Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Thái Hạnh Dung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN MỚI PHỤC VỤ CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI THUỘC CHI Aspergillus LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Thái Hạnh Dung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN MỚI PHỤC VỤ CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI THUỘC CHI Aspergillus Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN TUẤN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí Khoa học, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Thái Hạnh Dung LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy dành nhiều thời gian, tâm huyết, trí tuệ để bảo, định hướng, cho hội thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Giám đốc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy quan tâm, động viên hết lịng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, giảng dạy, hỗ trợ sẵn sàng tạo điều kiện để học tập rèn luyện Tôi xin cảm ơn Đề tài Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia NAFOSTED (mã số: 106.04-2018.36), Tập đồn Vingroup – Cơng ty Cổ phần Chương trình học bổng thạc sĩ, tiến sĩ nước Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn, mã số VINIF.2021.TS.076 hỗ trợ kinh phí để tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Khoa Sinh học Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối tơi xin gửi lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân tập thể nhóm nghiên cứu Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein sát cánh, ủng hộ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Thái Hạnh Dung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .4 DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 10 Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 14 1.1 Giới thiệu chi Aspergillus 14 1.1.1 Đặc điểm phân loại 14 1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 15 1.1.3 Di truyền học hệ gen nấm 16 1.1.4 Vai trị ứng dụng cơng nghệ sinh học cơng nghiệp 16 1.2 Nấm sợi A oryzae 18 1.2.1 Đặc điểm hình thái 18 1.2.2 Hệ gen A oryzae 19 1.2.3 Sinh thái học ý nghĩa kinh tế 20 1.3 Nấm sợi A niger .21 1.3.1 Đặc điểm hình thái 21 1.3.2 Hệ gen A niger 22 1.3.3 Sinh thái học ý nghĩa kinh tế 23 1.4 Một số phương pháp chuyển gen phục vụ cải biến di truyền nấm sợi 24 1.4.1 Chuyển gen xung điện 24 1.4.2 Chuyển gen sóng xung kích 25 1.4.3 Chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT) 26 1.4.4 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT) .27 1.5 Marker chọn lọc dùng chuyển gen 31 1.5.1 Marker chọn lọc gen kháng thuốc 31 1.5.2 Marker chọn lọc gen dinh dưỡng 32 1.6 Một số protein điều hoà quan trọng nấm sợi Aspergillus 34 1.6.1 AmyR 35 1.6.2 LaeA 35 1.6.3 PrtR/PrtT 37 1.6.4 StuA 37 1.6.5 VeA 38 1.7 Các chiến lược tăng cường sản xuất enzyme/protein A oryzae A niger .39 1.7.1 Tối ưu hóa cấu trúc biểu gen 39 1.7.2 Giảm phân hủy protein ngoại bào 41 1.7.3 Cải biến hình thái học hệ sợi nấm 41 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .43 2.1 Các chủng vi sinh vật vector sử dụng nghiên cứu 43 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 43 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 44 2.2 Môi trường nuôi cấy .45 2.3 Các cặp mồi dùng phản ứng PCR 46 2.4 Thiết bị, hóa chất 46 2.5 Phương pháp nghiên cứu 47 2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 47 2.5.2 Thu bào tử hệ sợi nấm 47 2.5.3 Tách chiết DNA tổng số, tách chiết RNA tổng số tạo cDNA 48 2.5.4 Tạo vector dùng cho xoá gen biểu gen A oryzae A niger 49 2.5.5 Chuyển gen vào A oryzae A niger nhờ vi khuẩn Ag tumefaciens sử dụng marker chọn lọc gen dinh dưỡng 54 2.5.6 Sàng lọc, đánh giá kiểm tra khả sinh trưởng tiết protein/enzyme chủng chuyển gen 56 2.5.7 Xác định số mức độ hoạt động gen phyA thông qua realtime PCR 58 2.5.8 Xác định phân tích gen A oryzae A niger 58 2.5.9 Phân tích xử lý số liệu 58 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1 Phát triển hệ thống chuyển gen với marker chọn lọc gen dinh dưỡng hisB phục vụ cải biến di truyền nấm sợi A oryzae A niger .59 3.1.1 Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng histidine nhờ xóa gen hisB theo chế trao đổi chéo tương đồng 59 3.1.2 Chuyển gen vào A oryzae A niger sử dụng phương pháp ATMT với marker chọn lọc hisB 69 3.1.3 Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng kép nhờ giải pháp tái sử dụng marker chọn lọc pyrG 78 3.1.4 Xây dựng đánh giá hiệu chuyển gen vector nhị thể 80 3.2 Hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Ag tumefaciens (ATMT) phát triển cho phép thực nghiên cứu chức gen 83 3.2.1 Tạo vector nhị thể pKH1 phục vụ xóa gen 83 3.2.2 Xoá bổ trợ thành cơng gen điều hịa laeA A oryzae A niger cách sử dụng hệ thống ATMT xây dựng .84 3.3 Đánh giá hiệu xoá gen sử dụng hệ thống ATMT xác định vai trò số gen cụ thể 92 3.3.1 Sử dụng marker hisB phục vụ xóa gen stuA A oryzae A niger 92 3.3.2 So sánh hiệu xóa số gen điều hòa A oryzae A niger 99 3.3.3 Hệ thống chuyển gen marker hisB pyrG cho phép dễ dàng tạo chủng đột biến xóa kép .102 3.4 Thiết lập chiến lược để tăng hiệu xoá gen A oryzae A niger 111 3.4.1 Chiến lược tăng tỷ lệ xoá gen nấm sợi A oryzae 113 3.4.2 Chiến lược tăng tỷ lệ xoá gen nấm sợi A niger 116 3.5 Khai thác hệ thống chuyển gen phát triển để biểu enzyme tái tổ hợp .122 3.5.1 Tạo vector nhị thể mang cấu trúc biểu gen phyA chuyển thành công vào nấm sợi A oryzae A niger 122 3.5.2 Xác định số gen phyA chủng chuyển gen xác định hoạt tính enzyme phytase chủng chuyển gen 128 3.5.3 Áp dụng hệ thống chuyển gen để tuyển chọn chủng nấm sợi A niger đột biến phục vụ biểu enzyme tái tổ hợp hiệu suất cao 131 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 142 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .144 TÀI LIỆU THAM KHẢO 145 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ATMT Từ đầy đủ giải thích Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) AS Acetosyringone bp base pair BSA Bovine Serum Albumin CD Czapek-Dox Ct Cycle threshold (ngưỡng chu kỳ) DNA Deoxyribonucleic acid DSB Double-strand break (đứt sợi kép) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GRAS Generally Recognized As Safe (được nhận dạng an toàn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) IGPD Imidazoleglycerol phosphate dehydratase IM Induction medium (môi trường cảm ứng để chuyển gen) kb kilobase pairs LB Luria Bertani (môi trường LB) MM Miminal Medium (môi trường tối thiểu) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid NAT Nourseothricin N-acetyl transferase NHEJ Non-homologous end joining (nối đầu cuối không tương đồng) OD Optical Density (mật độ quang) OTA Ochratoxin A PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar (môi trường PDA) PSM Phytase Screening Medium (môi trường sàng lọc phytase) PMT Protoplast-mediated transformation (chuyển gen thông qua tế bào trần) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA T-DNA Transferred DNA (DNA vận chuyển) Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u) TF Transcription factor (yếu tố điều hòa) Vir Virulence region (vùng độc lực) DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật khởi động Bảng 2.2 Các vector sử dụng làm khung nghiên cứu Bảng 3.1 Tỷ lệ xoá số gen điều hoà nấm sợi A oryzae với marker hisB Bảng 3.2 Tỷ lệ xố số gen điều hồ nấm sợi A niger với marker hisB Trang 43 44 101 102 Bảng 3.3 Kết xác định số quy đổi số chủng chuyển gen phyA A oryzae 128 Bảng 3.4 Kết xác định số quy đổi số chủng chuyển gen phyA A niger 135 PHỤ LỤC 20 Khả sinh trưởng chủng A oryzae nguồn cacbon khác Chú thích: A oryzae RIB40 sử dụng làm đối chứng Các đĩa ủ 30oC ngày 29 PHỤ LỤC 21 Khả sinh trưởng chủng A niger nguồn cacbon khác Chú thích: A niger N402 sử dụng làm đối chứng Các đĩa ủ 30oC ngày 30 PHỤ LỤC 22 Khả đáp ứng stress thẩm thấu NaCl sorbitol chủng A oryzae với nồng độ khác Chú thích: A oryzae RIB40 sử dụng làm đối chứng Các đĩa ủ 30oC ngày 31 PHỤ LỤC 23 Khả đáp ứng stress thẩm thấu NaCl sorbitol chủng A niger với nồng độ khác Chú thích: A niger N402 sử dụng làm đối chứng Các đĩa ủ 30oC ngày 32 PHỤ LỤC 24 Sơ đồ so sánh q trình tạo chủng đột biến xố kép laeA stuA A niger N402 (N402ΔlaeAΔstuA) với việc sử dụng marker chọn lọc tái sử dụng marker chọn lọc pyrG 33 PHỤ LỤC 25 Sự phân phối giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) cho gen tham chiếu mẫu thí nghiệm A niger Chú thích: Đường cắt ngang qua hộp thể giá trị trung vị Hộp cho giá trị phân vị thứ 25 75 34 PHỤ LỤC 26 Mức độ biểu gen mã hóa cho q trình sinh độc tố nấm số chủng xóa gen thơng qua định lượng real-time PCR Chú thích: Mức độ biểu mRNA gen hal, bZIP, p450, nrps, pks mã hố cho q trình sinh độc tố ochratoxin A (OTA) fum1 mã hố cho q trình sinh độc tố fumonisin B2 (FB2) A niger N402, N402∆laeA, N402∆stuA, N402∆laeA∆stuA so sánh sử dụng gen tham chiếu cox5 Các chủng nấm nuôi lắc môi trường CD lỏng 35 PHỤ LỤC 27 Kết tạo chủng đột biến xố kép N402∆amyR∆stuA Chú thích: (A) Hình ảnh chuyển gen xoá stuA N402∆amyR∆pyrG (B) Sơ đồ xác nhận xố stuA nhờ PCR với vị trí bám mồi đặc hiệu (B) Kết xác nhận xóa gen stuA nhờ PCR với cặp mồi AnstuA-orf-F2/AnstuA-orf-R AnstuA-orfF/AnstuA-P5, (-) đối chứng âm M DNA marker kb (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) 36 PHỤ LỤC 28 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh trưởng chủng xố kép N402∆amyR∆stuA Chú thích: (A) Khả sinh trưởng chủng xoá kép N402∆amyR∆stuA nguồn cacbon khác (sucrose, glucose, maltose, cellulose, lactose, tinh bột) sau ngày 30oC so sánh với chủng N402, N402∆stuA N402∆amyR (B) Đường kính khuẩn lạc chủng nấm nguồn cacbon khác 37 PHỤ LỤC 29 Kết tạo chủng đột biến xoá kép N402∆prtT∆stuA Chú thích: (A) Hình ảnh chuyển gen xố stuA N402∆prtT∆pyrG (B) Kết sàng lọc chủng xoá kép N402∆prtT∆stuA môi trường CDA (C) Kết xác nhận xóa gen stuA nhờ PCR với cặp mồi AnstuA-orf-F2/AnstuA-orf-R AnstuA-orfF/AnstuA-P5 (-) đối chứng âm M DNA marker kb (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) 38 PHỤ LỤC 30 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh trưởng chủng xố kép N402∆prtT∆stuA Chú thích: (A) Khả sinh trưởng chủng xoá kép N402∆prtT∆stuA nguồn cacbon khác (sucrose, glucose, maltose, cellulose, lactose, tinh bột) sau ngày 30oC so sánh với chủng N402, N402∆stuA N402∆prtT (B) Đường kính khuẩn lạc chủng nấm nguồn cacbon khác 39 PHỤ LỤC 31 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh trưởng chủng xoá kép RIB40∆laeA∆stuA Chú thích: (A) Khả sinh trưởng chủng xoá kép RIB40∆laeA∆stuA nguồn cacbon khác (sucrose, glucose, cellulose, galactose, lactose) sau ngày 30oC so sánh với chủng RIB40, RIB40∆laeA RIB40∆stuA (B) Đường kính khuẩn lạc chủng nấm nguồn cacbon khác 40 PHỤ LỤC 32 Kết đánh giá tỷ lệ xoá gen veA A niger có hoạt động marker chọn lọc thứ hai (marker pyrG) 41 PHỤ LỤC 33 Khả sinh trưởng chủng A niger biểu mức phyA Chú thích: Các chủng A niger N402, N402∆amyR, N402∆laeA, N402∆prtT, N402∆stuA, N402∆veA sử dụng làm đối chứng Các đĩa ủ 30oC ngày 42 PHỤ LỤC 34 Kết tạo chủng đột biến ∆stuA∆pyrG phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen Chú thích: (A) Sơ đồ xác nhận xố pyrG chủng xoá gen stuA nhờ PCR với vị trí bám mồi đặc hiệu (B) Kết xác nhận xóa pyrG nhờ PCR với cặp mồi pyrG-orf-F/pyrG-orf-R AnstuA-orf-F/AnstuA-P5 (-) đối chứng âm M DNA marker kb (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) (C) Kết kiểm tra chủng ∆stuA∆pyrG mơi trường CDA có/khơng bổ sung uridine/uracil Các đĩa ủ 30oC ngày 43