Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.

Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen mới phục vụ cải biến di truyền một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Thái Hạnh Dung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN MỚI PHỤC VỤ CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI THUỘC CHI Aspergillus LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Thái Hạnh Dung NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN GEN MỚI PHỤC VỤ CẢI BIẾN DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI NẤM SỢI THUỘC CHI Aspergillus Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420101.07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VĂN TUẤN PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Trần Văn Tuấn PGS.TS Nguyễn Quang Huy Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực, phần công bố Tạp chí Khoa học, phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2023 Tác giả luận án Thái Hạnh Dung LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy dành nhiều thời gian, tâm huyết, trí tuệ để bảo, định hướng, cho hội thực hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Giám đốc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy quan tâm, động viên hết lịng giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, giảng dạy, hỗ trợ sẵn sàng tạo điều kiện để học tập rèn luyện Tôi xin cảm ơn Đề tài Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia NAFOSTED (mã số: 106.04-2018.36), Tập đồn Vingroup – Cơng ty Cổ phần Chương trình học bổng thạc sĩ, tiến sĩ nước Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn, mã số VINIF.2021.TS.076 hỗ trợ kinh phí để tơi hồn thành nghiên cứu Tơi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo, Khoa Sinh học Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người thân tập thể nhóm nghiên cứu Phịng Genomic, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym Protein sát cánh, ủng hộ, động viên giúp đỡ Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2023 Tác giả luận án Thái Hạnh Dung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 10 Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 14 1.1 Giới thiệu chi Aspergillus 14 1.1.1 Đặc điểm phân loại 14 1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 15 1.1.3 Di truyền học hệ gen nấm 16 1.1.4 Vai trò ứng dụng công nghệ sinh học công nghiệp 16 1.2 Nấm sợi A oryzae 18 1.2.1 Đặc điểm hình thái 18 1.2.2 Hệ gen A oryzae 19 1.2.3 Sinh thái học ý nghĩa kinh tế 20 1.3 Nấm sợi A niger 21 1.3.1 Đặc điểm hình thái 21 1.3.2 Hệ gen A niger 22 1.3.3 Sinh thái học ý nghĩa kinh tế 22 1.4 Một số phương pháp chuyển gen phục vụ cải biến di truyền nấm sợi 23 1.4.1 Chuyển gen xung điện 23 1.4.2 Chuyển gen sóng xung kích 24 1.4.3 Chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast-mediated transformation, PMT) … 25 1.4.4 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT) 26 1.5 Marker chọn lọc dùng chuyển gen 29 1.5.1 Marker chọn lọc gen kháng thuốc 29 1.5.2 Marker chọn lọc gen dinh dưỡng 30 1.6 Một số protein điều hoà quan trọng nấm sợi Aspergillus 33 1.6.1 AmyR 34 1.6.2 LaeA 34 1.6.3 PrtR/PrtT 36 1.6.4 StuA 36 1.6.5 VeA 37 1.7 Các chiến lược tăng cường sản xuất enzyme/protein A oryzae A niger 38 1.7.1 Tối ưu hóa cấu trúc biểu gen 38 1.7.2 Giảm phân hủy protein ngoại bào 40 1.7.3 Cải biến hình thái học hệ sợi nấm 40 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Các chủng vi sinh vật vector sử dụng nghiên cứu 42 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 42 2.1.2 Các vector sử dụng nghiên cứu 43 2.2 Môi trường nuôi cấy 44 2.3 Các cặp mồi dùng phản ứng PCR 45 2.4 Thiết bị, hóa chất 45 2.5 Phương pháp nghiên cứu 46 2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 46 2.5.2 Thu bào tử hệ sợi nấm 46 2.5.3 Tách chiết DNA tổng số, tách chiết RNA tổng số tạo cDNA 47 2.5.4 Tạo vector dùng cho xoá gen biểu gen A oryzae A niger 48 2.5.5 Chuyển gen vào A oryzae A niger nhờ vi khuẩn Ag tumefaciens sử dụng marker chọn lọc gen dinh dưỡng 53 2.5.6 Sàng lọc, đánh giá kiểm tra khả sinh trưởng tiết protein/enzyme chủng chuyển gen 55 2.5.7 Xác định số mức độ hoạt động gen phyA thông qua real- time PCR…… 57 2.5.8 Xác định phân tích gen A oryzae A niger 57 2.5.9 Phân tích xử lý số liệu 57 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 Phát triển hệ thống chuyển gen với marker chọn lọc gen dinh dưỡng hisB phục vụ cải biến di truyền nấm sợi A oryzae A niger 58 3.1.1 Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng histidine nhờ xóa gen hisB theo chế trao đổi chéo tương đồng 58 3.1.2 Chuyển gen vào A oryzae A niger sử dụng phương pháp ATMT với marker chọn lọc hisB 68 3.1.3 Tạo chủng đột biến khuyết dưỡng kép nhờ phương án tái sử dụng marker chọn lọc pyrG 77 3.1.4 Xây dựng đánh giá hiệu chuyển gen vector nhị thể mới… 79 3.2 Hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn Ag tumefaciens (ATMT) phát triển cho phép thực nghiên cứu chức gen 82 3.2.1 Tạo vector nhị thể pKH1 phục vụ xóa gen 82 3.2.2 Xoá bổ trợ thành cơng gen điều hịa laeA A oryzae A niger cách sử dụng hệ thống ATMT xây dựng 83 3.3 Đánh giá hiệu xoá gen sử dụng hệ thống ATMT xác định vai trò số gen cụ thể 91 3.3.1 Sử dụng marker hisB phục vụ xóa gen stuA A oryzae A niger 91 3.3.2 So sánh hiệu xóa số gen điều hịa A oryzae A niger .98 3.3.3 Hệ thống chuyển gen marker hisB pyrG cho phép dễ dàng tạo chủng đột biến xóa kép 101 3.4 Thiết lập phương án để tăng hiệu xoá gen A oryzae A niger .110 3.4.1 Phương án tăng tỷ lệ xoá gen nấm sợi A oryzae 112 3.4.2 Phương án tăng tỷ lệ xoá gen nấm sợi A niger 115 3.5 Khai thác hệ thống chuyển gen phát triển để biểu enzyme tái tổ hợp 121 3.5.1 Tạo vector nhị thể mang cấu trúc biểu gen phyA chuyển thành công vào nấm sợi A oryzae A niger 121 3.5.2 Xác định số gen phyA chủng chuyển gen xác định hoạt tính enzyme phytase chủng chuyển gen 126 3.5.3 Áp dụng hệ thống chuyển gen để tuyển chọn chủng nấm sợi A niger đột biến phục vụ biểu enzyme tái tổ hợp hiệu suất cao 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 140 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ATMT Từ đầy đủ giải thích Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) AS Acetosyringone bp base pair BSA Bovine Serum Albumin CD Czapek-Dox CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Ct Cycle threshold (ngưỡng chu kỳ) DNA Deoxyribonucleic acid DSB Double-strand break (đứt sợi kép) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GFP Green Fluorescent Protein (Protein phát huỳnh quang xanh) gRNA Guide RNA (RNA dẫn đường) GRAS Generally Recognized As Safe (được nhận dạng an toàn) HEPES 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) IGPD Imidazoleglycerol phosphate dehydratase IM Induction medium (môi trường cảm ứng để chuyển gen) kb kilobase pairs LB Luria Bertani (môi trường LB) MM Miminal Medium (môi trường tối thiểu) MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid NAT NHEJ Nourseothricin N-acetyl transferase Non-homologous end joining (nối đầu cuối không tương đồng) OD Optical Density (mật độ quang) OMP Orotidine-5’-monophosphate OTA Ochratoxin A PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar (môi trường PDA) PSM Phytase Screening Medium (môi trường sàng lọc phytase) PMT Protoplast-mediated transformation (chuyển gen thông qua tế bào trần) RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate TAE Tris-acetate-EDTA T-DNA Transferred DNA (DNA vận chuyển) Ti plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid cảm ứng tạo khối u) TF Transcription factor (yếu tố điều hòa) Vir Virulence region (vùng độc lực) DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách chủng vi sinh vật khởi động Bảng 2.2 Các vector sử dụng làm khung nghiên cứu Bảng 3.1 Tỷ lệ xoá số gen điều hoà nấm sợi A oryzae với marker hisB Bảng 3.2 Tỷ lệ xố số gen điều hồ nấm sợi A niger với marker hisB Bảng 3.3 Kết xác định số quy đổi số chủng chuyển gen phyA A oryzae Bảng 3.4 Kết xác định số quy đổi số chủng chuyển gen phyA A niger Trang 42 43 100 101 127 134