(Luận văn) tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn lên men thức ăn thô xanh phục vụ chăn nuôi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o PHẠM HUY THÀNH KHÔI Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH PHỤC VỤ CHĂN NUÔI an lu va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2013-2017 d oa nl w Hệ đào tạo ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ Thái Nguyên, năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM o0o PHẠM HUY THÀNH KHÔI Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN THỨC ĂN THÔ XANH PHỤC VỤ CHĂN NUÔI lu an KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2013-2017 1.TS.Phí Quyết Tiến p ie gh tn to : d oa nl w n va Hệ đào tạo Giảng viên hƣớng dẫn: a lu Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàm Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam a nv 2.ThS Bùi Đình Lãm u nf Khoa CNSH-CNTP, Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên ll oi m tz a nh z om l.c gm @ Thái Nguyên, năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài nghiên cứu luận văn này, nhận giúp đỡ tận tình thầy cán Phịng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến – Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học, Trưởng phịng Cơng nghệ Lên men, Viện Cơng nghệ Sinh học, người tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới NCS ThS Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán phịng Cơng nghệ Lên men, người trực tiếp hướng dẫn thực đề tài nghiên cứu lu an Đồng thời xin cảm ơn KS Nguyễn Văn Thế cán n va Phịng Cơng nghệ Lên men bảo tơi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện Tôi xin gửi lời cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm thầy giáo ie gh tn to thuận lợi cho tơi hồn thành nghiên cứu p Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, thầy cô, d oa nl w cán trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu a lu Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, ll u nf thời gian qua a nv người giúp đỡ, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho suốt oi m Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017 a nh Sinh viên tz z Phạm Huy Thành Khôi om l.c gm @ ii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1: Danh mục xuất xứ hóa chất sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 3.2: Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 4.1: Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng nghiên cứu 24 Bảng 4.2: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng VK 28 Bảng 4.3: Hoạt tính đối kháng chủng VK tuyển chọn 31 Bảng 4.4: Khả đồng hóa số nguồn cacbon chủng TX4 TX9 34 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển hai chủng TX4 TX9 sau 48 nuôi cấy 36 Bảng 4.6:Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng TX4 TX9 38 lu an Bảng 4.7: Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng TX9 41 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 4.1: Khả sinh enzym ngoại bào chủng TX4 TX9 29 Hình 2: Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định chủng TX4, TX9 32 Hình 3: Ảnh đặc điểm hình thái khuẩn lạc đặc điểm hình thái tế bào chủng TX4, TX9 33 Hình 4: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng TX4 35 Hình 5: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng TX9 35 Hình 4.6: Ảnh hưởng nhiệt độ ni cấy đến sinh trưởng phát triển hai chủng TX4 TX9 37 Hình 4.7: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến đến sinh trưởng chủng TX4 TX9 39 lu an Hình 4.8: Điện di đồ DNA tổng số chủng TX9 40 n va Hình 9: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA 40 p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ iv DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Tên đầy đủ EM Effective Microorganisms FLF Fermented Liquid Feed KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Môi trường OD Mật độ quang PT Phát triển ST Sinh trưởng TB Tế bào VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật an lu Ký hiệu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN iv MỤC LỤC v PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài 1.3 Ý nghĩa đề tài 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn lu an PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU n va 2.1 Sử dụng vi sinh vật sản xuất thức ăn thô xanh dạng lỏng tn to 2.2 Đặc điểm sinh học Bacillus ie gh 2.2.1 Đặc điểm hình thái p 2.2.2 Dinh dưỡng tăng trưởng d oa nl w 2.2.3 Một số loài Bacillus phổ biến tự nhiên 2.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng Bacillus sản xuất probiotic làm a lu thức ăn chăn nuôi a nv 2.3.1 Khả sinh bào tử u nf 2.3.2 Khả sinh enzyme phân hủy chất hữu 10 ll 2.3.3 Khả đối kháng 12 m oi 2.3.4 Khả chịu nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm 13 a nh tz 2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic từ chủng Bacillus z chăn ni gia súc gia cầm ngồi nước 13 om l.c gm @ vi 2.4.1 Nghiên cứu nước 14 2.4.2 Nghiên cứu nước 14 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Chủng vi sinh vật 16 3.1.2 Hóa chất sử dụng 16 3.1.3 Thiết bị sử dụng 17 3.1.4 Môi trường nuôi cấy 17 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 18 3.4.1 Phương pháp giữ giống vi khuẩn 18 3.4.2 Nhân giống vi khuẩn 18 lu an 3.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 19 n va 3.4.4 Khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào chủng vsv 19 tn to 3.4.5 Khảo sát hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định phương pháp gh đục lỗ thạch 19 p ie 3.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng VSV 20 d oa nl w 3.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc 20 3.5.2 Quan sát hình thái tế bào 20 a lu 3.5.3 Xác định khả sử dụng nguồn carbon 21 a nv 3.5.4 Xác định khả chịu muối dải nhiệt độ, pH thích hợp cho sinh u nf trưởng vi khuẩn 21 ll 3.6 Phương pháp phân loại chủng vi sinh vật tuyển chọn dựa phân oi m tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA 22 a nh 3.6.1 Tách chiết DNA tổng số 22 tz z 3.6.2 Khuếch đại gen mã hoá16S rRNA chủng vi khuẩn 23 om l.c gm @ vii PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính phù hợp cho lên men thức ăn thô xanh 24 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase, xylanase, β-glucosidase) 27 4.3 Hoạt tính kháng VSV kiểm định 30 4.4 Đặc tính sinh học phân loại chủng tuyển chọn 33 4.4.1 Nghiên cứu đặc điểm tế bào chủng TX4 TX9 33 4.4.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng TX4 TX9 34 4.4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 36 4.4.4 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả phát triển VK TX4 TX9 37 4.4.5 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả phát triển chủng lu an TX4 TX9 38 n va 4.5 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA tn to chủng TX9 39 gh 4.5.1 Tách DNA tổng số khuếch đại 16S chủng TX9 39 p ie 4.5.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA 41 d oa nl w PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 a lu 5.2 Kiến nghị 43 ll u nf a nv TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 oi m tz a nh z om l.c gm @ PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Thức ăn thô xanh ln có tầm quan trọng đặc biệt khơng thể thay chăn nuôi Tùy thuộc chủng loại nguyên liệu, loại thức ăn chứa hầu hết chất dinh dưỡng mà vật nuôi cần protein, vitamin, khoáng đa lượng vi lượng thiết yếu chất có hoạt tính sinh học cao Nguồn thức ăn thô xanh nước ta phong phú, nhiên lại phụ thuộc nhiều vào thời vụ vào mùa đông, thời tiết khô hanh cỏ phát triển khiến nguồn thức ăn thô xanh trở lên khan Trước đây, công nghệ xử lý thức ăn thô xanh nước chủ yếu để chế biến bảo quản thức ăn chăn nuôi cho gia súc nhai lại, đặc biệt trâu, bị nhờ cơng nghệ lên men ủ chua Một số nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học (chế phẩm lu an EM, chế phẩm đa enzyme Viprotics, bổ sung chế phẩm sinh học hỗn hợp va EVP ) dùng cho xử lý nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm công n tn to nghiệp giàu tinh bột ngô, cám, gạo, đậu tương, bã bia, rượu sau chưng gh cất, phế phẩm công nghiệp sản xuất cồn từ sắn sản phẩm phụ công p ie nghiệp sản xuất miến dong, bánh đa Nhóm vi sinh vật chủ yếu sử dụng d oa nl w công nghệ gồm nấm men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp giúp thủy phân tinh bột, tạo sinh khối nấm men nhờ a lu kết hợp với số nguồn nitơ vô cơ, hữu khác Theo nghiên cứu a nv thăm dò từ nhóm nghiên cứu Viện Cơng nghệ sinh học, sử dụng chế ll m cho chăn nuôi lợn u nf phẩm sinh học phù hợp để lên men thức ăn thô xanh tạo nguồn thức ăn lỏng oi Trong chăn nuôi lợn, thức ăn chiếm tới 70% chi phí yếu tố a nh định chất lượng, giá thành sản phẩm Tại Việt Nam, thức ăn chăn nuôi tz z nước ta chủ yếu nhập từ nước (chiếm 71,21%, số liệu Tổng cục om l.c gm @ 37 TX9 TX4 Hình 4.6:Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh trƣởng phát triển hai chủng TX4 TX9 Từ bảng 4.5 hình 4.6 nhận thấy thấy, nhiệt độ ni cấy tăng khả sinh trưởng chủng tăng theo Tại khoảng nhiệt độ 20ºC ta thấy hai chủng không sinh trưởng.Nhưng từ 30ºC chủng sinh trưởng phát triển mạnh, đặc biệt cao nhiệt độ 37ºC.Khi nhiệt độ tăng tới 45ºCthì chủng bắt đầu sinh trưởng yếu dần sống sót an lu Như vậy, chủng VSV tuyển chọn có khả sinh trưởng khoảng Vì vậy, chúng tơi chọn nhiệt độ ni cấy thích hợp cho chủng VSV n va nhiệt độ 30-45ºC sinh trưởng mạnh nhiệt độ 37ºC gh tn to tuyển chọn 37ºC, khoảng nhiệt độ gần với nhiệt độ thể lợn sau p ie cai sữa (38,5ºC) Đặc điểm có lợi cho việc sử dụng chủng nghiên cứu vào d oa nl w sản xuất chế phẩm VSV lên men thức ăn thô xanh 4.4.4 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả phát triển VK TX4 TX9 Các nghiên cứu trước pH mơi trường có ý nghĩa a nv a lu định tới trình trao đổi chất vi sinh vật Do thay đổi nồng độ ion H+ OH- làm ảnh hưởng đến liên kết hidro cấu trúc u nf ll khơng gian protein, acid nucleic… có tế bào [12] Mỗi loại vi oi m khuẩn hoạt động khoảng pH định, khoảng pH a nh phù hợp với hoạt động nhiều loại enzyme thực chức sinh tz học tế bào Việc xác định khoảng pH thích hợp cần thiết, phục vụ z om l.c gm @ 38 cho nghiên cứu sau Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH đến khả phát triển vi khuẩn thể bảng 4.6 Bảng 4.6:Ảnh hƣởng pH ban đầu đến sinh trƣởng chủng TX4 TX9 Khả phát triển (OD600nm) Chủng vi khuẩn pH3 pH pH pH pH pH pH pH 10 TX4 0,03 0,06 0,9 1,36 1,16 1,14 1,12 0,46 TX9 0,07 0,09 0,76 1,43 0,94 0,54 0,33 0,22 Kết thể bảng 4.6 cho thấy, chủng TX4 phát triển dải pH từ 5,0-9,0 tối ưu pH với giá trị OD600nm đạt 1,36 đơn vị Chủng TX9 phát triển tốt dải pH từ 5,0 - 8,0 tối ưu pH 6,0 với giá trị OD600nm đạt 1,43 đơn vị Ở pH < 5,0 >9,0 hai chủng gần không phát triển, an lu chủng vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn trung tính Như vậy, pH ban đầu tối ưu cho sinh trưởng phát triển chủng TX4 TX9 6,0 va n 4.4.5 Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả phát triển chủng TX4 TX9 to tn Khả chịu muối cho phép vi sinh vật thích nghi với mơi trường ie gh sống có nồng độ muối cao, đặc điểm sinh lý-hóa sinh p quan trọng vi sinh vật Ảnh hưởng nồng độ muối đến sinh trưởng d oa nl w phát triển hai chủng TX4 TX9 thể hình 4.7 ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 39 Mật độ tế bào ( OD 600nm) 1.8 1.671 TX4 1.6 1.4 TX9 1.205 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 nồng độ muối (NaCl) mơi trƣờng Hình 4.7: Ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl đến đến sinh trƣởng chủng TX4 TX9 an lu Kết hình 4.7 cho thấy, hai chủng vi khuẩn TX4, TX9 phát triển va tốt mơi trường có nồng độ muối từ - 4% Hai chủng TX4, TX9 n phát triển tốt nồng độ muối từ - 7% nồng độ muối 2% cho giá trị OD gh tn to cao đạt OD600nm đạt 1,205 1, 671 đơn vị, tương ứng Khi nồng độ p ie NaCl > 7%, chủng TX4 TX9 không cho thấy phát triển Điều hiểu, nồng độ muối môi trường cao xảy tượng thẩm d oa nl w thấu ngược tế bào (làm co nguyên sinh chất) dẫn tới ức chế khả trao đổi chất sinh trưởng chủng vi khuẩn Như vậy, nồng độ muối tối a nv a lu ưu cho sinh trưởng phát triển chủng TX4 TX9 2% 4.5 Phân loại dựa xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA ll u nf chủng TX9 oi m 4.5.1 Tách DNA tổng số khuếch đại 16S chủng TX9 a nh Để phân loại chủng TX9 chúng tơi tiến hành tách DNA tổng số sau tz chạy điện di gel agarose 1% để kiểm tra z om l.c gm @ 40 DNA tổng số Hình 4.8: Điện di đồ DNA tổng số chủng TX9 an lu n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu Hình 9: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gene mã hóa 16S rRNA u nf ll Băng M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ); Băng 1: Sản m oi phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA chủng TX9 a nh Kết điện di cho thấy DNA tổng số chủng TX9 có độ tinh tz cao, hàm lượng đủ lớn, băng gọn, không bị đứt gãy đủ chất lượng cho z om l.c gm @ 41 nghiên cứu tiếp theo.Kết phản ứng nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA từ DNA tổng số chủng TX9 cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp hồn tồn phù hợp với tính tốn lý thuyết Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn tinh gửi đọc trình tự máy xác định trình tự tự động ABIPRISM 3100, phịng Thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ gen – Viện Công nghệ sinh học - viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 4.5.2 Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA Tại Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học công nghệ Việt Nam chủng TX9 định danh cách giải trình tự gen 16S rDNA, phân tích, so sánh trình tự tương với ngân hàng gen Kết quả, trình tự gen 16S rRNA thể bảng 4.7 sau: Bảng 4.7: Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA chủng TX9 Mã số truy cập Độ tƣơng khuẩn đƣợc so sánh GenBank đồng (%) Bacillus amyloliquefaciens I/2/5 KM036068.1 99% Bacillus amyloliquefaciens AMB_16 JX971532.1 99% Bacillus amyloliquefaciens Bac7M3 FJ889051.1 99% Bacillus amyloliquefaciens P3 KY697808.1 99% KY515456.1 99% an lu Trình tự gene 16S rDNA chủng xạ n va p ie gh tn to d oa nl w Bacillus amyloliquefaciens A1142 Khi so sánh trình tự gen nhận nghiên cứu với trình tự tương ứng ngân hàng liệu sở Genbank cho thấy: gen mã hóa 16S a lu a nv rRNA chủng TX9 có độ tương đồng 99% so với gen tương ứng loài u nf vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens ll Kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa phân loại dựa mức độ m oi tương đồng trình tự nucleotide gen mã hóa 16S rRNA chủng TX9 với a nh chủng so sánh, kết luận chủng vi khuẩn thuộc loài Bacillus tz amyloliquefaciens đặt tên Bacillus amyloliquefaciens TX9 z om l.c gm @ 42 Được biết B amyloliquefaciens phổ biến đất Đây chủng VK an toàn cho người động vật, ứng dụng nhiều công nghiệp sản xuất enzyme có khả sinh loại enzyme amylase, protease, protease [21],lipase [39], phytase, xenlulase xylanase [38] Ngồi ra, B amyloliquefaciens cịn ứng dụng lĩnh vực khác nông nghiệp, y học khả sinh chất chuyển hóa vitamin, nucleoside purine (inosine, guanosine) [26;34], chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA [21;33;34;42] Chúng biết đến kĩ thuật di truyền nhờ khả sinh tổng hợp enzyme cắt hạn chế Bam HI [33;37;40;50] Từ cho thấy chủng nghiên cứu tuyển chọn dùng để tạo chế phẩm hồn tồn có sở an lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 24 chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics, thuộc chi Bacillus, tuyển chọn chủng TX4, TX9 có khả thủy phân cellulose kháng vi khuẩn gây bệnh đường ruột Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn TX4 TX9 cho thấy hai chủng TX4 TX9 vi khuẩn Gram (+), có khả dị dưỡng hiếu khí, thuộc vi khuẩn ưa ấm, có khả đồng hóa nhiều loại đường glucose, fructose, maltose, galactose… Kết hợp phân loại dựa đặc điểm sinh hóa phương pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn TX9 định danh Bacillus amyloliquefaciens TX9 lu an 5.2 Kiến nghị n va 1.Tiếp tục nghiên cứu thêm đặc tính chủng Bacillus tn to amyloliquefaciens TX9 khả chịu pH, dịch muối mật gh 2.Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men thích hợp thu sinh khối p ie tạo chế phẩm vi sinh ứng dụng cho lên men thức ăn thô xanh d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO I, Tiếng Việt Đặng Ngọc Phương Uyên (2007), Phân lập VK Bacillus subtilis từ đất khảo sát tính đối kháng với VK E coli gây bệnh tiêu chảy heo, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Nông lâm Tp HCM Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trường nước ni thủy sản, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm Hà Nội, tr 15-27, 32-35, 47-53 Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa lợn, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả na ̆ng sinh tổ ng hơ ̣p protease của một số chủng Bacillus, Luận văn Tha ̣c si ̃ Sinh ho ̣c , Trường ĐH Sư phạm Tp HCM, tr 27-36 lu an Egorov N X (1976), Thực tập vi sinh vật học, NXB Mir, Maxcova đại n va học THCN, Hà Nội (người dịch Nguyễn Lân Dũng) môi trường đường tiêu hóa động vật số chủng VSV ie gh tn to Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu (2009), Nghiên cứu khả sống p nhằm bước chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics, Tạp chí d oa nl w khoa học, 09 (55), Trường Đại học Nông lâm, Đại học Huế, tr 82-84 Lã Văn Kính (1998), Những tiến khoa học kỹ thuật công nghệ a lu sản xuất thức ăn gia súc vai trò probiotic sức khỏe động trường Tp HCM u nf a nv vật, Báo cáo khoa học, Trung tâm Thông tin KH & CN, Sở KHCN Môi ll Lương Đức Phẩ m (2007), Các chế phẩm sinh học dùng cha ̆n nuôi oi m a nh nuôi trồ ng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 112-152 tz Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà (2007) Nghiên cứu hoạt tính enzyme z ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả ứng dụng om l.c gm @ 45 chúng xử lý nước thải.Tạp chíkhoa học ĐHQGHN, Khoa tự nhiên công nghệ 25(2009) 101-106 10 Nguyễn Đức Quỳnh Nhu (2008), Phân lập sàng lo ̣c m ột số chủng Bacillus có hoa ̣t tính probiotic ni trờ ng t hủy sản, Luận văn Tha ̣c sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, tr 8-11, 17-19 11 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học-Kỹ thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội 13 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2009), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục 14 Phạm Quốc Việt (2006-2009) Nghiên cứu sản xuất probiotic emzym lu an tiêu hoá dùng chăn ni Đề tài thuộc chương trình trọng điểm phát n va triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực nông nghiệp phát tn to triển nông thôn đến năm 2020, Viện Chăn nuôi ie gh 15 Phạm Thị Trân Châu (2007), Công nghệ sinh học (tập 3), NXB Giáo du ̣c (2011), Nghiên cứu đ ặc điể m vai trò của p 16 Trầ n Thi ̣Ái Liên d oa nl w Lactobacillus acidophilus chế phẩ m probiotic , Luận văn Tha ̣c si ̃ Sinh ho ̣c, Trường ĐH Sư phạm Tp HCM, tr 7-9, 39-40 a lu 17 Trần Thị Thu Thủy (2003), Khảo sát tác dụng thay KS probiotic a nv phòng ngừa tiêu chảy E coli heo con, Luận văn Thạc sĩ Khoa u nf học Nông nghiệp, Trường ĐH Nông lâm Tp HCM, tr 21-24, 28-43 ll 18 Trầ n Trường Nhân (2009), Phân lập VK Bacillus subtilis từ phân heo đố i oi m a nh kháng với E coli ứng du ̣ng sản xuấ t probiotic , Luận văn tố t tz nghiệp ngành Kỹ sư Chăn nuôi-Thú Y, Trường ĐH Nông lâm Tp HCM z om l.c gm @ 46 19 Văn Thi Thu ̣ ̉ y (2011), Phân lập chủng Bacillus spp có hoa ̣t tính probiotic từ ao ni cá tra , Luận án Tha ̣c si ̃ Sinh ho ̣c , Trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, tr 36, 52-54 II, Tiếng Anh 20 Aarnink AJ and Verstegen MWA (2007), Nutrition, key factor to reduce environmental load from pig production, Livest Sci., 109: 194-203 21 Araujo LF, Silvà FLH, Brito EA, Olivera JS and Santos ES (2008), Enriquecimento protộico da palma forrageira com Saccharomyces cerevisiae para alimentaỗóo de ruminantes Arquivo Brasileiro de MedicinaVeterinária e Zootecnia, 60: 401-407 22 Aronson AI and Fitz J (1976), Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat, Bacterial Rev 40: 360-402 23 Brooks PH (2008), Fermented liquid feed for pigs CAB Reviews: an lu Perspectives in Agriculture Veterinary Science, Nutrition and Natural va Resources, 3: 073, 18 n 24 Brooks PH Beal JD, Demeckove V and.Niven SJ (2003),Fermented gh tn to Liquid Feed (FLF) can reduce the transfer and incidence of Salmonella in p ie pigs Proc of 5th International Symposium on the Epidemiology and Control of Foodborn Pathogens in Pork Hotel Creta Maris Heraklion- d oa nl w Crete, 21-26 25 Canibe N, Jensen BB (2012), Fermented liquid feed – microbial and a nv a lu nutritional aspects and impact on enteric diseases in pigs Anim Feed Sci Technol 173: 17–40, u nf 26 Choct M, Selby EAD, Cadogan DJ, Campbell RG (2004), Effect of liquid ll oi m feed ratio, steeping time, and enzyme supplementation on the P, Hatzinikolaou DG, tz 27 Christakopoulos a nh performance of weaner pigs Aust J Agr Res., 55: 247–52 Fountoukidis G, Kekos z D,Claeyssens M, Macris BJ (1999), Purification and mode of action of an om l.c gm @ 47 alkali-resistant endo-1,4-β-glucanase from Bacillus pumilus Arch Biochem Biophys 361:61–66 28 Dhillon A, Gupta JK, Jauhari BM, Khanna SA (2000), Cellulase-poor, thermostable, alkalitolerant xylanase produced by Bacillus circulans AB 16 grown on rice straw and its application in biobleaching of eucalyptus pulp Bioresour Technol 73:273–277 doi: 10.1016/S0960- 8524(99)00116-9 29 Eui-Sun Son and Jong-Il Kim (2002), Purification and Characterization of Caseinolytic Extracellular protease from Bacillus amyloliquefaciens S94, The Journal of Microbiology, 40 (1): 26-32 30 Gillis M, Vandamme P, De Vos P, Swings J, Kersters K (2001), Bergey’s manual of systematic bacteriology, Springerd Press 31 Gomez-Gil B, Roque A, Turnbull JF (2000), The use and selection of an lu probiotic bacteria for use in the culture of larval aquatic organisms va Aquaculture 191: 259–270 n 32 Gupta R, Gigras P, Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B (2003), gh tn to Microbial α-amylases: a biotechnological prospective Process Biochem p ie 38:1599–1616 doi: 10.1016/S0032-9592(03)00053-0 33 Hans HS (2002), Experience of feeding pigs without antibiotics: a d oa nl w european perspective, Animal Biotechnology, 13(1): 85–95 34 Hans HS and Dong YK (2006), Reduced use of antibiotic growth a lu promoters in diets fed to weanling pigs: Dietary tools, part 2, Animal u nf a nv Biotechnology, 17: 217–231 35 Haq I, Ashraf H, Iqbal J (2003), Production of alpha-amylase by Bacillus ll oi m licheniformis using an economical medium, Bioresource Technology a nh 36 Hyronimus B, Le Marrec C, Sassi AH & Deschamps A(2000), Acid and tz bile tolerance of spore-forming lactic acid bacteria International Journal z of Food Microbiol, 61(2): 193–197 om l.c gm @ 48 37 Niba AT, Beal JD, Kudi AC, Brooks PH (2009),Potential of bacterial fermentation as a biosafe method of improving feeds for pigs and poultry Afr J Biotechnol.,8: 1758–67 38 Park SH, Kim HK and Pack MY (1991).Agric Biol Chem.55: 441–448 39 Pedersen AØ, Maribo H, Jensen BB, Hansen ID, Aaslyng MD (2002c), Fermented grain in liquid 824 feed for heavy pigs Report No 547 Danish Bacon and Meat Council, Denmark 40 Pérez-Avalos O, Sánchez-Herrera LM, Salgado LM and Ponce-Noyola T (2008), A bifunctionalendoglucanase/endoxylanase from Cellulomonas flavigena with potential use in industrialprocesses at different pH Current Microbiology, 57: 39-44 41 Priest FG, Goodfellow M, Shute LA and Berkeley RCW (1987), Bacillus amyloliquefaciens sp nov nom rev, Int, j Syst Bacteriol, 37: 69-71 lu an 42 Radecki SV, Juhl MR, Miller ER (1988), Fumaric and citric axits as fed va additives in starter pig diets: effect on performance and nutrition balance n tn to J Anim Sci., 66: 2598–605 gh 43 Todar K Ph D (2008), Bacillus and related endospore-forming bacteria, p ie ’ Todar s online textbook of bacteriology d oa nl w 44 Van Winsen RL, Lipman LJA, Biesterveld S, Urlings BAP, Snijders JMA, Van Knapen F (2000), Mechanism of Salmonella reduction in ll u nf a nv a lu fermented pig feed J Sci Food Agr 81: 342–6 oi m tz a nh z om l.c gm @ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường MPA: (g/l) Cao thịt Pepton NaCl Thạch 20 Nước cất 1000 ml pH 7,0-7,2 Môi trường MK thử nguồn đường Pepton 0,5% K2PO4 0,1% Bromocresol ml dung dịch 1,6% cồn Thạch 20 Các nguồn đường glucose, maltose, L- Arabinose, galactose, lactose, an lu saccarose, manose, cellobiose, myo - Inositol n va  Chú ý: Các nguồn đường bổ sung cho môi trường khử trùng lặp lại sau 24 48 với nhiệt độ thời gian lần p ie gh tn to theo phương pháp Paster, tức khử trùng 65oC 15 phút khử trùng d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ Phụ lục 2: Trình tự gen 16S rDNA chủng vi khuẩn TX9 60 ATGTTAGCGG CGGACGGGTG AGTAACACGT GGGTAACCTG CCGGATGGTT GTTTGAACCG AGATGGACCC GCGGCGCATT GTAGCCGACC TGAGAGGGTG GGGAGGCAGC AGTAGGGAAT GAGTGATGAA GGTTTTCGGA AATAGGGCGG CACCTTGACG CCGCGGTAAT ACGTAGGTGG GCGGTTTCTT AAGTCTGATG GGGGAACTTG AGTGCAGAAG GATGTGGAGG AACACCAGTG GAAAGCGTGG GGAGCGAACA GCTAAGTGTT AGGGGGTTTC TGGGGAGTAC GGTCGCAAGA CCTGTAAGAC TGGGATAACT 120 CCGGGAAACC GGGGCTAATA CATGGTTCAA ACATAAAAGG 180 TGGCTTCGGC TACCACTTAC AGCTAGTTGG TGAGGTAACG 240 GCTCACCAAG GCGACGATGC ATCGGCCACA CTGGGACTGA 300 GACACGGCCC AGACTCCTAC CTTCCGCAAT GGACGAAAGT 360 CTGACGGAGC AACGCCGCGT TCGTAAAGCT CTGTTGTTAG 420 GGAAGAACAA GTACCGTTCA lu an GTACCTAACC AGAAAGCCAC va 480 GGCTAACTAC GTGCCAGCAG n tn to CAAGCGTTGT CCGGAATTAT TGGGCGTAAA gh 540 GGGCTCGCAG p ie TGAAAGCCCC CGGCTCAACC GGGGAGGGTC d oa nl w 600 ATTGGAAACT AGGAGAGTGG AATTCCACGT 660 GTAGCGGTGA AATGCGTAGA 720 a nv a lu GCGAAGGCGA CTCTCTGGTC TGTAACTGAC GCTGAGGAGC u nf GGATTAGATA CCCTGGTAGT AACGATGAGT AACGCATTAA GCACTCCGCC z CTGAAACTCA AAGGAATTGA tz 840 a nh CGCCCCTTAG TGCTGCAGCT oi m CCACGCCGTA ll 780 om l.c gm @ 900 CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTCG AAGCAACGCG AAGAACCTTA 960 CCAGGTCTTG ACATCCTCTG ACAATCCTAG AGATAGGACG TCCCCTTCGG GGGCAGAGTG 1020 ACAGGTGGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TTAGTTTGCC AGCAATTCAG TGGTGGGGTT AAGTCCCGCA 1080 ACGACCGCAA CCCTTTGATC TTGGGGCACT CTAAGGGGGA 1091 CTGGCCGGTG A an lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @