Khảo sát một số đặc điểm của chất khángsinh ở nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh bình dương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2014-2015 XÉT GIẢI THƯỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT" NĂM 2014 - 2015 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHẤT KHÁNG SINH Ở NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TỈNH BÌNH DƯƠNG Thuộc nhóm ngành khoa học: Ngành Sinh học TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊNTHAM GIA CUỘC THI SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2014-2015 XÉT GIẢI THƯỞNG "TÀI NĂNG KHOA HỌC TRẺ ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT" NĂM 2014 - 2015 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHẤT KHÁNG SINH Ở NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN TỈNH BÌNH DƯƠNG Thuộc nhóm ngành khoa học: Ngành Sinh học Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Tú Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp: C12SH01 Khoa: Khoa học Tự nhiên Năm thứ: Số năm đào tạo: Ngành học: CĐ Sư phạm Sinh học Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Anh Dũng UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Khảo sát số đặc điểm chất kháng sinh nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Xuân Tú - Lớp: C12SH01 Khoa: KHTN Năm thứ: Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: Ths Nguyễn Anh Dũng Mục tiêu đề tài: - Tìm dung mơi thích hợp cho việc tách chiết kháng sinh từ nấm sợi - Xác định số tính chất kháng sinh từ nấm sợi Tính sáng tạo: - Đề tài tiến hành địa bàn tỉnh Bình Dương - Thu kháng sinh thơ từ nấm sợi khả ứng dụng vào thức ăn chăn nuôi phòng ngừa số bệnh vi khuẩn Kết nghiên cứu: - Phân lập chủng nấm phân lập đất vườn tỉnh Bình Dương - Khảo sát khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập đất vườn tỉnh Bình Dương với vi sinh vật kiểm định phịng thí nghiệm trường ĐH Thủ Dầu Một cung cấp - Bước đầu tạo kháng sinh thô từ nấm sợi khả ứng dụng vào thức ăn chăn ni phịng ngừa số bệnh vi khuẩn Đóng góp mặt kinh tế - xã hội, giáo dục đào tạo, an ninh, quốc phòng khả áp dụng đề tài: - Đề tài góp phần mở rộng thêm kiến thức khả sinh kháng sinh nấm sợi phân lập từ đất vườn Vì tài liệu tham khảo cho sinh viên đam mê nghiên cứu khoa học - Thu kháng sinh thô từ nấm sợi khả ứng dụng vào thức ăn chăn ni phịng ngừa số bệnh vi khuẩn Công bố khoa học sinh viên từ kết nghiên cứu đề tài Ngày 13 tháng năm 2014 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài Nhận xét người hướng dẫn đóng góp khoa học sinh viên thực đề tài: - Sinh viên thực đề tài có tinh thần đam mê nghiên cứu khoa học ham học hỏi - Kết đề tài có tính khoa học cao Ngày 13 tháng năm 2015 Xác nhận lãnh đạo khoa Người hướng dẫn UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN Ảnh 4x6 Họ tên: Nguyễn Thị Xuân Tú Sinh ngày: 03 tháng 01 năm 1994 Nơi sinh: Tuy Phong – Bình Thuận Lớp: C12SH01 Khóa: VI Khoa: Khoa học Tự Nhiên Địa liên hệ: Hiệp Thành - Thủ Dầu Một – Bình Dương Điện thoại: 0983464540 Email: nguyenthixuantu94@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC * Năm thứ 1: Ngành học: CĐ Sư phạm Sinh học Khoa: Khoa học Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Trung bình Sơ lược thành tích: * Năm thứ 2: Ngành học: CĐ Sư phạm Sinh học Khoa: Khoa học Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Khá * Năm thứ 3: Ngành học: CĐ Sư phạm Sinh học Khoa: Khoa học Tự Nhiên Kết xếp loại học tập: Khá Sơ lược thành tích: Xác nhận lãnh đạo khoa TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ngày 13 tháng năm 2014 Sinh viên chịu trách nhiệm thực đề tài CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Bình Dương, ngày Kính gửi: 13 tháng năm 2014 Ban tổ chức Giải thưởng “Tài khoa học trẻ Đại học Thủ Dầu Một” Tên là: Nguyễn Thị Xuân Tú Sinh ngày 03 tháng 01 năm 1994 Sinh viên năm thứ: Tổng số năm đào tạo: Lớp, khoa : C12SH01 Ngành học: Sư phạm Sinh học Thông tin cá nhân sinh viên chịu trách nhiệm chính: Địa liên hệ: Hịa Minh – Tuy Phong – Bình Thuận Số điện thoại : 0983464540 Địa email: nguyenthixuantu94@gmail.com Tơi làm đơn kính đề nghị Ban tổ chức cho gửi đề tài nghiên cứu khoa học để tham gia xét Giải thưởng “Tài khoa học trẻ Đại học Thủ Dầu Một” năm 2014 - 2015 Tên đề tài: Khảo sát số đặc điểm chất kháng sinh nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương Tơi xin cam đoan đề tài thực hướng dẫn ThS Nguyễn Anh Dũng; đề tài chưa trao giải thưởng khác thời điểm nộp hồ sơ luận văn, đồ án tốt nghiệp Nếu sai, xin chịu trách nhiệm trước khoa Nhà trường Xác nhận lãnh đạo khoa Người làm đơn i MỤC LỤC Mục lục i Danh mục từ viết tắt iii Danh mục bảng biểu iv Danh mục hình v MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu đề tài .2 Phương pháp nghiên cứu .2 3.1 Phương pháp lấy mẫu .2 3.2 Phương pháp phân lập .2 3.3 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi 3.4 Khảo sát khả sinh kháng sinh 3.5 Phương pháp nuôi cấy môi trường dịch thể YEA 3.6 Phương pháp xử lí số liệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu .6 Bố cục đề tài CHƯƠNG I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1 Đại cương nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm nấm sợi 1.1.2 Hình thái cấu tạo 1.1.3 Đặc điểm sinh lí hóa sinh .11 1.1.4 Phương thức sinh sản .12 1.1.5 Phân loại nấm sợi 12 1.1.6 Ứng dụng nấm 14 1.2 Chất kháng sinh từ nấm 15 1.2.1 Lịch sử tìm chất kháng sinh từ nấm 15 ii 1.2.2 Những đặc điểm chất kháng sinh từ nấm sợi 17 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh kháng sinh nấm sợi 20 1.2.4 Chiết tách chất kháng sinh từ nấm sợi 21 1.3 Ứng dụng kháng sinh từ nấm sợi Việt Nam giới 23 CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 29 2.1.Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 29 2.1.1 Địa điểm 29 2.1.2 Thời gian 29 2.2 Vật liệu dụng cụ thí nghiệm 29 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 29 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 29 2.3 Môi trường nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 30 2.4.1 Tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu 30 2.4.2 Xác định khả bền nhiệt pH 31 2.4.3 Xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh 31 CHƯƠNG : KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 32 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi từ đất vườn tỉnh Bình Dương 32 3.2 Khảo sát khả sinh chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương 33 3.3 Định danh đến chi cho chủng nấm Đ2.4 35 3.4.Tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu 36 3.5 Khảo sát số điều kiện môi trường lên hoạt tính chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr – Đ2.4 37 iii 3.5.1 Ảnh hưởng pH lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr – Đ2.4 37 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm Tr – Đ2.4 39 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC Chương 2: QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM 2.1.Thời gian địa điểm tiến hành thí nghiệm 2.1.1 Địa điểm: - Phịng thí nghiệm Vi Sinh, Trường ĐH Thủ Dầu Một 2.1.2 Thời gian - Từ tháng 11/2013 – /2014 2.2 Vật liệu dụng cụ thí nghiệm 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu vi sinh vật kiểm định (Escherichia coli Bacillus subtilis) Phịng thí nghiệm vi sinh trường ĐH Thủ Dầu Một cung cấp - Các mẫu đất, mục, cành mục, thân mục…dùng để phân lập nấm sợi thu nhận vườn trồng địa bàn tỉnh Bình Dương 2.2.2 Dụng cụ thiết bị - Các dụng cụ thơng thường phịng thí nghiệm: ống nghiệm, erlen, becher, micropipette, đĩa petri… - Các thiết bị: phòng cấy vô trùng, tủ sấy, máy ly tâm, cân phân tích, kính hiển vi, máy đo pH, tủ giữ mẫu, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh,máy giập mẫu, máy li tâm, máy cô quay 2.3 Môi trường nghiên cứu MT1: Môi trường Potato Glucose Agar(Môi trườngPGA – môi trường phân lập nuôi cấy nấm sợi)[5] Glucose Khoai tây Agar Nước cất 20 g 200 g 20 g lít 28 - Cách chế dịch khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa Cân 250g, thái nhỏ, thêm 500ml nước, đun sôi, nhỏ lửa 30 phút, lọc lấy dịch MT2: Môi trường glucose Yeast Agar (Môi trườngYEA - nuôi cấy giữ giống nấm sợi) Glucose 20 g Cao nấm men 4g Agar 20 g Nước cất lít MT3: Mơi trườngMeat peptone agar(Mơi trường MPA - mơi trường nuôi cấy giữ giống VSV kiểm định) Peptôn 5g NaCl 5g Cao thịt 5g Thạch 20 g Nước cất lít MT4: Mơi trường Malt Extract Agar (mơi trường MEA - môi trường phân loại nấm sợi) Glucôza 20 g Peptôn 1g Malt Extract 20 g Thạch 20 g Nước cất lít Lưu ý: Các mơi trường trước đem sử dụng trùng 1atm 30 phút 2.4 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 2.4.1 Tách chiết kháng sinh thơ dung môi hữu Dịch lên men sau loại sinh khối tách chiết loại dung mơi hữu khác có độ phân cực tăng dầntheo số điện môi: n-Hexan, Dietyl eter, Cloroform, Ethylacetat, Methanol Tỉ lệ dịch lên men dung môi 1:1 theo đơn vị thể tích/thể tích Hỗn hợp dịch lên men dung môi lắc nhiệt độ phòng 30 phút đem thu hồi dung mơi bẳng phương pháp quay Sau thử hoạt tính kháng sinh cặn chiết vi sinh vật kiểm định (Escherichia coli Bacillus subtilis) phương pháp đục lỗ thạch phương pháp 3.5 Bên cạnh nghiệm thức đối chứng với mẫu dung môi hữu 29 2.4.2 Xác định khả bền chất kháng sinh pH - Khả bền pH chất kháng sinh đặc điểm cần ý có ý nghĩa cơng nghiệp tách chiết ứng dụng chất kháng sinh Để xác định khả bền pH chất kháng sinh chủng từ nấm sợi, tiến hành nuôi chủng môi trường YEA dịch thể, lắc máy lắc 160 vịng Sau – ngàyni cấy thu canh trường, đem li tâm, lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối thu dịch nuôi cấy - Điều chỉnh dịch nuôi cấy chứa chất kháng sinh mức pH từ – giữ nhiệt độ phịng 10 phút Sau đó, lại điều chỉnh pH dịch nuôi cấy mức pH = Xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ phương pháp 3.5 2.4.3 Xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh - Khả bền nhiệt chất kháng sinh đặc điểm cần nghiên cứu phục vụ cho công nghiệp tách chiết tinh chế chất kháng sinh có hiệu cao Để xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh từ nấm sợi tiến hành lên men chủng mơi trường thích hợp.Thu kháng sinh xử lí với nhiệt độ mức 40 oC, 60oC, 80oC,100oC thời gian 20,40,60 phút Hoạt tính kháng sinh xác định phương pháp đục lỗ thạch phương pháp 3.5 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi từ đất vườn tỉnh Bình Dương - Từ mẫu thân, cành khô, mục, đất mặt, đất sâu cách đất mặt không cm thu nhận sau lần lấy mẫu đất vườn tỉnh Bình Dương khoảng thời gian từ tháng 11 năm 2014 đến tháng năm 2015, sử dụng môi trường MT1, với phương pháp trình bày ởphần3.1, 3.2.Chúng tơi phân lập 81 chủng nấm sợi khác Trong có: - 15 chủng lấy từ phân hủy - 15 chủng phân lập từ cành mục - 17 chủng từ thân khô phân hủy 30 - 28 chủng phân lập từ đất mặt chủng từ đất sâu Bảng 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương vị trí lấy mẫu Mẫu Cành Đất sâu (≤ Lá Thân Đất bề mục mục mặt 3 17 3 18 3 16 3 17 3 3 13 Tồng cộng 15 15 17 28 81 Phần trăm 18,5% 18,5% 21% 34,6% 7,4% 100% Vị trí lấy mẫu mục P Phú Hòa – TDM – BD P Hiệp Thành – TDM – BD P Hiệp An – TDM – BD P Phú Cường – TDM – BD P Hòa Phú – TDM – BD Tổng cm) 40 34.6 35 28 30 25 18.5 20 15 15 21 18.5 17 15 10 7.4 nh Cà ục m y câ Lá ục m y câ â Th n ặt m ề tb Đấ ục m y câ qu g n hô k ặt m t Đấ cm Hình 3.1 Kết phân lập chủng nấm sợi phân 31 Số lượng Phần trăm lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương vị trí lấy mẫu Từ kết quảtrên cho thấy nấm sợi có mặt cơchất đất vườn tỉnh Bình Dương Tuy nhiên đất bềmặt có sốlượng chủng nhiều nhất.Vì đa sốnấm sợi sinh vật hiếu khí, lớp đất bềmặt thích hợp với chúng Bên cạnh xuất nhiều nấm sợi thân, cành, mục chứng minh cho khả sinh enzyme xenlulaza phân giải xenlulozơ Sựphân giải góp phần làmgiảm sựơ nhiễm mơi trường, tham gia vịng tuần hồn vật chất lưới thức ăn.Chính sựhiện diện nấm sợi nâng cao hiệu suất sinh thái đất vườn tỉnh Bình Dương 3.2 Khảo sát khả sinh chất kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương Từ 81 chủng phân lập, chúng tơi tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh với VSV kiểm định Bacillussubtilis (Vk Gram dương), Escherichia coli (Vk Gram âm) theo phương pháp trình bày mục3.4và kết trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Khả sinh kháng sinh chủng nấm sợi VSV kiểm định B subtilis Tỉ lệ E coli Tỉ lệ Số chủng nấm khảo sát 81 100% 81 100% Họat tính kháng sinh (D - d, mm) Mức độ họat tính Trung Yếu Mạnh bình 27 48 33,3% 59,3% 1,23% 14 11,11% 17.28% 0% Rất mạnh 0% 0% Tổng số chủng có hoạt tính KS 76 93,82% 23 28,39% Qua khảo sát khả sinh kháng sinh số chủng nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương, thấy phần lớn chủng nấm có khả sinh kháng sinh kháng vi khuẩn gram dương với 76/81 chủng chiếm 93,82%.Tuy nhiên khả đối kháng với vi khuẩn gram âm lại với 23/81 chủng khảo sát chiếm 28,39% Trong số 81 chủng khảo sát có 23 chủng vừa có khả đối kháng với vi khuẩn gram dương gram âm 32 Kết phù hợp với nghiên cứu Phan Thanh Phương (2007) nghiên cứu nấm sợi sinh kháng sinh rừng ngập mặn Cần Giờ; Nguyễn Thị Nhã Vy (2009) nghiên cứu khả đối kháng nấm sợi Đạt Lạt.[19], [21] Từ kết rút kết luận chất kháng sinh từ nấm sợinói chung nấm sợi phân lập từ đất vườn tỉnh Bình Dương nói riêng có khả đối kháng với vi khuẩn gram dương tốt với vi khuẩn gram âm Nguyên nhân kết bắt nguồn từ cấu trúc tế bào hai nhóm vi khuẩn Cũng từ kết trình khảo sát chúng tơi tiến hành tuyển chọn chủng nấm sợi có kí hiệu Đ2.4,chủng nấm vừa đối kháng với vi khuẩn gram âm E coli (D – d = 18 mm, trung bình) vi khuẩn gram dương B subtilis (D – d = 22 mm,mạnh) Trong chúng tơi quan tâm chủ yếu đến khả kháng vi khuẩn gram dương củachủng Đ2.4 cho nghiên cứu coli B Subtilis Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng Vk gramE.dương B subtilis Vk gram âm E coli chủng Đ2.4 3.3 Định danh đến chi cho chủng nấm Đ2.4 Đểgiúp cho nghiên cứu sâu chủng nấmĐ2.4tuyển chọn nói giúp cho việc ứng dụng vào thực tiễn, tiến hành quan sát đại thể vi thể chủng Đ2.4 theo phương pháp 3.3 Kết Khuẩn lạc dạng xốp trắng.Cuống sinh bào tử phân nhánh gốc 90 0.Bào tử trắng xanh mịn, không 33 A: Khuẩn lạc chủng Đ2.4B: Hình thái vi thểchủng Đ2.4 Hình 3.3 Đặc điểm đại thể, vi thể chủng nấm Đ2.4 Từ kết quan sát đại thể vi thể đối chiếu với khóa phân loại đến chi nấmTrichoderma Bùi Xuân Đồng (2004) Nguyễn Đức Lượng (2006) chúng tơi kết luận chủng nấm sợi Đ2.4 thuộc chi nấm Trichoderma Từ chúng tơi kí hiệu chủng Đ2.4 Tr-Đ2.4 3.4 Tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu Khả hòa tan chất kháng sinh loại dung môi khác Đây đặc điểm quan tâm tách chiết tinh chế chất kháng sinh.Với chất kháng sinh chủng Tr-Đ2.4.cũng khơng ngoại lệ Chính để tìm dung mơi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng sinh từ chủng Tr-Đ2.4 thực sau: Tiến hành nuôi cấy chủng Tr-Đ2.4 môi trường dịch thể YEA (thời gian, tốc độ lắc)thu dịch lên men Sau tách chiết kháng sinh thơ dung mơi hữu cơtheophương pháp 2.4.1 Kết trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng sinh cặn chiết từ loại dung môi STT Dung môi Hexan Diethyl eter Cloroform Ethyl axetat Methanol Hoạt tính kháng sinh (D-d,mm) Tr-Đ2.4 Đối chứng 0 ± 0.16 18 ± 0.32 0 ± 0.25 34 Clorofor Cloroform ĐC Hình 3.4 Hoạt tính đối kháng vi khuẩn B.subtilis cặn chiếttừ dịch hịa tan dung mơicloroform (Ghi - ĐC: Đối chứng) Năm loại dung môi sử dụng để tách chiết kháng sinh dung mơi thơng dụng có tính hịa tan tốt với độ phân cực tăng dần theo số điện môi Kết bảng 3.4 cho thấy cặn chiết từ dịch hịa tan dung mơi cloroform có hoạt tính kháng B subtilis D – d =18 mm Trong với dung mơi cịn lại cặn chiết cho hoạt tính kháng sinh yếu (Diethyl eter methanol) hay chí khơng có (Hexan ethyl acetat) Kết chất kháng sinh dịch ni cấy chủng Tr-Đ2.4 hịa tan tốt dung môi cloroform 3.5 Khảo sát số điều kiện mơi trường lên hoạt tính chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 3.5.1 Ảnh hưởng pH lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 Khả bền chất kháng sinh pH yếu tố quan trọng chất kháng sinh việc tách chiết ứng dụng chất kháng sinh Để xác định điều chúng tơi tiến hành thí nghiệm: chủng Tr-Đ2.4 ni cấy MT2, lắc 160 vịng Sau ngày nuôi cấy thu canh trường đem li tâm, lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối thu dịch nuôi cấy Điều chỉnh dịch nuôi cấy chứa chất kháng sinh mức pH từ – giữ nhiệt độ phòng 10 phút Sau đó, lại điều chỉnh pH dịch ni cấy mức pH = 7, thử hoạt tính đối kháng theo phương pháp kiểm tra hoạt tính đối kháng chủng nấm sợi mục 3.4 với chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.4 35 Bảng 3.4.Ảnh hưởng pH lên độ bền chất kháng sinhtừ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 pH D – d (mm) 16 ± 0,32 18 ± 0,16 20 ± 0,16 22 ±0,05 25 ±0,08 18 ±0,08 17 ± 0,16 D - d (mm) 30 24 25 22 20 20 18 18 16 17 15 10 5 9pH Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hưởng pH lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 Kết cho thấy chất kháng sinh từ chủng Tr-Đ2.4 có độ bền cao với pH cho khả kháng B subtilis mức độ trung bình sau chịu tác động pH acid 3, 4và pH kiềm 8, 9.Thậm chí cho khả đối kháng mạnh sau chịu tác động pH acid 5, Và với pH = khả đối kháng B subtilis mạnh D – d = 25 mm Kết kháng sinh chủng Tr–Đ2.4 có độ bền trước tác động pH cao Đây đặc điểm tốt đậy điều thuận lợi cho tách chiết ứng dụng chất kháng sinh từ chủng Tr - Đ2.4 vào thực tiễn 36 pH = pH = pH = Hình 3.6 Ảnh hưởng pH = 5, 6,7 lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền chất kháng sinh từ chủng nấm Tr – Đ2.4 Cũng giống với pH nhiệt độ yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến việc tách chiết ứng dụng kháng sinh Vì chúng tơi tiến hành khảo sát khảnăng bền với nhiệt độ kháng sinh từchủng Tr-Đ2.4 sau: Nuôi cấy chủng nấm Tr-Đ2.4 MT2 khơng có agar, lắc 160 vịng Sau ngày nuôi cấy thu canh trường đem li tâm, lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối thu dịch nuôi cấy Dịch chiết hoạt chất đối kháng thô đem giữ nhiệt độ 400C, 600C, 800C, 1000C với thời gian định (20, 40,60 phút) thửhoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm chứng vi khuẩnB subtilis Kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5.Ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bền chấtkháng sinh từ chủng nấm sợi Tr-Đ2.4 400C 600C 800C 1000C 20 phút 40 phút 22 20 17 16 16 13 60 phút 20 16 13 Nhiệt độ Thờ i gian 37 25 22 20 20 D - d (mm) 17 16 20 16 15 16 13 13 10 40 60 80 100 20 40 60 Thời gian Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ lên độ bềncủa chất kháng sinh từ chủng Tr-Đ2.4 Kết cho thấy kháng sinh tổng hợp từ chủng Tr-Đ2.4 có hoạt tính kháng khuẩn B subtilis giảm dần chịu tác động nhiệt độ thời gian tăng dần Mạnh 40oC giảm đáng kể nhiệt độ 100oC.Còn nhiệt độ 60oC 80oC hoạt tính có giảm sút so với 40oC mức trung bình khá.Điều chứng tỏ chất kháng sinh tổng hợp từ chủng Tr-Đ2.4 có khả bền nhiệt tốt Mặc dù nhiệt độ tách chiết, sử dụng bảo quản chất kháng sinh không nên q 50oC để khơng làm giảm hoạt tính 20 phút 40 phút 38 60 phút Hình 3.8.Ảnh hưởng nhiệt độ 400C lên độ bền chất kháng sinh từ chủng Tr-Đ2.4 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ Kết luận - Đã phân lập 81 chủng nấm sợi đó: 15 chủng lấy từ phân hủy, 15 chủng phân lập từ cành mục, 17 chủng từ thân khô phân hủy, 28 chủng phân lập từ đất mặt chủng từ đất sâu - Đã khảo sát khả sinh kháng sinh 81 chủng nấm sợi phân lập Kết có 76/81 chủng có khả kháng vi khuẩn gram dương (B subtilis) chiếm 93,82%; 23/81 chủng có khả kháng vi khuẩn gram âm (E coli) chiếm 28,39%; số có 23 chủng vừa có khả đối kháng với vi khuẩn gram dương gram âm - Đã tuyển chọn chủng nấm Đ2.4 thuộc chi Trichoderma có khả kháng vi khuẩn gram dương mạnh (D – d = 22 mm) kí hiệu Tr-Đ2.4 - Chất kháng sinh chủng Tr-Đ2.4 tổng hợp hịa tan tốt dung mơi cloroform - Chất kháng sinh chủng Tr–Đ2.4 tổng hợp có độ bền tốt chịu tác động pH kiềm lẫn acid Tuy nhiên pH hoạt động tốt cho chất kháng sinh - Chất kháng sinh chủng Tr-Đ2.4 tổng hợp có phổ hoạt động nhiệt cao hoạt động tốt 40oC, giảm dần nhiệt độ 60 oC 80oC cịn mức trung bình chí nhiệt độ 100oC hoạt động 39 20 Khuyến nghị - Vì thời gian thực đề tài có hạn, trang thiết bị ởphịng thí nghiệm ởmức cơbản Mong nghiên cứu sau tiếp tục: + Xác định chất chất điều kiện tách chiết tốt chất kháng sinh chủng Tr-Đ2.4 tổng hợp + Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết kháng sinh chủng Tr-Đ2.4 tổng hợp thực tiễn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bộ Y Tế (2007), “VSV Y học” , NXB Y học Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất khoa học kỹthuật, Hà Nội, tr 20-28 Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận án Thạc sĩSinh học, trường Đại học SưPhạm Hà Nội, tr 8- 23 Phạm ThịQuỳnh Châu (2001), Nghiên cứu hệ nấm mốc cà phê nhân số tỉnh miền nam Việt Nam, sơbộ định tính vài độc tố enzym sốloài nấm mốc cà phê nhân, Khóa luận cửnhân khoa học, Đại học Khoa học Tựnhiên, TP HCM, trang 10 Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập 1, 2, Nhà xuất ĐH Sưphạm, Hà Nội, (1) tr 196-203, (2) tr 270 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vât học (Tập I, II),Nhà xuất Đại học Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm ThịTrân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vât học (Tập III)Nhà xuất Khoa học & Kỹthuật, Hà Nội, tr 360 Trịnh ThịMỹDung (2003), Phân lập, khảo sát đặc điểm chủng xạ khuẩn phân lậptừ đất, khóa luận cửnhân Sinh học, Trường Đại học Sưphạm TPHCM, tr 4-10 Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin, Nhà xuất Khoa học Kỹthuật, Hà Nội, tr 137 10 Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật tổng hợp, Nhà xuất Khoa học & Kỹthuật, Hà Nội 40 11 Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định Thái Thụy, Thái bình, Luận án Thạc sĩSinh học, Trường Đại học SưPhạm Hà Nội, tr 5- 30 12 Bùi ThịViệt Hà, Kiều Hữu Ảnh (2002), Nghiên cứu khảnăng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật hai chủng xạkhuẩn T41 D- 42, Đại học Khoa học Tựnhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 13 13.Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chiSteptomyces sinh chất kháng sinh chống chất gây bệnh chè Thái Nguyên, luận văn thạc sĩ Sinh học, trường Đại Học Thái Nguyên, tr 11 14 Mai ThịHằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò visinh vật hệ sinh thái rừng ngập mặn, Trường Đại học SưPhạm, Hà Nội, tr 8-24, 101-128 15 Trương Phước Thiên Hoàng (2007),Khảo sát hoạt tính số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, peectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ Miền Đông Nam bộ, Luận án Thạc sĩSinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM, tr 5-11-1695 16 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh (T1,T2), Nhà xuất Đại học Quốc gia TPHCM, (2)tr 165 17 Lương Đức Phẩm – Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 18 Lê Lương Tề, VũTriệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng, Nhà xuất Giáo Dục 19 Phan Thanh Phương (2007), “Khảo sát khảnăng sinh kháng sinh chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ Tp HCM”, Luận văn thạc sĩ trường ĐH Sư Phạm Tp.HCM 20 Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh rừng ngập mặn Cần Giờ, Nhà xuất Nông nghiệp - TPHCM, tr 6- 17… 21 Nguyễn Thị Nhã Vy (2009), Nghiên cứu khả sinh hoạt chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh cho trồng chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại Học TPHCM Tiếng anh 22 Kenneth B.Raper (1965), The genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 310-315 Trang Web 23 http://www.vocw.edu.vn 41 24 http://www.aphios.com/ Natural solution for human health 25 http://www.vietsciences.org/khaocuu/nguyenlandung 26 http://www.wikipedia.org/wiki/khangsinh 27 http://www.uni-kl.de/biotech/home-ma.htlm 28 http://www.doctorfungus.org/the fungi/Trichoderma spiecies.html 42