Luận án tiến sĩ nghiên cứu nuôi trồng và khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học của nấm ophiocordyceps sobolifera

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ HUẾ - NĂM 2021 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Ngành: Hóa Hữu Cơ Mã số: 944.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN THỊ VĂN THI GS TSKH TRỊNH TAM KIỆT HUẾ - NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, đồng tác giả cho phép sử dụng chưa công bố công trình khác Việc tham khảo nguồn tài liệu trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án Trần Văn Khoa i LỜI CẢM ƠN Trên thực tế, khơng có thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian thực luận án, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cơ, gia đình bạn bè Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Cô PGS.TS Trần Thị Văn Thi, Thầy GS TSKH Trịnh Tam Kiệt lời cám ơn chân thành, với tri thức tâm huyết mình, quý Cơ, q Thầy truyền đạt vốn kiến thức quý báu hướng dẫn cho em suốt thời gian học tập-nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Lê Trung Hiếu tạo điều kiện, hướng dẫn thực nghiệm phịng thí nghiệm Hố Hữu Cơ suốt q trình thực luận án Đồng thời, quý Cô, quý Thầy đồng hành, hỗ trợ, giúp đỡ mặt vật chất cũng tinh thần giai đoạn khó khăn q trình làm Nghiên cứu sinh Tơi xin trân trọng cảm ơn khoa Hóa học, quý Thầy Cơ khoa Hố học, mơn Hố Hữu Cơ, q Thầy Cơ mơn Hố Hữu Cơ, phịng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Bạn bè gần xa dành cho tơi tình cảm, động viên, chia sẻ giúp đỡ suốt q trình tơi học tập nghiên cứu Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình tơi; Kính gửi đến Linh Hờn Mẹ, thời gian làm luận án thời gian có dịp bên Mẹ từ khoẻ mạnh đến Mẹ qua đời, tình thương Mẹ dành cho vô bờ bến, cảm ơn Mẹ nhớ đến Mẹ, anh chị em gia đình, anh TS Trần Văn Tôn người anh đồng hành, động viên giúp đỡ em thực ước mơ học tập từ nhỏ đến Đặc biệt, xin dành lời cảm ơn sâu nặng đến vợ hai tôi, người đồng hành tạo chỗ dựa vững cho tơi suốt hành trình thực đam mê Tơi xin trân trọng cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 01 năm 2021 Tác giả luận án Trần Văn Khoa ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan loài Ophiocordyceps sobolifera chi Cordyceps 1.1.1 Nguồn gốc loài Ophiocordyceps sobolifera 1.1.2 Phân loại đặc điểm hình thái lồi Ophiocordyceps sobolifera 1.1.3 Điều kiện nuôi trồng Ophiocordyceps sobolifera 1.1.4 Thành phần hóa học lồi Ophiocordyceps sobolifera số loài thuộc giống Cordyceps .11 1.1.5 Hoạt tính sinh học lồi Ophiocordyceps sobolifera chi Cordyceps 13 1.2 Tổng quan hoạt tính chống oxy hóa 14 1.2.1 Khái niệm .14 1.2.2 Cơ chế hoạt động chất chống oxy hóa .14 1.2.3 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa .15 1.3 Tổng quan hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa .22 1.4 Tổng quan polysaccharide .27 1.4.1 Khái niệm .27 1.4.2 Hoạt tính sinh học polysaccharide 28 1.4.3 Cấu trúc polysaccharide số loài Cordyceps 29 1.5 Tổng quan mơ hình quy hoạch hố thí nghiệm 31 1.6 Nhận định tình hình nghiên cứu trước Ophiocordyceps sobolifera 33 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.1 Giống gốc .35 iii 2.1.2 Chứng nhận DNA 35 2.1.3 Ve sầu .35 2.2 Hóa chất thiết bị .36 2.3 Mục tiêu nghiên cứu .38 2.4 Nội dung nghiên cứu .38 2.5 Phương pháp nghiên cứu 39 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu nguyên liệu 39 2.5.2 Phương pháp tách chiết cao nước cao ethanol 43 2.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 43 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính bảo vệ thận thể động vật 45 2.5.5 Phương pháp Folin- Ciocalteu - trắc quang để định lượng tổng hợp chất phenol 49 2.5.6 Phương pháp tạo phức với muối nhôm môi trường kiềm- trắc quang để định lượng tổng hợp chất flavonoid 50 2.5.7 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) định lượng hợp chất phenol .51 2.5.8 Phương pháp tách chiết tinh chế polysaccharide .53 2.5.9 Phương pháp xác định cấu trúc 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera 64 3.1.1 Điều kiện hình thành kích thước sợi nấm 64 3.1.2 Điều kiện tách chiết định lượng hoạt chất polysaccharide (PS), hợp chất phenol flavonoid mẫu nấm 68 3.1.3 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đến khối lượng sinh khối hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid nấm 72 3.2 Khảo sát số hoạt tính sinh học nấm Ophiocordyceps sobolifera 81 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro mơ hình hóa học 81 3.2.2 Hoạt tính bảo vệ thận in vivo nấm Ophiocordyceps sobolifera chuột nhắt trắng bị gây tổn thương thận cisplatin 84 iv 3.3 Định tính, định lượng hoạt tính chống oxy hóa số hoạt chất phenol nấm 89 3.3.1 Định tính 89 3.3.2 Định lượng 91 3.4 Xác định cấu trúc, định lượng hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide nấm Ophiocordyceps sobolifera 95 3.4.1 Xác định cấu trúc polysaccharide mẫu PS chiết nhiệt độ 100°C (mẫu PS-T100) 80°C (mẫu PS-T80) 95 3.4.2 Định lượng polysaccharide .109 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide từ nấm Ophiocordyceps sobolifera 110 KẾT LUẬN 114 DANH MỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 118 PHỤ LỤC 133 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT O sobolifera Ophiocordyceps sobolifera C sobolifera Cordyceps sobolifera C.militaris Cordyceps militaris C sinensis Cordyceps sinensis C.subssesilis Cordyceps subssesilis PS Polysaccharide PS-Ti PS chiết nhiệt độ Ti sCr Creatinine BUN Blood urea nitrogen MDA Malonyl dialdehyde Vvm Thể tích khí/ thể tích chất lỏng/ phút ROS Reactive oxygen species DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl TPC Tổng hàm lượng hợp chất phenol TFC Tổng hàm lượng flavonoid TAC Hàm lượng chất chống oxy hóa quy tương đương gallic acid TA5C-HPLC Hàm lượng tổng hợp chất chống oxy hóa xác định phương pháp HPLC HAT Hydrogen Atom Transfer SET Single Electron Transfer CC Column Chromatography HPLC High Performance Liquid Chromatography TLC Thin Layer Chromatography Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H-NMR 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy APCI-MS Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY Correlation Spectroscopy ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry vi HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ionization - Mass Spectrometry HSQC HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IR Infrared Spectroscopy J (Hz) Hằng số tương tác tính Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy UV Ultraviolet Spectroscopy δ (ppm) (ppm = part per million) s Singlet dt Double of triplet dd Double of doublet t triplet q quartet d doublet br Broad m multiplet IC50 Inhibitory Concentration 50% ED50 Effective dose 50% BDE Bond dissociation energy IE Ionization energy Mp Melting point OD Optical Density CTPT Công thức phân tử EtOAc Ethyl acetate DMSO Dimethylsulfoxide Mw Khối lượng phân tử trung bình khối Mn Khối lượng phân tử trung bình số vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các cơng trình nghiên cứu giới mơi trường ni cấy lồi Ophiocordyceps sobolifera Bảng 1.2 Các cơng trình nghiên cứu giới vài hợp chất hóa học 11 tiêu biểu nấm Cordyceps Ophiocordyceps sobolifera Bảng 1.3 Một số hoạt tính sinh học polysaccharide tách chiết từ nấm 13 thuộc chi Cordyceps Bảng 1.4 Một số nghiên cứu mơ hình in vivo gây độc thận 21 Bảng 1.5 Một số hoạt tính sinh học polysaccharide tách chiết từ nấm 28 Ophiocordyceps sobolifera Bảng 1.6 Khối lượng phân tử polysaccharide từ loài nấm Cordyceps 29 Bảng 1.7 Thành phần monosaccharide tỉ lệ mol polysaccharide từ 30 số loài nấm Cordyceps Bảng 1.8 Các cơng bố lồi nấm Ophiocordyceps sobolifera 34 Bảng 2.1 Các loại hóa chất sử dụng luận án 36 Bảng 2.2 Tên thiết bị sử dụng luận án 37 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 46 Bảng 2.4 Mẫu thử thuốc thử đ định lượng creatinin 47 Bảng 2.5 Chương trình rửa giải dung mơi 57 Bảng 2.6 Chương trình nhiệt độ phân tích mẫu thiết bị sắc ký GC-MS 61 Bảng 2.7 Phổ FTIR polysaccharide 62 Bảng 3.1 Kích thước sợi nấm mơi trường có pH khác (n-3) 64 Bảng 3.2 Hiệu suất chiết polysaccharide điều kiện khảo sát 68 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết hợp chất phenol điều kiện khảo sát 71 Bảng 3.4 Thông số thiết lập với 04 yếu tố ảnh hưởng đến 04 hàm mục tiêu 73 Bảng 3.5 Hàm lượng PS (c), khối lượng sinh khối nấm (m), hàm lượng tổng 73 hợp chất phenol (p) tổng flavonoid (f) điều kiện thí nghiệm khác (xTB ± Sd, n=3) Bảng 3.6 Bảng phân tích yếu tố ảnh hưởng 75 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm với điều kiện tối ưu 79 viii [128] Yalin W., Cuirong S., Yuanjiang P (2006) Studies on isolation and structural features of a polysaccharide from the mycelium of an Chinese edible fungus (Cordyceps sinensis) Carbohydrate Polymers, Vol.63, Iss.2, pp.251–256 [129] Yalin W., Ishurd O., Cuirong S., et al (2005) Structure analysis and antitumor activity of (1→ 3)-β-D-glucans (cordyglucans) from the mycelia of Cordyceps sinensis Planta Medica, Vol.71, Iss.04, pp.381–384 [130] Yang J., Guo J., Yuan J (2008) In vitro antioxidant properties of rutin LWT Food Science and Technology, Vol.41, Iss.6, pp.1060–1066 [131] Yang S., Zhang H (2016) Optimization of the fermentation process of Cordyceps sobolifera Se-CEPS and its anti-tumor activity in vivo Journal of Biological Engineering, Vol.10, Iss.1, pp.1–9 [132] Yu R., Yang W., Song L., et al (2007) Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris Carbohydrate Polymers, Vol.70, Iss.4, pp.430–436 [133] Zha L.S., Xiao Y.P., Jeewon R., et al (2019) Notes on the medicinal mushroom chanhua (Cordyceps cicadae (Miq.) Massee) Chiang Mai Journal of Science, Vol.46, Iss.6, pp.1023–1035 [134] Zhang G., Yin Q., Han T., et al (2015) Purification and antioxidant effect of novel fungal polysaccharides from the stroma of Cordyceps kyushuensis Industrial Crops and Products, Vol.69, pp.485–491 [135] Zhang H.Y., Ji H.F (2006) How vitamin E scavenges DPPH radicals in polar protic media New Journal of Chemistry, Vol.30, Iss.4, pp.503–504 [136] Zhang Y., Wu Y.-T., Zheng W., et al (2017) The antibacterial activity and antibacterial mechanism of a polysaccharide from Cordyceps cicadae Journal of Functional Foods, Vol.38, pp.273–279 [137] Zhao l., Zhao g., Hui b., et al (2006) Effect of Selenium on Increasing the Antioxidant Activity of Protein Extracts from a Selenium-enriched Mushroom Species of the Ganoderma Genus Journal of Food Science, Vol.69, Iss.3, pp.FCT184–FCT188 [138] Zhou X., Gong Z., Su Y., et al (2009) Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products Journal of Pharmacy and Pharmacology, Vol.61, Iss.3, pp.279–291 131 [139] Zhou Y, Vaidya VS, Brown RP, Zhang J, Rosenzweig BA, Thompson KL, Miller TJ, Bonventre JV G.P (2008) Comparison of kidney injury moleccule1 other nephrotoxicity biomarkers in urine and kidney following acute exposure to gentamicin, mercury and chromium Toxicological Sciences, Iss.101(1), pp.159–170 [140] Zhu R., Chen Y., Deng Y., et al (2011) Cordyceps cicadae extracts ameliorate renal malfunction in a remnant kidney model Journal of Zhejiang University Science B, Vol.12, Iss.12, pp.1024–33 [141] Zhu S.J., Pan J., Zhao B., et al (2013) Comparisons on enhancing the immunity of fresh and dry Cordyceps militaris in vivo and in vitro Journal of Ethnopharmacology, Vol.149, Iss.3, pp.713–719 [142] Zolgharnein J., Shahmoradi A., Ghasemi J.B (2013) Comparative study of Box-Behnken, central composite, and Doehlert matrix for multivariate optimization of Pb (II) adsorption onto Robinia tree leaves Journal of Chemometrics, Vol.27, Iss.1–2, pp.12–20 Internet [143] Www.https://en.wikipedia.org/wiki/Quercitrin , 14/05/2018 11:33 quercetin (n.d.) [144] WWW https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C, 14/05/2018 10:09 ascorbic (n.d.) [145] http://mushroaming.com/Cordyceps-blog?page=1 (n.d.) 132 PHỤ LỤC Phương trình đường chuẩn hiệu suất PS: 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 y = 0.0069x + 0.0777 R² = 0,9999 0,3 0,2 0,1 0 20 40 60 80 Nồng độ PS 100 120 140 Hình P1 Phương trình hời quy tuyến tính xác định hiệu xuất PS 3,5 Mật độ quang 2,5 1,5 y = 10,306x + 0,1183 R² = 0,9995 0,5 0 0,1 0,2 0,3 Nồng độ gallic acid (mg/mL) 0,4 Hình P2 Phương trình hời quy tuyến tính xác định hàm tổng hợp chất phenol (phản ứng tạo màu hợp chất phenol với thuốc thử Folin – Ciocalteu) 133 2,5 Mật độ quang 1,5 y = 10,069x + 0,0545 R² = 0,9956 0,5 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Nồng độ quercetin chuẩn (mg/mL) 0,25 Hình P3 Phương trình hời quy tuyến tính xác định hàm tổng flavonoid (Phản ứng tạo phức màu flavonoid với ion Al3+ môi trường kiềm) Bảng P1 Thời gian lưu chất chuẩn gallic acid, quercetin, quercitrin, hesperidin Gallic acid 3.023 3.023 3.033 3.033 3.033 3.029 Quercetin Quercitrin 4.577 3.563 4.577 3.563 4.54 3.557 4.563 3.553 4.547 3.55 4.5608 3.5572 Hesperidin 5.383 5.383 5.37 5.347 5.337 5.364 Bảng P2 Dữ liệu xây dựng đường chuẩn concentration (ppm) gallic acid Quercitrin Quercetin hesperidin 176977 92961 95293 186937 356839 137034 181425 355938 551742 200721 274997 564432 698208 252342 347816 733863 904463 324330 474609 874571 134 1000000 900000 Diện tích peak 800000 700000 600000 500000 400000 y = 179634x - 1256,5 R² = 0,9981 300000 200000 100000 0 Nồng độ gallic acid chuẩn (ppm) Hình P4 Đường chuẩn gallic acid 500000 450000 Diện tích peak 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 y = 92502x - 2678,9 R² = 0,9927 50000 0 Nồng độ quercetin chuẩn (ppm) Hình P5 Đường chuẩn quercetin 350000 Diện tích peak 300000 250000 200000 150000 100000 y = 57805x + 28064 R² = 0,9942 50000 0 Nồng độ quercitrin chuẩn (ppm) Hình P6 Đường chuẩn quercitrin 135 1000000 900000 Diện tích peak 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 y = 175319x + 17190 R² = 0,996 100000 0 Nồng độ hesperidin chuẩn (ppm) Hình P7 Đường chuẩn hesperidin Đường chuẩn chất chuẩn gallic acid ascorbic acid khoảng nồng độ từ Mật độ quang 0,1 đến 0,5 mg/mL sử dụng mơ hình phosphor molybdenum 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 1,9343x + 0,2435 R² = 0,9987 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ Gallic acid (mg/mL) 0,6 Hình P8 Đường chuẩn gallic acid Mật độ quang 2,5 1,5 y = 4,7727x - 0,0055 R² = 0,9999 0,5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nồng độ Ascorbic acid (mg/mL) Hình P9 Đường chuẩn ascorbic acid 136 0,6 Đường chuẩn chất chuẩn MDA thử nghiệm in vivo chuột nhắt trắng: 0,600 Mật độ quang 0,500 0,400 0,300 0,200 y = 0,0796x + 0,0035 R² = 0,9992 0,100 0,000 Nồng độ MDA (nM/mL) Hình P10 Đường chuẩn MDA Hình P11 Sắc ký đờ GC-MS mẫu 137 Các hình ảnh sắc ký đồ phổ PS-T80: Hình P12 Sắc ký đờ biểu diễn khối lượng phân tử PS-T80 (7.4×104 Da) Ophiocordyceps sobolifera đo GPHPLC Hình P13 Phổ FT-IR PS-T80 tách chiết từ Ophiocordyceps sobolifera 138 Hình P14 Phổ 1H- NMR PS-T80 Hình P15 Phổ 13C NMR PS-T80 139 Hình P16 Phổ 2D 1H–13C HSQC PS-T80 Hình P17 Phổ 2D 1H–1H COSY PS-T80: a (overall); b (close up) 140 Hình P18 Phổ HMBC PS-T80 Hình P19 Cấu trúc đoạn mạch polysaccharide PS-T80 141 Kết qủa đo kiểm tra thành phần đường sau methyl hoá, mẫu so sánh mẫu PS-T100 142 143 Giấy xác nhận tên khoa học loài ve 144 Giấy chứng nhận DNA nấm Ophiocordyceps sobolifera ( Cordyceps sobolifera): 145