Thông tin tài liệu
ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM nguyễn thị nõn Tên đề tài: lu an T n va Nghiên cứu số đặc tính chủng to gh tn Bacillus subtilis điều kiện in vitro nh»m t¹o p ie chÕ phÈm øng dơng chăn nuôi nl w d oa khóa luận TốT NGHIệP đại học u nf va an lu : Chính quy ll Hệ đào tạo oi m z at nh Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học : CNSH - CNTP Khoa : 2010 - 2014 z m co l gm @ Khoá học an Lu Thái Nguyên, 2014 n va ac th si ĐạI HọC THáI NGUYÊN TRƯờNG ĐạI HọC NÔNG LÂM ngun thÞ nõn Tên đề tài: T lu Nghiên cứu số đặc tính chủng an n va Bacillus subtilis điều kiện in vitro nhằm tạo khóa luận TốT NGHIệP đại học p ie gh tn to chế phẩm ứng dụng chăn nuôi nl w : Chính quy d oa Hệ đào tạo : Công nghệ Sinh häc : CNSH - CNTP Líp u nf va Khoa an lu Chuyên ngành : 42 - CNSH ll : 2010 - 2014 oi m Kho¸ häc z at nh Giảng viên hớng dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Viện Khoa học Sự sống - Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên z gm @ TS Nguyễn Văn Duy Khoa CNSH - CNTP, Trờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên m co l an Lu Thái Nguyên, 2014 n va ac th si lu an n va p ie gh tn to LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ người Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm, tồn thể thầy cô giáo Viện Khoa học Sự sống thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian học tập làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Quang Tuyên, chị Đỗ Bích Duệ, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện khoa học Sự sống thầy Nguyễn Văn Duy, giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nơng Lâm định hướng, dìu dắt tận tình hướng dẫn suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên lớp 42 CNSH, tồn thể bạn sinh viên thực tập phịng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ tơi Cuối cùng, tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người ln quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời chỗ dựa tinh thần lớn giúp tơi hồn thành tốt cơng việc giao suốt thời gian học tập thực khóa luận vừa qua oa nl w d Em xin chân thành cảm ơn! lu ll u nf va an Thái Nguyên, ngày 10 tháng năm 2014 Sinh viên oi m z at nh Nguyễn Thị Nõn z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.3: Các dụng cụ sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.4: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 22 Bảng 3.5: Thành phần môi trường MPA dịch thể 22 Bảng 4.1: Kết xác định khả chống chịu chủng Bacillus subtilis mơi trường pH axít thấp pH kiềm 27 lu an Bảng 4.2: Kết xác định khả chống chịu chủng Bacillus va n subtilis môi trường muối mật 30 tn to Bảng 4.3: Khả chống chịu axit dày muối mật chủng ie gh Bacillus subtilis môi trường dịch dày mô 32 p Bảng 4.4 Khả chống chịu muối chủng Bacillus subtilis 33 nl w Bảng 4.5: Khả ức chế chủng vi khuẩn kiểm định bốn chủng vi d oa khuẩn Bacillus subtilis 35 an lu Bảng 4.6: Kết xác định tính đối kháng chủng 37 ll u nf va Bảng 4.7: Khả kháng chất kháng sinh vi khuẩn 38 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình thái Bacillus subtilis 12 Hình 4.1: Khả chống chịu chủng Bacillus subtilis môi trường pH axit pH kiềm (CFU/ml) 28 Hình 4.2: Khả chống chịu chủng Bacillus subtilis môi trường muối mật (CFU/ml) 30 Hình 4.3: Khả chống chịu axit dày muối mật chủng lu Bacillus subtilis môi trường dịch dày mô 32 an Hình 4.4: Khả ức chế chủng vi khuẩn kiểm định 36 va n Hình 4.5: Khả đối kháng chủng Bacillus subtilis 37 p ie gh tn to Hình 4.6 : Khả kháng kháng sinh chủng MBS2 38 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si DANH MỤC VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ Từ thuật ngữ viết tắt lu Food and Agriculture Organization – Tổ chức Lương thực Nông nghiệp SCAN Scientific committee for anilmal nutrition – Ủy ban khoa học dinh dưỡng động vật MPA Malt-Peptone-Agar WHO World Health Organization – Tổ chức y tế Thế giới VSV Vi sinh vật CFU Colony form unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc KL Khuẩn lạc SKK Sinh khối khô cs Cộng an FAO n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu an 2.1 Giới thiệu chung probiotic va n 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu probiotic tn to 2.1.2 Định nghĩa Probiotic ie gh 2.1.3 Vai trò Probiotic p 2.1.4 Hệ vi sinh vật đường ruột tác động hệ vi sinh vật tới sức khỏe vật nuôi nl w 2.2 Cơ chế tác động Probiotic d oa 2.2.1 Probiotic sản sinh chất ức chế an lu 2.2.2 Cạnh tranh hóa chất/năng lượng với vi khuẩn khác va 2.2.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại ll u nf 2.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch oi m 2.2.5 Một số tác động khác z at nh 2.3 Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotic 2.4 Các vi sinh vật probiotic 10 z 2.5 Tính an tồn probiotic động vật 11 @ gm 2.6 Vi khuẩn Bacillus subtilis 12 m co l 2.6.1 Đặc điểm chủng Bacillus subtilis 12 2.6.2 Một số đặc tính probiotic Bacillus subtilis 16 an Lu n va ac th si 2.7 Tình hình nghiên cứu đặc tính probiotic Bacillus subtilis giới Việt Nam 17 2.7.1 Trên giới 17 2.7.2 Ở Việt Nam 18 PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 21 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 21 lu 3.3.1 Hóa chất 21 an 3.3.2 Các thiết bị nghiên cứu 21 va n 3.3.3 Các dụng cụ nghiên cứu 22 gh tn to 3.4 Môi trường sử dụng 22 p ie 3.5 Nội dung nghiên cứu 23 3.5.1 Nghiên cứu khả tồn phát triển Bacillus subtilis oa nl w mơi trường có pH axít thấp pH kiềm 23 3.5.2 Khả tồn phát triển Bacillus subtilis mơi trường có d an lu muối mật 23 u nf va 3.5.3 Thử nghiệm khả chống chịu axit dày muối mật Bacillus subtilis môi trường dịch dày mô 23 ll oi m 3.5.4 Ảnh hưởng NaCl đến sinh trưởng Bacillus subtilis 23 z at nh 3.5.5 Nghiên cứu khả Bacillus subtilis ức chế chủng vi sinh vật kiểm định 23 z 3.5.6 Kiểm tra tính đối kháng chủng Bacillus subtilis 23 gm @ 3.5.7 Khả kháng loại kháng sinh chủng Bacillus subtilis 23 l m co 3.6 Phương pháp nghiên cứu 23 3.6.1 Phương pháp hoạt hóa giống 23 an Lu 3.6.2 Phương pháp đếm số lượng tế bào vi khuẩn [9] 23 n va ac th si 3.6.3 Các phương pháp lựa chọn chủng Bacillus subtilis có hoạt tính probiotic 24 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết xác định khả chống chịu chủng Bacillus subtilis mơi trường pH axít thấp pH kiềm 27 4.2 Kết xác định khả chống chịu muối mật chủng Bacillus subtilis 29 4.3 Kết xác định khả chống chịu axit dày muối mật môi lu trường dịch dày mô chủng Bacillus subtilis 32 an 4.4 Ảnh hưởng NaCl đến phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis 33 va n 4.5 Đánh giá khả ức chế vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Bacillus gh tn to subtilis 34 ie 4.6 Kết xác định tính kháng chủng Bacillus subtilis 36 p 4.7 Kết xác định khả kháng kháng sinh vi khuẩn Bacillus oa nl w subtilis 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 d an lu 5.1 Kết luận 40 u nf va 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 ll oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU lu an n va p ie gh tn to 1.1 Đặt vấn đề Probiotic thức ăn bổ sung vi khuẩn sống có lợi mà ảnh hưởng đến động vật chủ cách cải thiện cân vi khuẩn đường ruột [28] Yêu cầu probiotic vi sinh vật sống, đưa vào đường tiêu hóa chúng phải cịn sống có khả sinh trưởng, phát triển đường tiêu hóa Một loại vi sinh vật có lợi, coi “ứng cử viên” cho việc chế tạo chế phẩm probiotic chúng đáp ứng tiêu chí (i) khả sống sót mơi trường dịch dày; (ii) Có khả chống chịu với muối mật ruột non; (iii) Có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe vật nuôi [40] Các vi khuẩn probiotic chứng minh tạo nhiều lợi ích cho người vật ni tăng cường khả đề kháng với bệnh nhiễm trùng, ngăn ngừa bệnh đường ruột, chống nhiễm trùng đường tiết liệu sinh dục, giảm nguy ung thư ruột tăng khả đề kháng với hóa liệu pháp chống ung thư, ngăn chặn việc sinh trưởng hệ vi sinh vật có hại hay điều chỉnh trạng thái miễn dịch mô niêm mạc khoang miệng Chiếm thành phần đông đảo số probiotics vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium Lactobacillus Ngoài ra, đại diện chi Bacillus hay chủng Escherichia coli sử dụng làm probiotics [30] Các loài Bacillus sử dụng probiotics cách 55 năm chế phẩm Enterogermina® đăng ký từ năm 1958 Italia Trong số vi khuẩn chi Bacillus sử dụng làm probiotics, loài nghiên cứu sâu rộng Bacillus subtilis,Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans Bacillus licheniformis [32] Hiện nay, thị trường nước ta có số sản phẩm probiotic sử dụng chăn nuôi, nhiên giá thành cao Hơn nhà khoa học cho tác dụng probiotic vật ni cịn phụ thuộc vào hệ vi sinh vật vật ni địa Do đó, việc nghiên cứu tạo chế phẩm probiotic từ vi sinh vật địa có tác dụng giảm giá thành sản phẩm, tăng hiệu vật nuôi nước ta d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 31 Nồng độ 0,05% chủng CK, MĐ1, BĐ2 có tỷ lệ tế bào sống tương đối Chủng BC phát triển đạt 5,0x106CFU/ml, chủng MBS2 đạt lượng tế bào tồn phát triển nhiều 4,9x107CFU/ml Ở nồng độ 0,1% chủng MBS2 thu tế bào nhiều đạt 4,0x107CFU/ml, sau chủng BĐ2, MĐ1, CK, MĐ2 BC có số lượng tế bào tồn phát triển 1,5x107CFU/ml, 1,0x107CFU/ml, 8,9x106CFU/ml hai chủng MĐ2 BC đạt 6,9x106 CFU/ml Ở nồng độ 0,15% muối mật, số tế bào tồn phát triển tương đối cao Thấp chủng CK với lượng tế bào sống 1,1x107 CFU/ml, hai lu an chủng MĐ2 BC có số tế bào sống 1,2x107CFU/ml, chủng MĐ1 n va 2,2x107CFU/ml, chủng BĐ2 có số tế bào phát triển 2,2x107CFU/ml Riêng tn to chủng MBS2 có số lượng tế bào tồn nhiều đạt 4,1x107CFU/ml gh Khi lượng muối mật tăng lên, chủng có khả tồn Bổ p ie sung 0,3% muối mật chủng phát triển tốt, thu tế bào nhiều nl w chủng MĐ2 BC đạt 3,3 x107CFU/ml oa Khả chịu muối mật chủng không giống nhau, chủng d có chủng MBS2 đạt lượng tế bào cao Lượng sinh khối khô thu lu va an nồng độ 0,3% 0,1% 3,2 mg/ml u nf Có chênh lệch lượng tế bào sống sinh khối khơ chủng ll khác nên khả chịu đựng nồng độ muối khác m oi Chủng CK có lượng sinh khối khô tăng dần theo nồng độ muối mật, từ 1,2 mg/ml z at nh nồng độ 0,05% lên tới 2,4 mg/ml nồng độ 0,3% Riêng củng BC lại khơng có thay đổi nhiều sinh khối khô nồng độ môi trường khác z gm @ Chủng MBS2 sinh trưởng tốt nồng độ, thu lượng tế bào sinh khối khơ cao, sau chủng BĐ2 l m co Các kết cho thấy: chủng vi khuẩn khảo sát có khả sống sót chịu đựng phù hợp mơi trường đường tiêu hóa với an Lu đặc điểm đặc trưng pH có tính axít có nồng độ muối mật cao Kết n va ac th si 32 tương đương với nghiên cứu Hồ Trung Thông cs chủng Bacillus subtilis thích hợp phát triển nồng độ muối mật 0,3% [13] 4.3 Kết xác định khả chống chịu axit dày muối mật môi trường dịch dày mô chủng Bacillus subtilis Khả chịu muối mật axit dịch dày đặc tính phải có chủng vi khuẩn probiotic Bảng 4.3: Khả chống chịu axit dày muối mật chủng Bacillus subtilis môi trường dịch dày mô Môi trường axit dày Môi trường muối mật Đối chứng (CFU/ml) Môi trường muối mật (CFU/ml) Đối chứng (CFU/ml) MĐ2 9,5x106 1,0 x107 5,4 x106 9,5x106 MBS2 8,1x106 1,1 x107 7,2 x106 9,1x106 CK 7,7x106 1,0 x107 5,0 x106 8,6x106 MĐ1 9,1x106 1,1 x107 5,4 x106 6,8 x106 BĐ2 5,0 x106 8,1 x106 4,5 x106 6,3 x106 BC 7,7 x106 6,8 x106 5,9 x106 6,8x106 n va Môi trường axit dày (CFU/ml) nl an Ký hiệu chủng gh lu STT tn to w p ie d oa ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 4.3: Khả chống chịu axit dày muối mật chủng Bacillus subtilis môi trường dịch dày mô n va ac th si 33 lu an n va p ie gh tn to Khi nuôi cấy chủng Bacillus subtilis 4h liên tục chứa pH axit muối mật, chủng tồn phát triển Khi bổ sung vi khuẩn vào môi trường axit, tỷ lệ số tế bào tồn phát triển cao so với môi trường chứa muối mật Trong mơi trường pH dày, chủng MĐ2 có số tế bào tồn phát triển cao nhất, giảm dần theo chủng MĐ1 (9,1x106CFU/ml), MBS2 (8,1x106 CFU/ml), CK BC số tế bào 7,7x106 CFU/ml cuối BĐ2 (5,0x106CFU/ml) Môi trường chứa muối mật, lượng tế bào tồn cao chủng MBS2 (7,2 x106CFU/ml), thấp chủng BĐ2 (4,5 x106CFU/ml) Số tế bào sống chủng MĐ2 MĐ1 giảm rõ rệt từ 9,5x106CFU/ml 9,1x106CFU/ml xuống 5,4x106CFU/ml, chủng MBS2 từ 8,1x106CFU/ml giảm 7,2x106CFU/ml chuyển từ môi trường axit sang môi trường chứa muối mật Do chủng vi sinh vật bổ sung vào môi trường chứa pH thấp, làm giảm lượng tế bào phát triển, lại phải chống chịu với môi trường chứa muối mật nên số tế bào giảm Tất chủng vi khuẩn probiotic nghiên cứu thể chống chịu cao ngâm dịch mật bão hòa hay dịch mô axit dày Sau xử lý cấy ria, tất các chủng có tốc độ mọc tương đối so với mẫu đối chứng không xử lý Kết phù hợp với kết số nghiên cứu khác phản ánh chủng vi khuẩn probiotic gần không bị ảnh hưởng muối mật pH thấp dịch dày [37] 4.4 Ảnh hưởng NaCl đến phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis Sáu chủng Bacillus subtilis nuôi cấy mơi trường MPA có bổ sung NaCl nồng độ 1%, 3%, 5%, 6%, 7% 0% (đối chứng) Sau – ngày nuôi cấy, kết thu được trình bày bảng 4.4 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Bảng 4.4 Khả chống chịu muối chủng Bacillus subtilis Nồng độ muối 0% + +++ ++ +++ +++ + 5% + ++ ++ + + - 6% m co l gm 7% ++ + ++ - - an Lu ++ ++ +++ ++ ++ ++ 3% @ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 1% z Chủng MĐ2 MBS2 CK MĐ1 BĐ2 BC n va ac th si 34 lu an n va p ie gh tn to Ghi chú: +++: sinh trưởng tốt ++: sinh trưởng trung bình +: sinh trưởng yếu -: khơng sinh trưởng Trong mơi trường có chứa muối, hầu hết chủng có khả sống sót nồng độ 1%, 3%, 5% Tuy nhiên khơng có chủng sống môi trường chứa 7% Ở nồng độ 1%, chúng MĐ2, MBS2, MĐ1, BĐ2 BC phát triển trung bDình Chỉ có chủng CK sinh trưởng tốt Với mơi trường có bổ sung 3% NaCl, chủng sinh trưởng đồng đều, MBS2, MĐ1và BĐ2 sinh trưởng tốt, có CK MĐ2 phát triển trung bình, chủng MĐ2 BC phát triển Đến nồng độ 5%, chủng có biểu phát triển yếu MĐ2, MĐ1, BĐ2, BC chết nồng độ 5% Hai chủng MĐ2, BĐ2 BC chết nồng độ muối 6%, CK phát triển yếu MBS2 MĐ1 phát triển trung bình Kết hoàn toàn tương đương với nghiên cứu Hồ Thị Trường Thy Bacillus subtilis B20 chịu nồng độ muối 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% [14] Từ kết trước, để chọn chủng có hoạt tính probiotic có khả tạo chế phẩm Chúng tơi chọn chủng có tiềm MBS2, MĐ1, CK, BĐ2 để tiến hành thí nghiệm oa nl w d 4.5 Đánh giá khả ức chế vi sinh vật kiểm định vi khuẩn Bacillus subtilis Đường ruột gia súc gia cầm có diện lớn hệ vi sinh vật bao gồm vi sinh vật có lợi (như Lactobacillus, Bifidobacteria) vi sinh vật có hại (E coli, Staphylococcus, ) Nếu chủng chọn lựa không kháng vi sinh vật gây hại bị vi sinh vật tiêu diệt không phát huy vai trị probiotic Nên khả đối kháng với chủng kiểm định điều kiện tiên chủng probiotic Căn tuyển chọn chủng vi khuẩn probiotic khả ức chế vi sinh vật gây bệnh việc tiết chất có khả ức chế vi khuẩn khác chất kháng sinh, bacteriocin, siderophores, lysozyme, protease, hydro peroxit axít hữu ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 35 Hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis xác định phương pháp đục lỗ thạch: cấy trải chủng vi khuẩn kiểm định mơi trường MPA dạng thạch, sau tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ 50µl dịch ni cấy loại bỏ cặn tế bào chủng vi khuẩn Bacillus subtilis (dịch ni cấy trung hịa pH=7 NaOH 0,1N) vào lỗ đục, để 4oC 6h, sau chuyển đĩa thạch sang 37oC 24h [22] Kết trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5: Khả ức chế chủng vi khuẩn kiểm định bốn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis lu Đường kính vịng ức chế (∆D = D – d, mm) an STT Ký hiệu chủng Salmonella typhimurium n va Escherichia coli gh tn to 12,0 13,0 CK 12,5 11,5 MĐ1 9,0 10,0 BĐ2 10,0 11,0 oa nl w p ie MBS2 d (*∆D = D – d : đường kính vịng ức chế) Sau 24h ni cấy 37oC bốn chủng có khả ức chế hai an lu u nf va chủng kiểm định Escherichia coli Salmonella typhimurium Trong ll chủng CK có khả ức chế Escherichia coli mạnh (đường kính vịng m oi vơ khuẩn 12,5 mm Tiếp theo chủng MBS2, BĐ2 z at nh MĐ1với đường kính vịng vô khuẩn 12mm, 10mm, 9mm Đối với khả ức chế Salmonella typhimurium, chủng MBS2 có hoạt z gm @ tính ức chế cao (đường kính vịng phân giải 13mm) Đường kính vịng vơ khuẩn chủng CK, BĐ2, MĐ1 11,5mm, 11mm, 10mm l m co Kết cho thấy khả ức chế đồng thời Escherichia coli Salmonella typhimurium tốt thuộc hai chủng MBS2 CK an Lu n va ac th si 36 lu an Escherichia coli Ghi chú: (1) MBS2 Salmonella typhimurium n va (3) MĐ1 tn to (2) CK (5) Đối chứng (4) BĐ2 ie gh Hình 4.4: Khả ức chế chủng vi khuẩn kiểm định p chủng Bacillus subtilis w 4.6 Kết xác định tính kháng chủng Bacillus subtilis oa nl Để sản xuất chế phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn chăn ni d cho gia súc gia cầm, chế phẩm bổ sung nhiều chủng vi sinh vật lu va an vào mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ chủng có ưu u nf riêng Song chủng phải khơng có đối kháng lẫn ll đối kháng vào đường ruột chúng tự tiêu diệt lẫn không phát oi m huy tác dụng probiotic z at nh Vì vậy, cần phải tiến hành xác định tính đối kháng chủng Bacillus z subtilis theo phương pháp cấy vạch đĩa thạch, sử dụng môi trường MPA đĩa @ gm petri, cấy vạch thẳng chủng chéo nhau, khả đối kháng hay l không chủng biểu vị trí giao đường cấy m co chủng Qua trình nghiên cứu thu kết sau: an Lu n va ac th si 37 Bảng 4.6: Kết xác định tính đối kháng chủng Bacillus subtilis Ký hiệu chủng MBS2 MBS2 MĐ1 CK BĐ2 - - - - - MĐ1 - CK - - BĐ2 - - - (*): - : không đối kháng lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m Hình 4.5: Khả đối kháng chủng Bacillus subtilis Kết bảng 4.6 cho thấy: Sau 24h nuôi tủ ấm 37oC chủng Bacillus subtilis sinh trưởng tốt Ở vị trí giao đường không thấy xuất ức chế phát triển chủng với nhau, biểu chỗ chủng sinh trưởng bình thường vị trí giao thành đường thẳng liền mạch (hình 4.5) Điều chứng tỏ chủng Bacillus subtilis khơng có đối kháng hồn tồn sử dụng kết hợp với trình tạo chế phẩm probiotic z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 38 4.7 Kết xác định khả kháng kháng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis Khả chất kháng kháng sinh chủng vi khuẩn probiotic khác nhau, lồi cần có thêm nghiên cứu để đảm bảo chủng kháng kháng sinh an toàn sử dụng Nếu chủng có khả kháng kháng sinh bổ sung chất kháng sinh vào thể vật nuôi, chủng Bacillus subtilis tồn phát triển Tuy nhiên, chủng vi khuẩn không kháng kháng sinh phải bổ sung vi sinh vật vào thể động vật lu Bảng 4.7: Khả kháng chất kháng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis an va Kháng sinh Ký hiệu chủng Kanamycin Gentamycin MBS2 + + CK - - MĐ1 - - BĐ2 - - n STT nl w p ie gh tn to d oa Ghi chú: -: Không kháng kháng sinh +: Kháng kháng sinh ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 4.6 : Khả kháng kháng sinh chủng MBS2 n va ac th si 39 Trong bốn chủng thử nghiệm có chủng MBS2 có khả kháng loại kháng sinh Ba chủng CK, MĐ1, BĐ2 khơng kháng kháng sinh Cần có thử nghiệm khác để đánh giá khả kháng sinh chủng Bacillus subtilis lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ lu an n va p ie gh tn to 5.1 Kết luận Qua số trình nghiên cứu đặc tính sáu chủng MĐ2, MBS2, CK, MĐ1, BĐ2, BC đưa kết luận sau: - Sáu chủng Bacillus subtilis khảo sát có khả tồn phát triển điều kiện in vitro mơi trường có pH = 2,0 - 8,5 Trong đó, chủng MBS2 chủng có khả chống chịu tốt - Các chủng có khả chịu nồng độ muối mật từ 0,05% 0,3% Trong đó, hai chủng MĐ1 BĐ2 thích nghi cao ổn định môi trường chứa muối mật - Trong môi trường axit dày muối mật mô chủng tồn phát triển - Các chủng Bacillus subtilis có khả tồn môi trường chứa nồng độ muối 1-3% - Bốn chủng Bacillus subtilis lựa chọn ức chế vi khuẩn kiểm định, đó, chủng MBS2 chủng ức chế mạnh với chủng kiểm định - Các chủng Bacillus subtilis khơng có biểu đối kháng sử dụng kết hợp với trình tạo chế phẩm probiotic - Khả kháng kháng sinh chủng yếu, có MBS2 kháng loại kháng sinh kanamycin gentamycin Như vậy, tất chủng lựa chọn có khả sống sót điều kiện bất lợi in vitro Đây sở cho việc chọn lựa chủng chế tạo chế phẩm sau d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z 5.2 Kiến nghị - Khảo sát khả bám dính chủng Bacillus subtilis - Cần nghiên cứu sản xuất tinh để đưa vào sản xuất chế phẩm ứng dụng chăn nuôi, m co l gm @ an Lu n va ac th si 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoài Anh (2008), “Probiotic – lợi ích triển vọng”, Tạp chí chăn ni (08) Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp NguyễnThúy Hương(2000), Vi sinh vật học đại cương, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật lu Bùi Thị Huyền (2010), “Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi” Luận văn thạc sỹ an n va p ie gh tn to Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Thị Thu Hường, Trịnh Thị Thùy Linh, Nhữ Thị Hà, Trịnh Thị Hảo, Nguyễn Thành Linh Đặng Xuân Nghiêm (2014), “Khảo sát thành phần vi sinh đặc tính probiotic sản phẩm men tiêu hóa thị trường”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12 (1): 65-72 d oa nl w Lê Thanh Hồng (2012), “Tinh protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62, ứng dụng thử nghiệm chế phẩm mơ hình in vitro”, Luận văn thạc sỹ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam ll u nf va an lu Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Hoàng Tuấn Duy, Đỗ Phương Quỳnh, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Lê Hồng Phước (2013), “ Khả kiểm soát sinh học Edwardsiella Ictaluri gây bệnh số chủng Bacillus spp phân lập từ ao ni cá tra”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 51 (3A): 1-16 oi m z at nh z Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), “Phân lập Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu mơi trường ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm”, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM @ m co l gm TCN – TQTP 0013:2006, Tiêu chuẩn ngành y tế, Xác định tổng số vi khuẩn lactic thực phẩm an Lu 10 Nguyễn Vĩnh Phước (1976), “Vi sinh vật thú y, tập 1, 2, 3”, Nxb Nông nghiệp Hà Nội n va ac th si 42 11 Lê Đỗ Mai Phương (2004), “Phân lập giám định vi khuẩn Bacillus subtilis tự nhiên, bước đầu khảo sát khả sinh enzyme amylase enzyme protease”, Đại học Mở bán cơng TP.HCM 12 Hồng Tồn Thắng, Cao Văn (2006), “Giáo trình sinh lý học vật ni”, Nxb Nơng nghiệp Hà Nội 13 Hồ Trung Thông, Hồ Lê Quỳnh Châu (2009), “Nghiên cứu khả sống môi trường đường tiêu hóa động vật số chủng vi sinh vật nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế(55) lu an n va gh tn to 14 Hồ Thị Trường Thy, Nguyễn Nữ Trang Thùy, Võ Minh Sơn, “Khảo sát đặc tính chủng Bacillus subtilis B20.1 làm sở cho việc sản xuất probiotic phòng bệnh gan thận mũ Edwardseilla Ictaluti cá tra”, Bộ Môn Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy Sản p ie 15 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ vi sinh môi trường”, Công nghệ sinh học tập 5, Nxb Giáo dục oa nl w II Tiếng Anh d 16 Abdelkarim Mahdhi , Maria Angeles Esteban , Zeineb Hmila , Karima Bekir , Fathi Kamoun , Amina Bakhrouf andBoubaker Krifi (2012),” Survival and retention of the probiotic properties of Bacillus sp strains under marine stress starvation conditions and their potential use as a probiotic in Artemia culture”, Research in Veterinary Science(3), pp 1151-1159 ll u nf va an lu oi m z at nh 17 Anil K Patel, Jayesh J Ahire, Shrikant P Pawar, Bhushan L Chaudhari , Yogesh S Shouche and Sudhir Bhaskarrao Chincholkar (2010), “Evaluation of Probiotic characteristics of siderophoregenic Bacillus spp Isolated from dairy waste”, Appl BiochemBiotechnol,160, pp 140155 z l gm @ m co 18 Arturo A., Mario Rosa M and Maria A.M (2006), “Probiotic for animal nutrition in the European Union”, Regulation and safety assessments,45, pp 91-95 an Lu n va ac th si 43 19 Conway P.L., Gorbach S.L., and Goldin B.R., (1987), “Survival of lactic acid bacteria in the human stomach and adhesion to intestinal cells”, J Dairy Sci., 70, pp 1-12 20 ChunHung Liu , Chiu Hsia Chiu, ShiWei Wang andWinton Cheng (2012), “Dietary administration of the probiotic, Bacillus subtilis E20, enhances the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper, Epinephelus coioides”,Fish & Shellfish Immunology(4,) pp 699-706 lu 21 Corcoran, B M., Stanton, C., Fitzgerald, G F., and Ross, R P (2005), “Survival of probiotic Lactobacillus in acidic environments Is enhanced in the presence of metabolizable sugars”, Appl Environ Microbiol, 71(6), pp 3060-3067 an n va p ie gh tn to 22 De Angelis M, Siragusa S, Berloco M, Caputo L, Settanni L, Alfonsi G, Amerio M, Grandi A and Gobbetti M (2006), “Selection of potential probiotic Lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding”, Research in Microbiology, 157, pp 792-801 d oa nl w 23 Deng Yu Tseng, PeiLin Ho, SungYan Huang, Sheng-Chi Cheng, YaLi Shiu, ChiuShia Chiu and ChunHung Liu (2009), “Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20, Fish & Shellfish Immunology, 26(2), pp 330-344 u nf va an lu ll 24 Dunne, C., O’Mahony, L., Murphy, L., Thornton, G., Morrissey, D., O’Halloran, S., Feeney, M., Flynn, S., Fitzgerald, Daly, C., Kiely, B., O’Sullivan, G.C., Shanahan, F and Collins, J.K (2001), “In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings”, Am J Clin Nutr 73 (2), pp 386-392 oi m z at nh z @ l gm 25 Driks, A (1999), “Bacillus subtilis spore coat”, Microbiology and Molercular biology reviews, 63(1), pp 1-20 m co 26 FAO/WHO(2001), “Health and nutritional properties of probiotic in food including powder milk with live lactic acid bacteria”, Report of a jointFAO/WHO expert consultation on evaluation of health and an Lu n va ac th si 44 nutritionalproperties of probiotic in food including powder milk with live lacticacid bacteria Argentina October 27 FAO/WHO (2002), “Guidelines for the evaluation of probiotic in food”, joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotic in food London, Ontario,Canada, April 30 and May 28 Fuller R (1989), “Probiotic in man and animals”, J Appl Bacteriol, 66, pp 65–78 lu 29 Fuller R (1992), “History and development of probiotic”, In: R Fuller (Ed.) Probiotic: The Scientific Basis, pp 1−8 an n va tn to 30 Gueimonde, M., Sanchez, B., G de Los Reyes - Gavilan, C and Margolles, A (2013), “Antibiotic resistance in probiotic bacteria”, Front Microbiol 18(4), pp 202 p ie gh 31 Gram L., J Melchiorsen, B Spanggaard, I Huber and T.F and Nielsen (1999), “Inhibition of Vibrio anguillarum by Pseudomonas fluorescens AH2, a possiple probiotic treatment of fish”, Applied and Enviromental Microbiology, 65, pp 969-973 oa nl w d 32 Hong H.A., Duc L.H.and Cutting S.M (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiol Rev, 29,pp 813–835 an lu ll u nf va 33 Hoque M.Z , Akter F , Hossain K.M., Rahman M.S.M , Billah M.M.and Islam K.M.D (2010), “Isolation, identification and analysis of probiotic properties of Lactobacillus spp from selective regional yoghurts”, World Journal of Dairy & Food Sciences (1), pp 39-46 oi m z at nh z 34 Huang J.M., La Ragione R.M., Nunez A and Cutting S.M (2008), “Immunostimulatory activity of Bacillus spores”, FEMS Immunol Med Microbio, pp 195-203 @ m co l gm 35 Kumura H., Tanoue Y., Tsukahara M., Tanaka T and Shimazaki K (2004), “Screening of dairy yeast strains for probiotic applications”, J Dairy Sci., 87,pp 4050-4056 an Lu 36 Jans.D (2005), ”Probiotic in Animal Nutrition”, Booklet.www.Fefana.org pp.4-18 n va ac th si 45 37 Jensen, H., Grimmer, S., Naterstad, K and Axelsson, L (2012), “In vitro testing of commercial and potential probiotic lactic acid bacteria”, Int J Food Microbiol 153: 216-222 38 Michail S (2005), “The Mechanism of Action of Probiotic”, Wright State University School of Medicine, The Children’s Medical Center, Dayton, Ohio 39 Oggioni MR, Pozzi G, Valensin PE, Galieni P and Bigazzi C (1998), "Recurrent septicemia in an immunocompromised patient due to probiotic strains ofBacillus subtilis", J Clin Microbiol 36 (1), pp 325–6 lu 40 Ross G.R., Gusils C., and Gonzalez S.N (2008), “Microencapsulation of Probiotic Strains for Swine Feeding”, Biol Pharm Bull 31(11), pp 2121 - 2125 an n va p ie gh tn to 41 SCAN (2000): Report of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the safety of use of Bacillusspecies in animal nutrition European Commission Health & Consumer Protection Directorate-General d oa nl w 42 Thirabunyanon M., Narin Thongwittay (2012), “Protection activity of a novel probiotic strain of Bacillus subtilisagainst Salmonella Enteritidis infection”,Research in Veterinary Science, 93(1), pp 74 - 81 ll u nf va an lu 43 Xiao-Hua Guo, Jong-Man Kim, Hyang-Mi Nam, Shin-Young Park , JaeMyung Kim (2010), “Screening lactic acid bacteria from swine origins for multistrain probiotic based on in vitro functional properties”, Anaerobe 16, pp 321 - 326 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si
Ngày đăng: 03/07/2023, 06:08
Xem thêm:
