Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cho giống mây lá đơn (calamus simplifolius wei)

LỜI CẢM ƠN! Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ths Bùi Văn thắngTrung tâm giống & Công nghệ sinh học, Đại học Lâm Nghiệp tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ, động viên tơi q trình thực khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn KS Nguyễn Thị Mai Dương – Viện sinh thái Rừng & môi trường, hướng dẫn bảo tận tình, giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy Hồ Văn Giảng – Giám đốc Trung tâm Giống Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn đến giảng viên Vũ Kim Dung tận tình giúp đỡ, bảo tơi q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo khoa Lâm Học Đại học Lâm Nghiệp tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị - Trung tâm giống công nghệ sinh học - Trường Đại học Lâm Nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện cho q trình thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè người động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, tháng năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Thứ MỞ ĐẦU Ở Việt Nam nhiều nƣớc khu vực Đông Nam Á nhƣ Thái lan, Indonesia, Lào …, nghề mây tre đan giữ vai trò đặc biệt quan trọng phát triển kinh tế xã hội Nghề mây tre đan giải công ăn việc làm cho nhiều ngƣời dân lúc nông nhàn, tạo sản phẩm hàng hóa đáp ứng nhu cầu tiêu dùng xuất khẩu, góp phần xố đói giảm nghèo, tăng thu nhập hỗ trợ ngành khác phát triển Vì vậy, đẩy mạnh phát triển loại nghề thủ công này, đƣợc xem bƣớc đắn để giải triệt để toán kinh tế, xã hội, môi trƣờng số vùng nƣớc Do đặc tính bền, đẹp, đa tác dụng sản phẩm từ Mây đƣợc ngƣời dân sử dụng làm vật dụng phục vụ sống hàng ngày, đồ thủ công mỹ nghệ xuất Tuy nhiên hầu hết làng nghề Mây tre đan nƣớc ta gặp phải khó khăn thiếu hụt nguyên liệu nguồn nguyên liệu khơng đảm bảo chất lƣợng dẫn đến tính ổn định không cao Những năm gần Bộ Nông nghiệp & PTNT có chƣơng trình đầu tƣ mở rộng diện tích trồng Mây nguyên liệu gắn với phát triển bền vững làng nghề Để nâng cao đƣợc xuất, chất lƣợng nguyên liệu Mây việc cải thiện yếu tố thâm canh việc cải thiện chất lƣợng giống phải đƣợc đặc biệt quan tâm Giống Mây đơn (Calamus simplicifolius Wei) giống có nguồn gốc từ đảo Hải Nam, Trung Quốc có chất lƣợng tốt, xuất cao đƣợc gây trồng phổ biến tỉnh phía Nam Trung Quốc Trong chƣơng trình hợp tác, Viện nghiên cứu Lâm nghiệp nhiệt đới Viện hàn lâm khoa học Lâm nghiệp Trung Quốc chuyển giao công nghệ nhân giống in vitro lƣợng mẫu giống Mây đơn cho trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam Mặc dù qui trình nhân giống Mây đơn phƣơng pháp nuôi cấy in vitro đƣợc phía Trung Quốc chuyển giao Tuy nhiên hiệu suất qui trình nhân giống in vitro phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: Điều kiện phịng thí nghiệm loại hoá chất sử dụng (chất đa lượng, vi lượng, vitamin, chất điều hồ sinh trưởng,…), điều kiện ni cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, giá thể…), kĩ thuật ni cấy điều kiện khí hậu, đất đai… Do để áp dụng qui trình vào sản xuất có hiệu cao cần phải hồn thiện cơng đoạn cho phù hợp với điều kiện Việt Nam Xuất phát từ sở lựa chọn đề tài “Nghiên cứu hồn thiện quy trình kĩ thuật nhân giống in vitro cho giống Mây đơn (Calamus simplicifolius Wei)” làm khố luận tốt nghiệp Hy vọng góp phần đƣa giống Mây mới, có xuất cao, chất lƣợng tốt vào gây trồng Việt Nam phục vụ cho phát triển trồng rừng sản xuất, cung cấp nguyên liệu bền vững cho làng nghề Nội dung nghiên cứu thuộc phần đề tài cấp sở, Đại học Lâm nghiệp “Nghiên cứu phát triển giống mây đơn (Calamus simplicifolius Wei), đƣợc tuyển chọn Trung Quốc cho số tỉnh miền Bắc – Việt Nam” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Tính tồn tế bào Haberlandt (1902) lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ phân hóa mang tồn lƣợng thơng tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh Đó tính tồn tế bào [19] Tính tồn tế bào mà Haberlandt nêu sở lý luận phƣơng pháp ni mô tế bào thực vật Cho đến ngƣời hoàn toàn chứng minh đƣợc khả tái sinh tạo thành thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ 1.1.2 Sự phản phân hóa phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trƣởng thành thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồi từ tế bào (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh chƣa mang chức riêng biệt (chuyên hóa) Sau tế bào phôi sinh tiếp tục đƣợc biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho mơ, quan có chức khác Sự phân hóa tế bào chuyển tế bào phơi sinh thành tế bào mơ chun hóa, đảm nhận chức khác Ví dụ, mơ dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mơ bì làm nhiệm vụ bảo vệ Q trình phân hóa tế bào biểu thị Tế bào phôi sinh → tế bào giãn→ tế bào phân hóa có chức riêng biệt Tuy nhiên, tế bào phân hóa thành tế bào có chức chun, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi mình, điều kiện cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hóa tế bào, ngƣợc lại với phân hóa tế bào Về chất phân hóa phản phân hóa q trình hoạt hóa, ức chế gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen đƣợc hoạt hóa tính trạng mới, cịn số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chƣơng trình đƣợc mã hóa cấu trúc phân tử DNA tế bào khiến cho trình sinh trƣởng phát triển thể thực vật ln đƣợc hài hịa Mặt khác tế bào nằm khối mô thể thƣờng bị ức chế tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào giảm kích thƣớc khối mô tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt hóa gen tế bào Quá trình phát sinh hình thái ni cấy mơ, tế bào thực vật thực chất kết trình phân hóa phản phân hóa tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực chất kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật, cách định hƣớng dựa vào phân hóa phản phân hóa tế bào sở tính tồn tế bào thực vật Để điều khiển phát sinh hình thái ni cấy mô tế bào thực vật, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào mơi trƣờng hai nhóm chất điều hịa sinh trƣởng auxin cytokinin Tỉ lệ hàm lƣợng hai nhóm chất điều hịa sinh trƣởng khác mơi trƣờng tạo phát sinh hình thái khác Trong môi trƣờng nuôi cấy nồng độ auxin/cytokinin lớn phát sinh hình thái mô theo hƣớng tạo rễ, tỉ lệ nuôi cấy nhỏ mơ ni cấy phát sinh theo hƣớng tạo chồi, tỉ lệ cân đối phát sinh theo hƣớng tạo mơ sẹo (callus) [1] 1.2 Các nhân tố ảnh hƣởng tới q trình nhân giống in vitro 1.2.1 Thành phần mơi trƣờng dinh dƣỡng Ở thời kì Haberlandt tiến hành thí nghiệm ni cấy tế bào thực vật Nhƣng vào thời kì hiểu biết nhu cầu dinh dƣỡng khống mơ tế bào thực vật hạn chế, đặc biệt vai trò chất điều hòa sinh trƣởng hầu nhƣ chƣa đƣợc khám phá Chính mà Haberlandt khơng thành cơng Đến có hàng trăm loại mơi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đƣợc xây dựng thử nghiệm có kết Hầu hết loại mơi trƣờng gồm nhóm chất sau: Các loại muối khống, nguồn bon, vitamin, chất điều hịa sinh trƣởng, nhóm chất bổ sung, chất độn 1.2.1.1 Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi mô tế bào thực vật đƣợc chia thành hai nhóm: nhóm đa lƣợng nhóm vi lƣợng + Các ngun tố khống đa lƣợng Bao gồm nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng nồng độ 30ppm (30mg/l) Những nguyên tố N, S, P, K, Mg, Ca Riêng Na Cl đƣợc sử dụng vài môi trƣờng nhƣng chƣa rõ tác dụng chúng - Nitơ (N): Đƣợc sử dụng hai dạng NO3- NH4+ riêng rẽ phối hợp với Hầu hết thực vật có khả khử nitrat thành amonium thơng qua hệ thống nitrat reductase Amonium đƣợc tế bào thực vật đồng hóa trực tiếp để sinh tổng hợp chất hữu nhƣ axit amin Điều đáng lƣu ý dùng amonium sinh trƣởng tế bào giảm, chí ngừng hồn tồn Ngun nhân trình trao đổi ion tế bào xảy lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH môi trƣờng Cụ thể: dùng nitrat độ pH môi trƣờng giảm dần tế bào hấp thu NO3- NH4+ thải ngồi mơi trƣờng loại ion có giá trị tƣơng đƣơng Khi pH tăng trình trao đổi Fe tế bào đi, kết tế bào sinh trƣởng chậm lại Vì hầu hết loại mơi trƣờng dùng nitrat amonium dạng phối hợp nhƣng tùy theo đặc tính hấp thu nitơ lồi mà phối hợp theo tỉ lệ thích hợp - Lƣu huỳnh (S) : Chủ yếu tốt muối SO42- Các dạng ion khác nhƣ SO32- SO2 thƣờng tác dụng chí cịn gây độc - Photpho (P) : Mơ tế bào thực vật ni cấy có nhu cầu photpho cao P thành phần cấu trúc phân tử axit nucleic Ngồi khơng khí photpho dạng H2PO4 HPO4 cịn có tác dụng nhƣ hệ thống đệm làm ổn định pH mơi trƣờng q trình ni cấy + Các nguyên tố vi lƣợng Là nguyên tố đƣợc sử dụng nồng độ thấp 30ppm Đó Fe, B, Mn, Mo, Cu, Zn, Ni, Co - Sắt (Fe): Thiếu sắt tế bào khả phân chia Thiếu Fe làm giảm hàm lƣợng RNA giảm sinh tổng hợp protein, nhƣng làm tăng hàm lƣợng DNA axit amin tự do, kết giảm phân bào Fe thƣờng tạo phức hợp với thành phần khác pH thay đổi, phức hợp thƣờng khả giải phóng Fe cho nhu cầu trao đổi chất tế bào Tốt nên sử dụng Fe dạng chelat với citrat với EDTA (Etylen Diamin Tetraacetic Acid) Từ phức chất Fe đƣợc giải phóng phạm vi pH rộng - Mangan (Mn): Thiếu Mn làm hàm lƣợng axit tự DNA tăng dần, nhƣng lƣợng RNA sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến phân bào - Bo (B): Thiếu Bo môi trƣờng gây nên biểu nhƣ thừa auxin thực tế B làm cho chất ức chế auxin oxydase tế bào giảm Mô nuôi cấy có biểu mơ sẹo hóa mạnh nhƣng thƣờng mô xốp mọng nƣớc tái sinh - Molipden (Mo): Là ion đóng vai trị co-factor hệ thống nitrat reductase, nhƣ Mo tác động trực tiếp lên trình trao đổi đạm tế bào thực vật [1] 1.2.1.2 Nguồn bon Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, nhiều trƣờng hợp chúng sống bán dị dƣỡng nhờ điều kiện tự nhiên ánh sáng nhân tạo lục lạp có khả quang hợp Vì việc đƣa vào mơi trƣờng nuôi cấy nguồn bon hữu điều bắt buộc Nguồn bon thông dụng đƣợc kiểm chứng saccarose Nồng độ thích hợp phổ biến 2-3%, song phụ thuộc vào mục đích ni cấy mà thay đổi, có xuống tới 0,2% (chọn dịng) tăng lên 12% ( nhằm cảm ứng ức chế nƣớc) Tiếp đến glucose maltose hay đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy (glucose cho nuôi cấy protoplast maltose cho nuôi cấy bao phấn lúa) Các loại đƣờng khác nhƣ fructose, raffinose, lactose, galactose đƣợc thử nghiệm, nhƣng tỏ hiệu đƣợc dùng trƣờng hợp đặc biệt 1.2.1.3 Vitamin Mặc dù loại mô tế bào ni cấy in vitro có khả tự tổng hợp hầu hết loại vitamin, nhƣng thƣờng không đủ lƣợng, phải bổ sung thêm từ bên ngồi vào đặc biệt vitamin thuộc nhóm B - Vitamin B1(Thiamin HCl aneurin) : Là chất bổ sung cần cho môi trƣờng nuôi cấy Khi khử trùng cách hấp nhiệt độ cao, B1 bị nhiệt phân thành pirimidin thiazol hai cấu tử B1 Vì khơng thiết phải khử trùng phƣơng thức khác nhƣ lọc - Vitamin B2 (Riboflavin, lactoflavin): Có thể tiệt trùng nhiệt, nhƣng lại dễ bị ánh sáng phân hủy Đối với nuôi cấy sáng dùng nồng độ 0.1ppm, nhƣng nuôi cấy tối tăng lên 10-50ppm - Vitamin B6 (Pyridoxin, ademin) tiền chất pyrodoxanphosphat – cofactor nhóm enzym nhƣ enzym cacboxydase transaminase Khi hấp nhiệt độ cao phản ứng xảy ra: pyridoxin+phóphat→ pyridoxanphosphat 1.2.1.4 Các chất điều hịa sinh trƣởng Trong mơi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng định kết nuôi cấy chất điều hòa sinh trƣởng, chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm sau: + Auxin: Đƣợc gọi hoocmon sinh trƣởng Went Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trƣởng tế bào, nhƣ làm tăng phân bào Có loại auxin thƣờng đƣợc sử dụng nuôi cấy mô là: - Indolyacetic acid (IAA) tồn tự nhiên - Naphthylacetic acid (NAA) - 2,4-Dichlophenoxyacetic acid (2,4-D) - Indolylbutyric acid (IBA) Riêng IAA auxin tự nhiên lại auxin nhân tạo Thƣờng auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh auxin tự nhiên đặc điểm phân tử chúng nên enzym oxi hóa auxin (auxinoxidase) khơng có tác dụng Kinh nghiệm sử dụng auxin nuôi cấy mô : lúc đầu sử dụng nồng độ cao sau thấp để tránh tình trạng mơ bị nhiễm độc + Cytokinin: hoocmon phân bào lần đƣợc Skoog (khoảng 1950) phát thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất Đó cấu tử acid nucleic bị phân hủy thành có loại cytokinin đƣợc sử dụng nuôi cấy mô [1] - Kinetin sản phẩm đƣợc phát đầu tiên, có cấu trúc phân tử là: 6(2-furfuryl)- aminopurin Kinentin đƣợc phân lập từ chế phẩm DNA cũ axit nucleic sau hấp nhiệt độ cao hay đun sôi Trong thể sống khơng có kinetin tồn Sản phẩm kích thích phát sinh chồi thuốc nuôi cấy, nhƣng phối hợp xử lí auxin tỷ lệ nồng độ thích hợp kích thích q trình phân chia tế bào (do có tên kinetin) Kinetin thực chất dẫn xuất bazơ hữu adenin, nhƣ coi chất nhân tạo Trong tự nhiên có tồn hoocmon phân bào không? Letham ngƣời phân lập tinh chế cho kết tinh thành công hoocmon phân bào tự nhiên, nội nhũ dạng sữa hạt ngơ Hợp chất cytokinin tự nhiên đƣợc gọi zeatin (zea = ngô) [1] - Zeatin dẫn xuất adenin Cơng thức hóa học zeatin là: 6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) aminopurin Trong thực tiễn nuôi cấy, ngƣời ta dùng zeatin trƣờng hợp đặc biệt q đắt, mà thƣờng sử dụng kinetin số sản phẩm nhân tạo Đó là: 6benzylaminopurin - BAP (6-benzylaminopurin) : hoạt lực BAP cao nhiều so với kinetin thân BAP bền vững zeatin nhiệt độ cao + Gibberellic acid: đƣợc phát vào năm 1930 Lịch sử phát nhóm hoocmon 1895 ngƣời Nhật nói bệnh lúa von 1926 phát đƣợc bệnh loài nấm Gibberlla fujikuroi gây Đến năm 1930 phân lập tinh chế đƣợc hoạt chất đƣợc gọi Gibberellic Tới phát đƣợc 60 loại thuộc nhóm giberellin Loại gibberellin thông dụng nuôi cấy mô GA3 Trong đời sống thực vật, gibberellin đóng vai trị nhiều trình sinh lý nhƣ: sinh lý ngủ nghỉ hạt chồi, phát triển hoa, kích thích tăng trƣởng chiều cao Nhƣng ni cấy mơ tế bào thực vật tác động gibberellin chƣa thật rõ ràng Nhiều tác giả có sử dụng coi thành phần khơng thể thiếu loại mơi trƣờng chun dụng + Abscisic acid (ABA): ABA thuộc nhóm chất ức chế sinh trƣởng Abscisic acid có tác dụng tăng cƣờng khả chống chịu tế bào thực vật với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, ABA đƣợc đƣa vào mơi trƣờng tái sinh mang lại hiệu định + Etylen: etylen có biểu tác động hai chiều, kìm hãm hình thành chồi giai đoạn sớm nhƣng lại kích thích chồi phát triển giai đoạn muộn Trong số trƣờng hợp etylen kích thích hình thành rễ nhƣng số trƣờng hợp khác lại kìm hãm q trình [2] 1.2.1.5 Các hỗn hợp chất tự nhiên Các nhà sáng lập ngành nuôi cấy mô thƣờng sử dụng môi trƣờng đơn giản gồm muối khoáng đƣờng Ngày ngƣời ta khẳng định loại môi trƣờng đơn giản nhƣ khơng đủ tế bào sinh trƣởng bình thƣờng Vì thành phần mơi trƣờng ngày phong phú, đầy đủ phức tạp hơn, ngƣời ta sử dụng số hỗn hợp dinh dƣỡng tự nhiên sau: + Nƣớc dừa: từ năm 1941 đƣợc sử dụng để nuôi phôi Datura năm 1949 nuôi mô Daucus Kết phân tích thành phần nƣớc dừa từ non đến già Tulecke cộng (1961) cho thấy nƣớc dừa có: - Amino acid tự do: đạt nồng độ 190,5 ppm đến 685 ppm nƣớc dừa tùy theo tuổi tính từ non đến già Khi hấp nhiệt độ cao cịn 70 ppm - Amino acid dạng liên kết có protein peptid - Acid hữu - Đƣờng - ARN ADN Ngồi nƣớc dừa cịn chứa hợp chất quan trọng tế bào nuôi phân lập nhƣ: myo inositon, chất có hoạt tính auxin, cytokinin dạng glycoside [19] Bảng 3.10: Kết ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo hồn chỉnh Cơng NAA IBA thức (mg/l) (mg/l) Tỷ lệ Số Số chồi chồi cấy rễ Chiều % Số rễ dài rễ chồi tb/chồi tb rễ (cm) Chất lƣợng mô R1 0,5 - 30 26 86,67 2,2 3,4 Tốt R2 1,0 - 30 25 83,33 2,3 3,3 Tốt R3 1,5 - 30 24 80,00 2,5 3,4 Tốt R4 2,0 - 30 23 76,67 2,2 3,2 Tốt R5 - 0,5 30 24 80,00 2,3 3,3 Tốt R6 - 1,0 30 27 83,33 2,1 3,4 Tốt R7 - 1,5 30 25 90,00 2,1 3,1 Tốt R8 - 2,0 30 26 79,67 2,3 3,3 Tốt R9 0,5 0,5 30 25 83,33 2,1 3,5 Tốt R10 1,0 0,5 30 23 76,67 1,9 3,5 Tốt R11 1,5 0,5 30 25 83,33 2,3 3,3 Tốt R12 2,0 0,5 30 22 73,33 2,1 3,4 Tốt R13 0,5 1,0 30 30 100,00 2,5 3,5 Tốt R14 1,0 1,0 30 25 83,33 2,3 3,3 Tốt R15 1,5 1,0 30 23 76,67 2,1 3,4 Tốt R16 2,0 1,0 30 25 83,33 2,4 3,2 Tốt ĐC 0,0 0,0 30 25 83,33 2,0 3,3 Tốt T ỷ lệ % chồi rễ 100 80 60 40 20 R1 R3 R5 R7 R9 R11 R13 R15 ĐC Tỷ lệ % chồi rễ Biểu đồ 3.6: Ảnh hƣởng IBA NAA đến khả rễ chồi 47 Bảng 3.11: Kết phân tích thống kê tiêu tỷ lệ % chồi rễ ANOVA Source of P- Variation SS df MS F Between value F crit 1.3E- Groups 18713 2079.2 61.472 Within Groups 676.5 20 33.823 Total 19389 29 12 2.3928 Bảng 3.12: Kết phân tích thống kê tiêu số rễ tb/chồi Source of SS df MS F P-value F crit Variation Between Groups 1.048 0.116444 0.879933 0.558391 2.392814 Within Groups 2.646667 20 0.132333 Kết cho thấy môi trƣờng bổ sung IBA NAA có tác dụng tích cực đến việc tạo rễ in vitro cho chồi mây đơn Tỷ lệ rễ, số rễ trung bình/chồi, chiều dài trung bình/ rễ cơng thức thí nghiệm có biến động Kết phân tích phƣơng sai cho thấy xác suất F tính tiêu tỷ lệ chồi rễ lớn F 0,05 nhiều chứng tỏ cơng thức nồng độ khác có ảnh hƣởng khơng giống đến khả rễ chồi mây đơn Kết tổng hợp bảng 3.10 cho thấy: Trên cơng thức thí nghiệm tỷ lệ tạo rễ cao, 70% số chồi nuôi cấy tạo rễ Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5mg/l – 1,0mg/l – 1,5mg/l tỷ lệ rễ tăng dần từ 80,00% - 83,33% - 90,00%, tiếp tục tăng nồng độ lên 2,0mg/l tỷ lệ rễ giảm xuống 79,67% 48 Với NAA nồng độ 0,5mg/l tỷ lệ rễ đạt 86,67% nồng độ tăng từ 1,0mg/l – 1,5mg/l – 2,0mg/l tỷ lệ rễ lại giảm dần từ 83,33% - 80,00% - 76,67% Nguyên nhân tƣợng nồng độ chất điều hoà sinh trƣởng tăng cao dẫn đến tƣợng tế bào mô phân sinh đỉnh bị ức chế hoạt động làm cho tỷ lệ rễ bị giảm dần Do nhân giống in vitro cần phải đặc biệt quan tâm tới việc bổ sung hợp lí chất kích thích sinh trƣởng nồng độ thích hợp cho chồi phát sinh rễ Khi kết hợp IBA với NAA nồng độ khác cho tỷ lệ rễ 70%, Công thức cho tỷ lệ tạo rễ cao công thức R13 (bổ sung 0,5mg/l NAA 1mg/l IBA) 100%, cao nhiều so với công thức đối chứng R17 đạt 83,33% Đây cơng thức có số rễ/chồi cao cơng thức thí nghiệm (trung bình 2,5 rễ/chồi) Số rễ tb/chồi chiều dài rễ không chịu ảnh hƣởng nồng độ IBA NAA (F tính =0,88 F 0.05 =3, chứng tỏ thành phần giá thể khác ảnh hƣởng khác đến tỷ lệ sống mây in vitro vƣờn ƣơm Ở hàng Column có F tính = 52,99 > F 0,05, chứng tỏ chế độ che sáng khác ảnh hƣởng khác đến tỷ lệ sống mây mầm vƣờn ƣơm Kết tổng hợp bảng 3.13 cho thấy: Ở công thức U1 giá thể 100% đất tỷ lệ sống đạt 40%, chất lƣợng khơng tốt có tƣợng héo, thân có màu vàng Khi đóng giá thể 100% cát che sáng 75% tỷ lệ sống lên tới 85%, khỏe mạnh, thân có màu xanh đậm, phát triển nhanh rút ngắn đƣợc giai đoạn vƣờn ƣơm Cùng chế độ che sáng 75% thành phần giá thể 50% đất : 50% cát, tỷ lệ sống đạt 58%, nhiên khỏe mạnh thân có màu xanh đậm Khi thay đổi chế độ che sáng xuống 25% tỷ lệ sống thấp (U9 đạt 32%, U10 đạt 35%, U11 đạt 38% U12 đạt 25%)chất lƣợng ngồi vƣờn ƣơm kém, khẳng định ánh sáng ảnh hƣởng lớn đến khả sống in vitro vƣờn ƣơm 53 Biểu đồ 3.7 thể rõ chế công thức U2 tốt cơng thức thí nghiệm, tỷ lệ sống đạt 85%, chất lƣợng mầm tốt Số đƣa hồi xanh sau tuần vƣờn ƣơm, sinh trƣởng phát triển mây in vitro đƣợc cúng tipế tục theo dõi Nhƣ với giá thể 100% cát, chế độ che sáng 75% phù hợp cơng thức thí nghiệm, mây in vitro vƣờn ƣơm đạt tỷ lệ sống cao (85%), chất lƣợng tốt Cây mây in vitro vườn ươm sau tuần ươm Cây mây in vitro vườn ươm sau năm tuổi Ảnh 7: Mây in vitro vƣờn ƣơm 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Môi trƣờng MS* (cải tiến) bổ sung 8,0 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi cao sau tuần nuôi cấy 7,34 lần, số chồi tb tạo thành đạt 23,5 chồi/cụm, chất lƣợng chồi tốt (chồi có màu xanh, mập) 1.2 Mơi trƣờng MS* có bổ sung GA3 than hoạt tính nồng độ hàm lƣợng khác ảnh hƣởng đến khả kích thích tăng trƣởng chồi Mơi trƣờng thích hợp mơi trƣờng có bổ sung 0,5mg/l GA3 2g/l than hoạt tính, sau tuần ni cấy, chiều cao trung bình chồi đạt 5,5cm, trung bình lá/chồi 1.3 Mơi trƣờng MS* có bổ sung 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l IBA, sau tuần nuôi cấy cho tỷ lệ rễ cao 100%, trung bình 2,5 rễ/chồi, chiều dài rễ tb 3,5cm 1.4 Giá thể phù hợp cho việc ƣơm mầm mây đơn in vitro 100% cát chế độ che sáng 75% phù hợp cho tỷ lệ sống đạt 86%, chất lƣợng tốt sau tuần ƣơm vƣờn ƣơm Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu chế độ chăm sóc vƣờm ƣơm để nâng cao tỷ lệ sống - Sử dụng kết nghiên cứu đạt đƣợc giống mây đơn vào thử nghiệm cho nhân giống loài mây nƣớc 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Lê Trần Bình (1997), Cơng nghệ sinh học cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lê Văn Chi (1992), Cách sử dụng chất điều hoà sinh trưởng vi lượng hiệu cao”, NXB Khoa học – Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Thùy Dƣơng (2007), Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch ( Tectona grandis Linn) phương pháp in vtro, Luận văn Thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp, ĐH Lâm nghiệp Hồ Văn giảng, Vũ Thị Huệ, (2006), “Xây dựng qui trình nhân giống Dó trầm kĩ thuật ni cấy mơ – tế bào”, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn, (1),tr 45-47 Lê Đình Khả, Dƣơng Mộng Hùng (2003), Giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đoàn Thị Mai cộng (2000), “ Kết bƣớc đầu nhân giống Bạch đàn lai phƣơng pháp nuôi cấy mô phân sinh”, Tạp chí Lâm nghiệp, (10), tr 46-47 Đồn Thị Mai cộng (2005), “ Bƣớc đầu ứng sụng công nghệ mơ- hom nhân giống Trầm hƣơng”, Tạp chí NN&PTNT, (2), tr57-67 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Hồng Nghĩa, (2001), Nhân giống vơ tính trồng rừng vơ tính, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 10 Vũ Ngọc Phƣợng cộng (2002), “ Nhân giống in vitro Tre tàu (Sinocalamus latiflorus) Tre mạnh tơng ( Dendrocalamus asper)”, Tạp chí sinh học, (6), tr 59-64 11 Nguyễn Quang Thạch (2005), Giáo trình cơng nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 56 12 Phạm Thị Kim Thanh (2006), Nghiên cứu nhân giống thông caribaea ( Pinus caribaea Morelet) phương pháp nuôi cấy in vtro, Luận văn Thạch sĩ khoa học Lâm nghiệp, ĐH Lâm nghiệp 13 Nguyễn Kim Thanh (2005), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Hà Nội 14 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 15 Đoàn Thị Ái Thuyền cộng (2005), “Nhân giống vơ tính Hơng (Paulowvina fortunei Hemsi) phƣơng pháp ni cấy mơ”, Tạp chí sinh học, (9), tr 46-50 16 Khuất Hữu Trung cộng (2009), “Nghiên cứu nhân nhanh giống Gừng Hawaii từ nuôi cấy Merictem đánh giá ổn định di truyền gừng vi nhân giống”, Tạp chí NN & PNNT (1) 17 Nguyễn Hữu Tuất, Vũ Tiến Hinh, Ngô Kim Khơi (2006), Phân tích thống kê Lâm nghiệp, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 18 Nguyễn Văn Uyển (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2007), Công nghệ sinh học tập hai, NXB Giáo dục Tài liệu nƣớc 20 Anja H (1988), Seasonal changes in explant viability and contamination of tisue cuture, Springer Netherlands, p 211-222 21 Apichart Kao-ard, Verapong Suangtho and Erik D Kjar (1993), Exprence from tree improvement of Teck (Tectona grandis) in Thanland, Bangkok, Thanland 22 Barba, R.C.; Patena, L.J.; Mercado, M.M & Lorico, L 1985 Tissue cultureof rattan (Calamus manillensis H Wendl) Paper presented at the SecondNatl Symp on Issue Culture of Rattan Universiti Pertanian Malaysia 23 Chen Zhiying and Fan Kuan (1995) Rattan propagation and nursery in Yunnan Forest Science and Technology, (2): 24-25 57 24 Chen Zhiying, Fankun, Li Ying, Chen Sanyang and Duang Jinyu 1998 A study on rattan conservation in Yunnan Collected Research Papers on the Tropical Botany (IV) Pp 62-68 Yunnan University Press, Kunming, Yunnan 25 Darus H Ahmad (1994), Multipplication of Arica mangium by systemcutting and tissue culture techniques, Avances in tropical acacia reseach, p32-34 26 Dekkers, A.J and A.N Rao 1989 Some observations on in vitro culture of Calamus trachycoleus Pp 63-68 in Proceedings of the Seminar on Tissue Culture of Forest Species (A.N Rao and A.M Yusoff, eds.) Forest Research Institute Malaysia and International Development Research Centre, Singapore 27 Dransfield, J 1992a The Rattans of Sarawak Royal Botanic Gardens, Kew and Sarawak Forest Department 28 Dransfield, J 1992b The taxonomy of rattans In: Razali, W.M., J Dransfield & N Manokaran (eds) A Guide to the Cultivation of Rattan Forest Research Institute: Forest Record No 35 Kuala Lumpur Malaysia 29 Gunawan, L.W & Yani, S.A 1986 In vitro propagation of rattan Manan (Calamus manan Miq.) for agroforestry plantations p 282: Abstr VI Intl Congress of Plant Tissue and Cell Culture, Minneapolis, U.S.A 30 Lakshmana, A.C 1993 Rattan multiplication through tissue culture Pp 83-87 Rattans of South India Evergreen Publishers, Bangalore, India 31 Li Rong-sheng, Yin Guang-tian, Yang Jin-chang and Zou Wen-tao 2007 Rattan sector in Hainan Island, China Journal of forestry research, 18(2): Pp153-156 32 Liu Ying, Zeng Bingshan and Yin Guangtian 1998 Selection of appropriate cultures for proliferation and rooting in tissue culture of Daemonorops margaritae Forest Research, 11(2):Pp 152-155 58 MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Tính tồn tế bào 1.1.2 Sự phản phân hóa phân hóa tế bào 1.2 Các nhân tố ảnh hƣởng tới trình nhân giống in vitro 1.2.1 Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng 1.2.1.1 Các loại muối khoáng 1.2.1.2 Nguồn bon 1.2.1.3 Vitamin 1.2.1.4 Các chất điều hòa sinh trƣởng 1.2.1.5 Các hỗn hợp chất tự nhiên 1.2.1.6 Chất độn (thạch) 10 1.2.2 Điều kiện vật lý 11 1.2.3 Vật liệu nuôi cấy 12 1.2.4 Điều kiện vô trùng 12 1.2.5 Buồng nuôi cấy 13 1.3 ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU 13 1.3.1 Vị trí địa lý 13 1.3.2 Địa hình 14 1.3.3 Địa hình đất đai 14 1.3.4 Tình hình thực vật 14 1.3.5 Khí hậu thuỷ văn 14 59 1.4 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật công tác giống rừng 15 1.4.1 Trên giới 15 1.4.2 Ở Việt Nam 17 1.5 Tổng quan mây 19 1.5.1 Giới thiệu mây 19 1.5.2 Các nghiên cứu mây 21 1.5.2.1 Các nghiên cứu nƣớc 21 1.5.2.2 Các nghiên cứu nƣớc 23 Chƣơng 24 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.2.1 Nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật nhân nhanh chồi 24 2.2.2 Nghiên cứu hồn thiện kĩ thuật kích thích tăng trƣởng chồi 24 2.2.3 Nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật tạo in vitro hoàn chỉnh 24 2.2.4 Nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật đƣa invitro vƣờn ƣơm 24 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Vật liệu nuôi cấy 24 2.3.2 Địa điểm bố trí thí nghiệm 24 2.3.3 Phƣơng pháp luận 25 2.3.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 25 2.3.4.1 Nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật nhân nhanh chồi 25 2.3.4.2 Nghiên cứu hồn thiện kĩ thuật kích thích tăng trƣởng chồi 26 2.3.4.3 Nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật tạo in vitro hoàn chỉnh 28 2.3.4.4 Nghiên cứu kĩ thuật đƣa vƣờn ƣơm 29 2.3.5 Phƣơng pháp thu thập xử lí số liệu 29 Chƣơng 30 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết nghiên cứu hoàn thiện kĩ thuật nhân nhanh chồi 30 60 3.1.1 Ảnh hƣởng BAP đến khả nhân nhanh chồi Mây 30 3.1.2 Ảnh hƣởng tổ hợp kinetin BAP đến khả nhân nhanh chồi Mây 33 3.2 Kết nghiên cứu kích thích tăng trƣởng chồi 39 3.2.1 Ảnh hƣởng than hoạt tính đến khả chống nâu hóa ktttr chồi 39 3.2.2 Ảnh hƣởng GA3 đến kích thích tăng trƣởng chồi mây đơn 41 3.2.3 Ảnh hƣởng tổ hợp GA3 than hoạt tính đến kích thích tăng trƣởng chồi 43 3.3 Kết nghiên cứu tạo mơ hồn chỉnh 45 3.4 Nghiên cứu kĩ thuật chăm sóc ngồi vƣờn ƣơm 50 3.4.1 Kết xác định giá thể mây đơn in vitro điều kiện bên 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU 61