(Luận văn) nghiên cứu khả năng nhân giống cây giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum bằng phương pháp in vitro

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - lu an n va PHẠM THỊ HIỆNG (Gynostemma pentaphyllum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO p ie gh tn to NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY GIẢO CỔ LAM oa nl w d KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC nf va an lu lm ul : Chính quy : Cơng nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 : PGS.TS Ngô Xuân Bình ThS Nguyễn Thị Tình z at nh oi Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học Giảng viên hƣớng dẫn z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên – năm 2015 n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm tồn thể thầy giáo khoa tạo điều kiện tốt cho em suốt thời gian thực đề tài Qua thời gian làm việc phịng ni cấy mơ Khoa Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm đến em hoàn thành đề tài Để đạt kết ngày hơm em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: ThS lu Nguyễn Thị Tình, PGS.TS Ngơ Xn Bình tận tình bảo, hướng dẫn em an thời gian thực đề tài va n Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đóng góp hướng gh tn to dẫn quý báu KS Lã Văn Hiền q trình thực hồn thành Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hết lịng động p ie khóa luận nl w viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học d oa tập nghiên cứu an lu Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy bạn để nf va đề tài em hoàn thiện Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 z at nh oi lm ul Em xin chân thành cảm ơn ! Sinh viên thực z l gm @ m co Phạm Thị Hiệng an Lu n va ac th si iii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT lu an n va : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine Cs : Cộng CT : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IBA : β - Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test p ie gh tn to ADN oa nl w : Murashige and Skoog’s d MS lu :  - Naphlene axetic acid nf va an NAA z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 25 Bảng 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS, 1/2MS 26 Bảng 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin đến khả cảm ứng chồi Giảo cổ lam 27 Bảng 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam 28 lu Bảng 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với an hàm lượng NAA đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam Error! va n Bookmark not defined gh tn to Bảng 3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng IBA 30 ie Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 đến khả tạo p vật liệu nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam (sau 10 ngày nuôi cấy) 32 nl w Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng mơi trường MS, ½ MS đến khả d oa tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 34 an lu Bảng 4.3 Kết ảnh hưởng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam (sau nf va 20 ngày nuôi cấy) 35 lm ul Bảng 4.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với BA z at nh oi để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) 37 Bảng 4.5 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với NAA để nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 z Bảng 4.6 Kết ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả rễ 41 m co l gm @ an Lu n va ac th si v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc hóa học Flavononit Saponin Hình 4.1: Chồi Giảo cổ lam tái sinh môi trường MS ½ MS 34 Hình 4.2: Chồi Giảo cổ lam mơi trường MS có bổ sung hàm lượng Kinetin giai đoạn tái sinh 36 Hình 4.3: Chồi Giảo cổ lam mơi trường MS có bổ sung hàm lượng Kinetin BA giai đoạn nhân nhanh 38 lu Hình 4.4: Chồi Giảo cổ lam mơi trường MS có bổ sung hàm an lượng Kinetin NAA giai đoạn nhân nhanh 40 va n Hình 4.5: Rễ Giảo cổ lam mơi trường MS có bổ sung 0,1mg/l IBA 42 p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài .2 1.4 Ý nghĩa đề tài PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu 2.1 Khái quát Giảo cổ lam .3 an 2.1.1 Nguồn gốc phân bố cấy Giảo cổ lam .3 va n 2.1.2 Phân loại .3 tn to 2.1.3 Đặc điểm thực vật học Giảo cổ lam .3 ie gh 2.1.4 Điều kiện sinh thái Giảo cổ lam .4 p 2.1.5 Vị trí Giảo cổ lam hệ thống thực vật học dược liệu nl w 2.1.6 Nghiên cứu giá trị y học Giảo cổ lam d oa 2.2 Khái quát nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 an lu 2.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 nf va 2.2.2 Một số chất điều hịa sinh trưởng ni cấy mô tế bào thực vật 12 lm ul 2.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.3 Các phương pháp nhân giống trồng 15 z at nh oi 2.3.1 Nhân giống hưu tính (bằng hạt) .16 2.3.2 Nhân giống vơ tính 16 z @ 2.3.3 Nhân giống vơ tính in vitro 17 l gm 2.4 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam giới nước 18 2.4.1 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam giới 18 co m 2.4.1 Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam nước 20 an Lu PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 n va ac th si vii 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu .23 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu .23 3.1.3 Hóa chất thiết bị 23 3.2 Điều kiện nuôi cấy 24 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 24 3.4 Nội dung nghiên cứu phương pháp nghiên cứu .24 3.4.1 Nội dung nghiên cứu .24 lu 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 24 an 3.5.1 Thu thập số liệu .30 va n 3.5.2 Các tiêu theo dõi 30 tn to 3.5.3 Phương pháp xử lý số liệu 31 ie gh PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 p 4.1 Kết ảnh hưởng thời gian khử trùng HgCl2 đến khả tạo vật liệu nl w nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam .32 d oa 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS, ½ MS đến khả tái sinh an lu chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 33 nf va 4.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam 35 lm ul 4.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với hàm lượng BA z at nh oi thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam 37 4.5 Kết ảnh hưởng hàm lượng kinetin tốt kết hợp với NAA đến khả nhân nhanh giống Giảo cổ lam .39 z PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 gm @ 5.1 Kết luận .43 l m TÀI LIỆU THAM KHẢO co 5.2 Kiến nghị 43 an Lu n va ac th si viii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nghiên cứu công trình nghiên cứu khác tham khảo trích dẫn tài liệu tham khảo đầy đủ lu Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 an va n XÁC NHẬN CỦA GVHD NGƢỜI VIẾT CAM ĐOAN tn to Đồng ý cho bảo vệ kết ie gh trước hội đồng khoa học! GVHD2 p GVHD1 d oa nl w Sinh Viên nf va an lu lm ul XÁC NHẬN CỦA GV CHẤM PHẢN BIỆN z at nh oi Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên sửa chữa sai sót sau Hội đồng chấm yêu cầu! z (Ký, họ tên) m co l gm @ an Lu n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU Đặt vấn đề 1.1 Giảo cổ lam có tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb) thuộc họ Cucurbitaceae Còn gọi Thất diệp đởm, trà vạn, trường sinh, cỏ thần kỳ Đây dược liệu q ghi sách cổ “Nơng tồn thư hạch chú” Từ xưa sử dụng cho vua chúa để tăng sức khỏe, kéo dài tuổi thọ làm đẹp lu Giảo cổ lam phân bố số quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, an Ấn Độ, Triều Tiên, Việt Nam… Ở nước ta Giảo cổ lam phát va n tỉnh trung du miền núi phía Bắc Lào Cai, Cao Bằng, Bắc Kạn,…và ie gh tn to số địa phương khác (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [14] Theo nghiên cứu GS.TS Phạm Thanh Kỳ cho thấy Giảo cổ lam p chứa 100 loại Saponin có nhiều cấu trúc giống Saponin nl w nhân sâm tam thất Ngoài Giảo cổ lam cịn chứa Flavonoid Đây d oa chất có khả chống lão hóa mạnh, tăng cường sức khỏe, giúp ổn định an lu huyết áp, làm tan huyết khối, ngăn ngừa xơ vữa mạch, phòng chống tai nf va biến tim, mạch, não, chống lão hóa, ngăn ngừa stress, ngừa ung thư não, tử lm ul cung, da, … (Bô ̣ Y Tế, 2009) [6] z at nh oi Với tác dụng nên có sản phẩm thuốc, trà thực phẩm chức sử dụng Giảo cổ lam làm nguyên liệu, nguồn Giảo cổ lam tự nhiên bị khai thác mức bị tuyệt z chủng Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam xếp thang bậc phân @ l gm hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d (Bộ mơn Thực vật, 2004) [5] co Vì việc nghiên cứu nhân giống Giảo cổ lam phục vụ cho công m tác sản xuất cần thiết Việc nhân giống Giảo cổ lam tiến an Lu hành thông qua đoạn thân hay hạt Tuy nhiên để tạo lượng giống lớn, n va ac th si đồng bệnh thời gian ngắn để phục vụ cho sản xuất bảo tồn ni cấy mơ tế bào phương pháp tối ưu Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu khả nhân giống Giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum phương pháp in vitro’’ 1.2 Mục đích nghiên cứu - Tìm quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam phương pháp in vitro 1.3 Yêu cầu đề tài Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến khả tái sinh: lu - Xác định ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% đến an khả tạo vật liệu nấm, vi khuẩn Giảo cổ lam va n - Xác định ảnh hưởng hàm lượng môi trường MS đến khả tái sinh ie gh tn to chồi Giảo cổ lam - Xác định ảnh hưởng hàm lượng số chất kích thích sinh trưởng đến p khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam d oa cổ lam nl w - Xác định ảnh hưởng hàm lượng auxin đến khả rễ Giảo an lu 1.4 Ý nghĩa đề tài nf va - Ý nghĩa khoa học z at nh oi nghiên cứu khoa học lm ul + Giúp sinh viên củng cố hệ thống lại kiến thức học + Biết phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày báo khoa học z @ - Ý nghĩa thực tiễn m co nghiên cứu l gm Xác định yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho an Lu n va ac th si 42 Tuy kết nghiên cứu đạt có khác biệt so với nghiên cứu trước đây, khẳng định giảo cổ lam có khả rễ trình ni cấy in vitro để phục vụ cho nhân giống loài Như với số rễ/cây tốt đạt 4,16 rễ mơi trường MS có bổ sung IBA 0,1mg/l nghiên cứu lựa chọn cho nghiên cứu rễ lu an b c n va a p ie gh tn to nl w e d oa d lu Hình 4.5: Rễ Giảo cổ lam mơi trƣờng MS có bổ sung 0,1mg/l IBA nf va an a, Đối chứng rễ nhỏ, ngắn b, IBA 0,1mg/l rễ khỏe, dài c, IBA 0,2mg/l rễ khỏe, dài d, IBA 0,3mg/l rễ khỏe, dài e, IBA 0,4mg/l rễ nhỏ, ngắn z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Sau nghiên cứu thời gian khử trùng, khả tái sinh, nhân nhanh Giảo cổ lam mơi trường MS, ½MS chất kích thích BA, Kinetin, NAA, IBA đưa kết luận sau: - Khử trùng Giảo cổ lam HgCl2 0,1% phút cho kết cao với tỷ lệ mẫu sống 86,67% - Mơi trường thích hợp cho tái sinh chồi Giảo cổ lam: MS + Inositol lu an 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l, pH: 5,6-5,8, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt 86,67% n va - Mơi trường thích hợp cho cảm ứng chồi Giảo cổ lam: MS + đường 30g/l + chồi đạt 100% - Môi trường nhân nhanh: + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l bổ p ie gh tn to agar 5g/l bổ sung Kinetin với hàm lượng 0,5 mg/l, pH: 5,6-5,8, với tỷ lệ mẫu bật nl w sung Kinetin với hàm lượng 0,5mg/l kết hợp với BA hàm lượng 0,5mg/l, pH: d oa 5,6-5,8 cho hệ số nhân chồi đạt 4,36 lần với chất lượng chồi nhỏ, xanh an lu + Môi trường MS + Inositol 100mg/l + đường 30g/l + agar 5g/l + Kinetin 0,5 mg/l kết hợp với NAA hàm lượng 0,2mg/l, pH: 5,6-5,8 cho hệ số nf va nhân chồi cao 3,33 lần, chất lượng chồi nhỏ, xanh lm ul - Môi trường rễ: MS + đường 30g/l + agar 5g/l bổ sung IBA với 4,16 rễ 5.2 Kiến nghị z at nh oi hàm lượng 0,1 mg/l, pH: 5,6-5,8 khả rễ tốt với số rễ/cây z l gm trùng đến hiệu tạo vật liệu @ - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khác chất khử - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu (khoai tây, cà dốt, m co nước dừa) đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam an Lu n va ac th si TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Xn Bình, Bùi Bảo Hồn, Nguyễn Thị Th Hà (2003), Giáo trình cơng nghệ sinh học, Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội Hà Thanh Bình, Nguyễn Tất Cảnh, Phùng Đăng Chinh, Nguyễn Ích Tân (2002), Trồng trọt đại cương, NXB Nông Nghiệp Bộ Khoa Học Công Nghệ (2007), Sách đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội lu Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược hà Nội (1998), Bài giảng Dược an liệu tập I, 126 – 143, 259 – 289 va n Bộ môn Thực vật (2004), Thực vật Dược phân loại thực vật, Trường to gh tn Đại học Dược Hà Nội p ie Bô ̣ Y Tế , Hội nghị tổng kết 20 năm bảo tồn gen dược liệu Tam Đảo, Bộ Y tế 06/5/2009 nl w Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 308, 309 d oa Võ Văn Chi (2003), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 2, 1322, 1323 an lu Lê Văn Cường (1998), Góp phần nghiên cứu Gynostemma nf va pentaphyllum (Thunb) Makinio Cucurbitaceae,Khóa luận tốt nghiệp lm ul Dược sĩ Đại học – trường Đại học Dược Hà Nội z at nh oi 10 Nguyễn Tiến Dẫn (1999), Ngiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Trường Đại học Dược hà Nội z 11 Trịnh Đình Đạt (2009), Cơng nghệ sinh học (công nghệ di truyền), tập 4, l gm @ Nxb giáo dục m co 12 Dược điển Việt Nam IV, 2009 xuất lần thứ tư Phụ lục 5.4 Hà Nội an Lu n va ac th si 13 Nguyễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng Thất diệp đởm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học - Trường Đại học Dược Hà Nội 14 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, I, 563, 567 15 Nguyễn Thị Hịa, Nguyễn Bá Hoạt (2001), Cơng trình NCKH 1987 2000 Viện dược liệu, NXBKH & KT 16 Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Giảo cổ lam Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ lu Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội an 17 Phạm Thanh Kỳ chủ biên (2006), Thực tập dược liệu hóa học, trung tâm va n thơng tin thư viện trường Đại học Dược Hà Nội in gh tn to 18 Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2007), Nghiên p ie cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch dược liêu Giảo cổ lam (cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makinio,Tạp chí thơng tin Y nl w Dược số 24 d oa 19 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB y học an lu 20 Ngô Quốc Luật, Vũ Thị Tuyết Mai, Nguyễn Thị Bình (2010), Biện pháp nf va nhân giống vơ tính chất lượng hạt giống dền tng Tạp chí lm ul dược liệu, tập 15, số 1/2010, trang z at nh oi 21 Đặng Ngọc Phúc, Nguyễn Thanh Tùng, Dương Thị Thùy Châu, Trương Thị Bích Phượng (2011), “Nhân giống in vitro Sa Nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, z @ 9(4A), 689-698 l gm 22 Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Kim co Thanh (2007), Giáo trình sinh lý thực vật ứng dụng, NXBNN, Hà Nội m 23 Phạm Anh Thắng (2001), Một số biện pháp chống thối mầm giống xuyên an Lu khung bảo quản thời vụ thích hợp để sản xuất dược liệu n va ac th si Tam Đảo, Cơng trình NCKH 1987 – 2000, Viện Dược liệu, NXB KH&KT 24 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 25 Trần Đức Thiện, La Quang Độ Trần Quốc Hưng (2010), “Nghiên cứu đặc điểm sinh thái học số loài Giảo cổ lam (Gynostemma spp) vườn quốc gia Ba Bể, Bắc Kạn”, Tạp chí Nơng nghiệp Phái triển nông thôn(Hà Nội), tháng 11/2010, trang 52 lu 26 Hồng Ngọc Thuận (2000), Nhân giống vơ tính ăn (chiết, ghép, an giâm cành, tách chồi nuôi cấy in vitro, Nxb Nông nghiệp, Huế va n 27 Viện Dược Liệu (1993) Tài nguyên thuốc NXB Khoa Học kỹ thuật to gh tn Hà Nội p ie 28 Viện Dược Liệu (1996), Cây thuốc Việt Nam NXB Khoa Học kỹ thuật Hà Nội nl w 29 Viện Dược Liệu (1998), Điều tra đánh giá dược liệu số vùng trọng d oa điểm tỉnh Lào Cai (Tài liệu nội bộ) an lu 30 Viện Dược liệu (2010), Phương pháp nghiên cứu thuốc từ thảo dược nf va NXB khoa học kỹ thuật hà Nội Tài liệu tiếng anh z at nh oi vật, Nxb Giáo dục lm ul 31 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực 32 Akihisa, Toshihiro, Tamura (1990), “4α- methyl sterol isolated from z Gynostemma pentaphyllum”, phytocchemistry, 29 (5), 1647 - 1651 @ l gm 33 Anchalee Jala and Wassamon Patchpoonporn, (2012) “Effect of BA co NAA and 2,4D on Micropropagation of Tiaogulan (Gynostemma m pentaphy llum Makino), International Transaction Journal of an Lu Engineering, Management n va ac th si 34 Ankang Pharmaceutical Intitution of Beijing Medcal University Promotional meterial, 1999 35 Arichi S, Takemoto T & Uchida Y (1986) Prevention of glucocorticoid side effects by saponin of Gynostemma pentaphyllum, Paten - Japan Kokai Tokyo Koho - 60 105 625 36 Carlson R.F (1964), Dwarf fruit trees, Mich Arg Ext Serv.Bull, pp 432 37 Chen J.C et al (2000), “Therapeutic effect Gypenoside on chronic liver injury and fibrosis by CCl4 in rats”.Am J Chin Med, 28 (2), 175 - 185 lu 38 Cui J., Eneroth., Bruhl J.G (1999), Gynostemma pentaphyllum : an “indentification of major sapogenins and differentation from Panax va n species”, Eur J Pharm Sci, (3), 187 - 191 gh tn to 39 Murashige T and Skoog F (1962), “ A revised medium for rapid growth p ie and bio-assays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant, 15(3), p 473-497 oa nl w 40 Vander Zaag D.E Plantes de pomme de terre Sources d’approvisionnement et traitement Brochure de vulgaristion VIVAA d an lu 41 Zhang ZH, et al.Propagation of Gynostemma pentaphyllum by tissue nf va culture China J Chinese Materia Medica (1989) 14(6) z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số hình ảnh q trình thí nghiệm lu an Đối tượng Vật liệu n va p ie gh tn to d oa nl w Tái sinh môi trường MS an lu Tái sinh môi trường Kinetin (sau 20 ngày nuôi cấy) nf va (sau 20 ngày nuôi cấy) z at nh oi lm ul z co l gm @ Ra rễ (sau 30 ngày) m Nhân nhanh (sau 30 ngày) an Lu n va ac th si Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu Bảng 4.1: Kết ảnh hƣởng thời gian khử trùng HgCl2 0,1 % đến khả tạo vật liệu vô trùng BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMN FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach VARIATE V003 TLMN LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN lu an n va p ie gh tn to ========================================================================= ==== CT$ 20457.8 6819.25 921.08 0.000 * RESIDUAL 59.2286 7.40358 -* TOTAL (CORRECTED) 11 20517.0 1865.18 nl w BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMKN FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE oa anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den d kha nang tao vat lieu sach lu LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO z at nh oi lm ul LN nf va an VARIATE V004 TLMKN z ========================================================================= CT$ 13067.9 4355.96 ****** 0.000 * RESIDUAL 29.6581 3.70726 -* TOTAL (CORRECTED) 11 13097.5 1190.68 l gm @ m co BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLMC FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE an Lu anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den kha nang tao vat lieu sach n va ac th si VARIATE V005 TLMC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 11984.4 3994.80 539.57 0.000 * RESIDUAL 59.2294 7.40367 -* TOTAL (CORRECTED) 11 12043.6 1094.87 lu an TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE va anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den n kha nang tao vat lieu sach to CT$ NOS 3 3 TLMN 100.000 6.67000 71.1100 4.44667 TLMKN 0.000000 86.6700 20.0000 17.7767 TLMC 0.000000 6.67000 8.89000 77.7767 oa nl w p ie gh tn MEANS FOR EFFECT CT$ d SE(N= 3) 1.57094 1.11164 1.57095 5%LSD 8DF 5.12268 3.62496 5.12271 nf va an lu ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HGCL 23/ 5/** 9:23 PAGE lm ul anh huong cua thoi gian khu trung HgCl2 den z at nh oi kha nang tao vat lieu sach F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 43.188 2.7210 6.0 0.0000 34.506 1.9254 6.2 0.0000 33.089 2.7210 11.7 0.0000 z | | | | m co l gm @ TLMN TLMKN TLMC GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 45.557 12 31.112 12 23.334 an Lu n va ac th si Bảng 4.2: Kết ảnh hƣởng môi trƣờng MS, 1/2MS đến khả tái sinh Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha nang tai sinh VARIATE V003 TLTS LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN lu an n va gh tn to ========================================================================= CT$ 416.667 416.667 25.00 0.009 * RESIDUAL 66.6667 16.6667 -* TOTAL (CORRECTED) 483.333 96.6667 p ie TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha w oa nl nang tai sinh d MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TLTS 86.6667 70.0000 nf va an lu z at nh oi lm ul SE(N= 3) 2.35702 5%LSD 4DF 9.23903 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TAI SINH 23/ 5/** 9:34 PAGE anh huong cua moi truong MS, 1/2 MS den kha z nang tai sinh @ STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 9.8319 4.0825 5.2 0.0088 m co TLTS GRAND MEAN (N= 6) NO OBS 78.333 l VARIATE gm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - | | | | an Lu n va ac th si Bảng 4.3: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin đến khả cảm ứng chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLBC FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE anh huong cua nong kinetin den kha nang tai sinh VARIATE V003 TLBC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN lu an n va tn to ========================================================================= CT$ 893.333 223.333 11.17 0.001 * RESIDUAL 10 200.000 20.0000 -* TOTAL (CORRECTED) 14 1093.33 78.0952 p ie gh TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE anh huong cua nong kinetin den kha nang tai w sinh d oa nl MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS TLBC 76.6667 83.3333 3 86.6667 100.000 90.0000 nf va an lu lm ul z at nh oi SE(N= 3) 2.58199 5%LSD 10DF 8.13594 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KINETIN 22/ 5/** 15:40 PAGE z anh huong cua nong kinetin den kha nang tai gm @ sinh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.8372 4.4721 5.1 0.0012 m co an Lu TLBC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 87.333 l VARIATE | | | | n va ac th si Bảng 4.4: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin tốt kết hợp với hàm lƣợng BA thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha VARIATE V003 HSNC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO lu SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 21.2133 5.30333 284.11 0.000 * RESIDUAL 10 186668 186668E-01 -* TOTAL (CORRECTED) 14 21.4000 1.52857 an n va to gh tn TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE ie p anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha d oa nl w MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS HSNC 1.06667 2.20000 3 2.93333 4.36667 3.93333 nf va an lu z at nh oi lm ul SE(N= 3) 0.788813E-01 5%LSD 10DF 0.248558 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KI+BA 22/ 5/** 17:18 PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong BA thich hop den kha z @ STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.2364 0.13663 4.7 0.0000 m co | | | | an Lu HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.9000 l VARIATE gm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - n va ac th si Bảng 4.5: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng Kinetin tốt kết hợp với hàm lƣợng NAA thích hợp đến khả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSNC FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh VARIATE V003 HSNC LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN F RATIO lu an n va tn to SQUARES SQUARES LN ======================================================================== CT$ 9.41067 2.35267 271.46 0.000 * RESIDUAL 10 866664E-01 866664E-02 -* TOTAL (CORRECTED) 14 9.49733 678381 p ie gh TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE nl w anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh d oa MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS HSNC 1.06667 1.86667 3 2.26667 3.33333 2.90000 nf va an lu lm ul z at nh oi SE(N= 3) 0.537483E-01 5%LSD 10DF 0.169363 -ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE KI+NAA 22/ 5/** 17: PAGE z VARIATE STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.82364 0.93095E-01 4.1 0.0000 m co | | | | an Lu HSNC GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.2867 l gm @ anh huong cua nong kinetin tot nhat ket hop voi nong NAA thich hop den kh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - n va ac th si Bảng 4.6: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng IBA đến khả rêc Giảo cổ lam BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re VARIATE V003 SRTB LN PROB SOURCE OF VARIATION ER DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO LN lu an n va p ie gh tn to ========================================================================= CT$ 18.1293 4.53233 283.27 0.000 * RESIDUAL 10 160003 160003E-01 -* TOTAL (CORRECTED) 14 18.2893 1.30638 -TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re d oa nl w MEANS FOR EFFECT CT$ -CT$ NOS SRTB 1.10000 4.16667 3 3.86667 3.70000 3.13333 an lu nf va SE(N= 3) 0.730304E-01 5%LSD 10DF 0.230121 - lm ul z at nh oi ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE RA RE 22/ 5/** 17:37 PAGE anh huong cua nong IBA den kha nang re z F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 1.1430 0.12649 4.0 0.0000 | | | | m co l gm SRTB GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 3.1933 @ VARIATE an Lu n va ac th si Phụ lục 3: Môi trƣờng Table 1: Preparation of modified Murashige AND Skoog’s MS medium Bottle Component NH4NO3 KNO3 MgSO4 7H2O MgSO4 4H2O ZnSO4 7H2O CuSO4 5H2O CaCl2.2H2O KI CoCl2.6H2O I II lu an n va III p ie gh tn to FeSO4 7H2O Na2EDTA 2H2O d lu Vitamin nf va an Nicotinic acid Glycine ThiamineHCl PyridoxineHCl lm ul Sucrose Agar 10 170,0 6,2 0,25 10 27,85 37,25 0,5 2,0 0,1 0,5 0,5 2,0 0,1 0,5 100,0 8.000,0 m co l gm @ 5,8 30.000,0 z PH 10 z at nh oi Inositol 10 mg/100ml 100 100 100 100 Final concentratic (mg/ l) 1.650,0 1.900,0 370,0 22,3 10,6 0,025 440,0 0,83 0,025 20 2,784 3,724 oa nl w V 82,5 95 37,0 2,23 1,058 0,0025 44,0 0,083 0,0025 17,0 0,62 0,025 KH2PO4 H3BO3 Na2MoO4.2H2O IV Amount to take preparation (ml) Stock Solution (g/l) an Lu n va ac th si