Enzym nattokinase nhóm 17 lớp đhdk15b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y-DƯỢC THÁI NGUN BỘ MƠN HĨA DƯỢC KIỂM NGHIỆM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE Nhóm 17 – Lớp : 02 - ĐHDK15B Nguyễn Phương Thúy Hoàng Thị Quỳnh Trang Nguyễn Quỳnh Trang Nguyễn Thị Thu Trang Dương Thị Thủy Tiên 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN NHIỆM VỤ BÀI TẬP: Bài 12.1: Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym nattokinase chế phẩm viên uống chứa nattokinase Tên chế phẩm : NattoEnzym Tài liệu tham khảo : “Tối ưu hóa phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử xác định hoạt độ nattokinase thực phẩm bảo vệ sức khỏe” tập – số Nguyễn Thị Diệu Thư, Hoàng Việt Dũng, Nguyên Thị Hồng Ngọc…Trần Hùng Sơn tạp chí Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm ngày 22/06/2020 “Xác định hoạt độ Enzym” sách giáo trình kiểm nghiệm thực phẩm chức trang 201 – 210 trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên xuất năm 2023 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN NỘI DUNG I ĐẠI CƯƠNG ENZYM II CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ ENZYM III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME IV GIỚI THIỆU ENZYM NATTOKINASE V XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG SẢN PHẨM NATTOENZYM 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN I ĐẠI CƯƠNG ENZYM Khái niệm a.Protein : - Khái niệm : thành phần quan trọng thiếu tất thể sống, tảng cấu trúc chức thể sinh vật Þ Một chức sinh học protein xúc tác phản ứng hóa học xảy tế bào Þ Các protein gọi enzyme b - - Enzyme: Khái niệm : Enzyme chất xúc tác sinh học, giúp phản ứng chuyển hóa sinh hóa xảy dễ dàng thuận lợi, tiêu hao lượng Đa số mang chất protein, số chất acid ribonucleic (Ribozym) 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN I ĐẠI CƯƠNG ENZYM b Enzyme:  Ưu điểm so với chất xúc tác thông thường : + Cường lực xúc tác mạnh gấp nhiều lần xúc tác vô + Xúc tác phản ứng điều kiện nhiệt độ, pH, áp suất bình thường + Tính đặc hiệu chất đặc hiệu phản ứng cao + Khả xúc tác phản ứng ngồi thể khơng thay đổi  Chính nghiên cứu ứng dụng phát triển công nghệ sản xuất enzyme nhiều lĩnh vực: y học, thực phẩm, sinh học, môi trường,…  Nhược điểm: Khơng ổn định, dễ bị biến tính, giảm hoạt độ yếu tố như: nhiệt độ, pH ( acid mạnh, kiềm mạnh), ion kim loại ( Pb, Cu, Hg, Fe…) 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN II CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, TINH CHẾ ENZYM Phương pháp tách enzyme khỏi tế bào - Phương pháp vật lý, học: nghiền ẩm khuấy, sử dụng sóng siêu âm, đồng hóa áp lực cao - Phương pháp hóa học : dùng dung mơi hữu (aceton, butanol, glycerin,ethyl acetat, ), xử lý kiềm, dùng chất tẩy rửa phá vỡ tế bào - Phương pháp biến tính chọn lọc 06/07/2023 Phương pháp tách phần protein – enzyme - Dùng muối (NH4)2SO4 để tách enzym - Dùng dung môi hữu - Dùng nhiệt - Các kỹ thuật sắc ký cột + Phương pháp sắc ký trao đổi ion + Phương pháp dùng chất hấp phụ + Phương pháp sắc ký lực ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN Kết tinh protinenzyme Là phương pháp đặc hiệu tốt để tách phần protein enzym giai đoạn tinh chế cuối III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME Nguyên tắc: a) Phân tích liên tục: phương pháp đo chất bị biến đổi sản phẩm tạo thành cách liên tục theo thời gian b) Phân tích gián đoạn: cho enzim tác động với chất khoảng thời gian xác định dừng lại phản ứng đo lượng chất lại sản phẩm tạo thành Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme : • Phương pháp đo độ nhớt : dùng nhớt kế để đo biến đổi độ nhớt dung dịch phản ứng • Phương pháp phân cực kế : dùng chất sản phẩm có khả làm quay mà phẳng ánh sáng phân cực có góc quay cực riêng khác • Phương pháp đo áp suất hay áp kế : ùng với phản ứng enzym có tiêu hao hay sinh khí • Phương pháp đo quang phổ kế : dùng phổ biến, dựa khả hấp thụ ánh sáng bước sóng xác định chất, sản phẩm phản ứng 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN III CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme : • Phương pháp chuẩn độ : Dùng cho phản ứng enzym có hình thành acid base Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố định, lượng kiềm acid chuẩn dùng để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ enzym • Phương pháp sắc ký : Sử dụng sắc ký để phân tích sản phẩm phản ứng • Phương pháp hóa học : Dùng phản ứng hóa học để định lượng chất hay lượng sản phẩm tạo thành • Phương pháp phóng xạ : Dựa hình thành xạ chất đồng vị phóng tạ gắn vào chất nhóm chức thích hợp để đo độ phóng xạ (sự phân rã) chất lại, hay sản phẩm tạo thành • Phương pháp huỳnh quang : dựa phát quang số hợp chất tác dụng nguồn sáng kích thích đặc trưng phát enzym có hoạt độ thấp 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN IV GIỚI THIỆU ENZYM NATTOKINASE Enzym Nattokinase phát lần đầu vào 1980 Gs.Bs.Hyroyuki Sumi Ông phát dịch chiết từ natto – sản phẩm lên men từ đậu nành có khả làm tan cục máu đông nhanh, mạnh - Nattokinase enzyme có khả tiêu sợi huyết hiệu sản xuất từ Bacilus Subtilis - Nattokinase serine protease có cấu trúc chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân tử 27,728 kDa điểm đẳng điện pI=8,6 - Cơ chất đặc hiệu chung subtilisin: Suc – Ala-Ala-Pro-PhepNA - Nattokinase ổn định khoảng pH từ 6-10 nhiệt độ 3060 0C, hoạt tính nhiệt độ 700C 06/07/2023 Cấu trúc Nattokinase (trái) tìm thấy đậu ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN tương lên men Natto Nhật 10 V XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG SẢN PHẨM NATTOENZYM Sản phẩm: NattoEnzym Chọn đơn vị tính -Hộp -Vỉ -Viên Danh mục Thần kinh não   Dạng bào chế Quy cách Xuất xứ thương hiệu Nhà sản xuất Thành phần Viên nang Hộp Vỉ x 10 Viên Việt Nam DƯỢC HẬU GIANG Nattokinase, Microcrystalline cellulose, Magnesi stearat Mô tả ngắn NattoEnzym hỗ trợ hoạt huyết, tăng tuần hồn máu, giảm nguy hình thành cục máu đông, giảm nguy xây xẩm mặt mày lưu thông máu Hỗ trợ giảm nguy tắc mạch, đột quỵ huyết khối 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 11 V XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG SẢN PHẨM NATTOENZYM Phương pháp chiết tách, tinh kết tinh enzym nattokinase từ NattoEnzym Chiết tách enzym nattokinase: - Loại bỏ nang mềm, thu lấy phần dịch lỏng - Chiết xuất phân đoạn ethanol kết tủa nattokinase: - Thêm hai lần thể tích ethanol 50% vào dịch lỏng, lắc 200 vòng/phút 37oC Sau ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, phần phía thu thập ethanol thêm vào phần phía để đạt nồng độ cuối 75% để kết tủa nattokinase Kết tinh enzym nattokinase - Tiến hành kết tinh enzym nattokinase dung dịch (NH4)2SO4 Q trình kết tinh tiến hành từ từ kéo dài vài ngày chí hàng tuấn muốn nhận tinh thể tinh khiết - Thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch enzym nattokinase đậm đặc làm đục nhẹ dung dịch Sau đặt dung dịch vào nơi, đồng thời tăng từ từ nồng độ muối dung dịch - Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc vào dung dịch enzym nattokinase theo giọt, thêm muối qua màng bán thấm cho bay chậm chạp dung dịch enzym nattokinase.Trong trình kết tinh thay đổi số pH nhiệt06/07/2023 độ ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 12 V XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG SẢN PHẨM NATTOENZYM Xác định hoạt độ enzym - Phương pháp: Quang phổ hấp thụ phân tử a Nguyên tắc phương pháp - Dưới tác dụng thrombin, fibrinogen dạng hịa tan chuyển thành fibrin khơng hịa tan, Nattokinase thúc đẩy q trình giáng hóa fibrin tạo sản phẩm giáng hóa fibrin (FDP) - Phân tích gián đoạn: cho Nattokinase tác dụng với chất sau khoảng thời gian xác định làm ngừng phản ứng enzyme acid tricloacetic 0,2M sau đo lượng chất lại phương pháp đo độ hấp thụ dd bước sóng 275nm b Cách tiến hành - Nattokinase hịa tan pha lỗng với dung dịch pha loãng (2mM Calci sulfat dihydrate (CaSO4.2H2O) + 10mM NaCl 0,005%Triton X-100) Với mẫu trắng mẫu thử, ủ 1,4mL đệm Natri borat 50mM với 0,4mL dung dịch fibrinogen 0,72% phút - Sau đó, thêm 0,1mL thrombin 20U/mL vào hai ống trộn - Sau 10 phút, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu thử ủ với thời gian 60 phút nhiệt độ 40°C Thêm 2,0mL acid tricloacetic 0,2M để dừng phản ứng, thêm 0,1mL dung dịch nattokinase vào mẫu trắng ủ thêm 20 phút Các mẫu li tâm với tốc độ 6000rpm phút độ hấp thụ 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 13 dịch bề mặt đo bước sóng 275nm so với nước cất V XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM NATTOKINASE TRONG SẢN PHẨM NATTOENZYM Hoạt tính tiêu sợi huyết nattokinase tính theo cơng thức sau: Trong đó: AT : độ hấp thụ dung dịch mẫu AB: độ hấp thụ dung dịch trắng T : thời gian phản ứng (phút) V : thể tích dịch chiết nattokinase (mL) m : khối lượng mẫu thử (g) D : hệ số pha loãng - Một đơn vị (1FU) hoạt độ nattokinase định nghĩa lượng enzym làm tăng độ hấp thụ dịch lọc bước sóng 275nm thêm 0,01 phút điều kiện quy định [6] - Đo lượng hoạt động thực ba lần lặp lại Hoạt độ đo lường so sánh với hoạt độ gắn nhãn để ước lượng chất lượng sản phẩm 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 14 BẢNG PHÂN CƠNG NHIỆM VỤ NHĨM: STT Họ tên Nhiệm vụ Nguyễn Phương Thúy Tìm hiểu : Đại cương enzym Các phương pháp chiết tách, tinh chế enzym Hồng Thị Quỳnh Trang Tìm hiểu : Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme Giới thiệu enzym nattokinase Nguyễn Quỳnh Trang Tìm hiểu : Xây dựng quy trình xác định hoạt độ enzym nattokinase sản phẩm nattoenzym Nguyễn Thị Thu Trang Làm powerpoint + Thuyết trình Dương Thị Thủy Tiên Tổng hợp tài liệu + làm powerpoint 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN Tài liệu tham khảo Sách : Kiểm nghiệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Sách : Kiểm nghiệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nguồn : https://vjfc.nifc.gov.vn/article?id= 657 Sách : Kiểm nghiệm thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nguồn : https://vjfc.nifc.gov.vn/article?id= 657 15 NHĨM 17 XIN CẢM ƠN CƠ VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE 06/07/2023 ĐH Y DƯỢC THÁI NGUYÊN 16