czapek - dox (g/l) PDA (g/l) Khoai tây 200 g NaNO3 3g Glucose 20g KH2PO4 1g Agar 20 g MgSO4.7H2O 0,5 g pH KCl 0,5 g Saccarose 30 g pH ô tr ờn p n l p k uẩn Gause I (g/l) T 20 g MgSO4.7H2O 3g enzym(g/l) K2HPO4 3g Agar KNO3 1g NaCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 20 g pH mô tr ờn t oạt t n 17 g ấ: ô tr ờn 1g p n l p v k uẩn LB (g/l) ấ 5g Nacl 5g Pepton 10 g Agar 15 - 20 g pH