BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS NGƠ XN TUYẾN KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***** STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập chúng em suốt năm qua tạo điều kiện thuận lợi để chúng em hồn thành khóa luận tốt nghiệp TS Nguyễn Văn Hảo, ThS Ngơ Xn Tuyến, CN Đồn Văn Cƣờng tận tình bảo, giải đáp vƣớng mắc, khó khăn mà tơi gặp phải suốt q trình thực tập, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp KS Phạm Thị Tuyết Anh tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài TS Lý Thị Thanh Loan tạo điều kiện thuận lợi trình thực tập Viện Các anh chị phịng Mơ học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình bố trí thí nghiệm Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt bạn thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 28 chia sẻ cảm xúc vui buồn thời gian học tập giúp đỡ, động viên tơi để tơi hồn thành khóa luận Và vô biết ơn cha mẹ ngƣời thân gia đình ln động viên, giúp đỡ để hồn thành khóa luận Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Sinh viên thực Phạm Minh Nhựt iv TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006 “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT Q TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH” Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO ThS NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng virus đốm trắng (WSSV) gây nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên Việt Nam giới Các nghiên cứu trình phát sinh bệnh virus đốm trắng tôm Do việc hiểu rõ q trình phát sinh bệnh virus đốm trắng giúp cho việc tạo phƣơng thức kiểm soát bệnh Kết hợp mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch tơm sú khơng mang virus thơng thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập virus đốm trắng, phân tích xâm nhiễm tìm nguyên nhân gây chết tơm Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực nhƣ sau: tôm không mang virus thông thƣờng đƣợc gây nhiễm cách tiêm vào phần với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) liều cao (104,0 SID50/ml) Ở liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo thời điểm sau gây nhiễm Sử dụng phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch để khảo sát mẫu theo thời điểm nhằm khảo sát trình phát sinh bệnh virus đốm trắng tôm sú Các kết thu đƣợc: Các biểu lâm sàng tơm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất đốm trắng, hấp hối chết, đƣợc phát vào thời điểm 36 liều thấp 24 liều cao Vị trí xâm nhập virus đốm trắng tôm sú liều thấp xảy vào thời điểm 12 sau gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng thời điểm 33,3 % quan xâm nhiễm chúng tế bào tim với cƣờng độ nhiễm (+) v Ở liều cao, quan phát dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 sau tiêm sau nhuộm hóa mơ miễn dịch Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng thời điểm 50 % Và quan xâm nhiễm virus đốm trắng liều cao tế bào tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten tế bào màng bao bên gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+) Ở thời điểm 36 sau gây nhiễm liều gây nhiễm tất quan bị nhiễm virus đốm trắng Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng quan gây nhiễm với liều cao liều thấp có khác biệt quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dày, biểu mô dƣới vỏ mô liên kết màng bao gan tụy vi MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iv TÓM TẮT v MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi DANH SÁCH CÁC BẢNG xii PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học hệ miễn dịch tôm sú 2.1.1 Miễn dịch không đặc hiệu giáp xác 2.1.2 Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch giáp xác 2.1.3 Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase 2.1.4 Hệ thống đông máu 2.1.5 Các chất ức chế proteinase 2.1.6 Hệ thống nhận diện không chuyên biệt 2.1.7 Các peptide kháng khuẩn 2.1.8 Peroxynectin 2.2 Bệnh đốm trắng virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1 Bệnh đốm trắng 2.2.1.1 Lịch sử phân bố 10 2.2.1.2 Triệu chứng, bệnh tích 11 2.2.2 Virus đốm trắng 11 2.2.2.1 Phân loại tên gọi 11 2.2.2.2 Hình thái 12 2.2.2.3 Cấu trúc 13 2.3 Quá trình phát sinh bệnh virus đốm trắng 15 vii 2.3.1 Vật liệu gây bệnh 15 2.3.2 Cơ chế gây bệnh 16 2.3.3 Cơ chế lây lan 17 2.4 Mơ hình cảm nhiễm chuẩn virus tơm 18 2.5 Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch 19 2.5.1 Nguyên lý 19 2.5.2 Kháng nguyên 20 2.5.3 Kháng thể 20 2.5.4 Phƣơng pháp nhuộm 21 2.5.4.1 Phƣơng pháp trực tiếp 21 2.5.4.2 Phƣơng pháp gián tiếp 22 2.5.4.3 Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) 23 2.5.4.4 Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) 23 2.5.4.5 Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 25 3.1 Thời gian địa điểm 25 3.1.1 Thời gian 25 3.1.2 Địa điểm 25 3.2 Vật liệu 25 3.2.1 Vật liệu dụng cụ sử dụng trình gây nhiễm thực nghiệm 25 3.2.1.1 Vật liệu 25 3.2.1.2 Dụng cụ 25 3.2.2 Các hóa chất dụng cụ sử dụng IHC 26 3.2.2.1 Hóa chất 26 3.2.2.2 Vật tƣ 26 3.2.2.3 Thiết bị 26 3.3 Bố trí thí nghiệm 27 3.3.1 Tơm điều kiện thí nghiệm 27 3.3.2 Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) 27 3.3.3 Gây nhiễm virus đốm trắng tôm sú 27 3.3.4 Thời gian theo dõi thu mẫu để khảo sát trình phát sinh bệnh 28 viii 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch virus 28 3.4.2 Phƣơng pháp thu mẫu tôm 29 3.4.3 Phƣơng pháp nhuộm IHC 30 3.4.4 Xử lý thống kê 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Độc lực virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) 35 4.1.1 Các dấu hiệu lâm sàng tỷ lệ gây chết 35 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm tôm thí nghiệm theo thời điểm 36 4.2 Khảo sát trình phát sinh bệnh virus đốm trắng dịng Việt Nam tơm sú 37 4.2.1 Quá trình phát sinh bệnh WSSV-VN tôm sú liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) 38 4.2.2 Quá trình phát sinh bệnh WSSV-VN tôm sú liều cao (104,0 SID50/ml) 42 4.2.3 So sánh hai liều gây nhiễm trình phát sinh bệnh 46 4.3 Thảo luận 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên x 55 25 Tsai J.M., Hang H.C., Leu J.H., Hsiao H.H., Wang Andrew H.J., Kou G.H and Lo C.F., 2004 Genomic and Proteomic Analysis of Thirty-Nine Structural Proteins of Shrimp White Spot Syndrome Virus Journal of Virology, p 11360 – 11370 26 Van der Braak K., 2002 Haemocytic defense in black tiger shrimp (Penaeus monodon), Wageningen 27 Van Hulten, Martin Reijns, Angela M G Vermeesch, Fokko Zanbergen and Just M.Vlak, 2002 Identification of VP19 and VP15 of white spot syndrome virus (WSSV) and glycosylation status of the WSSV major structure proteins Journal of General Virololy (2002), 82, 257 – 265 28 Vlak J.M., Jean-Robert Bonami, Tim W Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V Lightner, Chu Fang Lo, Philip C Loh and Peter J Walker, 2002 Nimaviridae, A new virus family infecting aquatic invertebrates XIIth InternationalCongress oj Virology 29 Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X.B and Xu X., 2001 Complete Genome Sequence of Shrimp White Spot Bacilliform Virus Journal of Virology, p 11811 – 11820 30 Yi G., W Z., Qi Y.P., Yao L.G., Qian J., Hu L.B., 2004 VP28 of Shrimp White Spot Syndrome Virus Is Involved in the Attachment and Penetration into Shrimp Cell Journal of Biochemistry and Molecular Biology, p 726 – 734 31 Wang R., Liang Z., M Hall, K Soderhall, 2001 A transglutaminase involved in the coagulation system of the freshwater, Pacifastacus leniusculus Tissue localisation and cDNA cloning Fish and Shellfish immunology, p 623 – 637 32 Wittevelt J., 2004 On the vaccination of shrimp against white spot syndrome virus Ph.D thesis Wageningen University 33 Zhang Xiaobo, Canhua Huang, Xun xu and Choy L Hew, 2002 Identification and localization of a prawn white spot syndrome virus gene that encodes an envelope protein Journal of General Virology (2002), 83, 1069 – 1074 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Trọng lƣợng thể tôm đƣợc sử dụng thí nghiệm Thời gian thu mẫu Con Con Con Con Con Con (giờ) (g) (g) (g) (g) (g) (g) 6 6 8 8 12 10 18 7 10 7 10 24 7 36 11 7 48 9 60 6 8 7 7 12 6 10 10 18 6 24 11 9 36 7 9 48 12 10 60 10 Liều Thấp Cao 57 PHỤ LỤC 2: Thành phần số hóa chất sử dụng thí nghiệm Dung dịch Davidson Cồn 95% : 330 ml Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nƣớc cất : 335 ml Hóa chất làm lame dƣơng Aceton : 250 ml (3-aminopropyl) triethoxysaline : ml PHỤ LỤC 3: Kết theo dõi trình xâm nhiễm virus đốm trắng WSSVN liều tiêm thấp Thời gian (giờ) 12 18 Con Lympho 6 6 - Ruột - Mô liên kết gan - Tim Mang + + - + - Mô tạo máu Ruột trước Tuyến anten Dạ dày - + - - + - - - - Biểu mô vỏ - 58 24 36 48 60 6 6 - + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + - + - + + + + + + + + + ++ + + + ++ + + + + + + ++ ++ + + + + + + + + + ++ + + + + ++ ++ + + ++ + + + + + + + ++ + + + ++ + ++ + ++ + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ ++ ++ ++ + + + + + ++ + + + ++ + ++ ++ ++ ++ + + ++ + ++ ++ + + PHỤ LỤC 4: Kết theo dõi trình phát sinh bệnh virus đốm trắng WSSV-VN liều tiêm cao Thời gian (giờ) Con 6 Ruột Lympho Gan Tim Mang - - - - - Mô tạo máu - Ruột Tuyến Dạ trƣớc anten dày - - - Biểu mô dƣới vỏ - 59 12 18 24 36 48 60 6 6 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + ++ + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + ++ + ++ + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + ++ + + + + + + - ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + + + + + + ++ + + + + ++ + + + + ++ + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + ++ + ++ ++ ++ + ++ ++ 60 PHỤ LUC 5: Kết xử lý thống kê One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Lymphoid Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.139455 1.1394548 4.965 0286 Within groups 19.048780 83 2295034 Total (corrected) 20.188235 84 11 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Lymphoid by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 41 2682927 0700556 0748174 1630453 3735401 44 5000000 0762493 0722218 3984039 6015961 Total 85 3882353 0519619 0519619 3151393 4613313 Multiple range analysis for KETQUA.Lymphoid by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 41 2682927 X 44 5000000 X contrast difference +/limits - -0.23171 0.20688 * * denotes a statistically significant difference 61 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Ruot_giua Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 392912 3929119 1.856 1766 Within groups 18.416077 87 2116790 Total (corrected) 18.808989 88 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Ruot_giua by KETQUA.Lieu_tiem -Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 46 2391304 0635867 0678360 1437689 3344920 43 3720930 0745845 0701624 2734610 4707251 Total 89 3033708 0487690 0487690 2348129 3719287 Multiple range analysis for KETQUA.Ruot_giua by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 46 2391304 X 43 3720930 X contrast difference +/limits - -0.13296 0.19402 * denotes a statistically significant difference 62 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Mo_lien_ket Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.822625 1.8226250 15.682 0001 Within groups 10.808954 93 1162253 Total (corrected) 12.631579 94 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Mo_lien_ke by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 48 0208333 0208333 0492073 0482778 0899445 47 2978723 0674286 0497280 2280298 3677148 Total 95 1578947 0349775 0349775 1087692 2070202 Multiple range analysis for KETQUA.Mo_lien_ke by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 48 0208333 X 47 2978723 X contrast difference +/limits - -0.27704 0.13896 * * denotes a statistically significant difference 63 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Tim Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 315837 3158366 1.287 2596 Within groups 22.329325 91 2453772 Total (corrected) 22.645161 92 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Tim by KETQUA.Lieu_tiem -Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 47 3617021 0708449 0722550 2601913 463213 46 4782609 0744651 0730362 3756526 5808692 Total 93 4193548 0513660 0513660 3471910 4915187 Multiple range analysis for KETQUA.Tim by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 47 3617021 X 46 4782609 X contrast difference +/limits - -0.11656 0.20412 * denotes a statistically significant difference 64 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Mang Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.500000 1.5000000 6.278 0139 Within groups 22.458333 94 2389184 Total (corrected) 23.958333 95 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Mang by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 48 3541667 0697614 0705512 2550922 4532411 48 6041667 0713322 0705512 5050922 7032411 Total 96 4791667 0498872 0498872 4091104 5492229 Multiple range analysis for KETQUA.Mang by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 48 3541667 X 48 6041667 X contrast difference +/limits - -0.25000 0.19815 * * denotes a statistically significant difference 65 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Mo_tao_mau Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 578126 5781262 2.399 1248 Within groups 22.411348 93 2409822 Total (corrected) 22.989474 94 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Mo_tao_mau by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 48 3333333 0687614 0708552 2338179 4328487 47 4893617 0737043 0716050 3887932 5899302 Total 95 4105263 0503652 0503652 3397889 4812637 Multiple range analysis for KETQUA.Mo_tao_mau by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 48 3333333 X 47 4893617 X contrast difference +/limits - -0.15603 0.20009 * denotes a statistically significant difference 66 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Ruot_truoc Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.431499 1.4314993 6.122 0153 Within groups 20.343782 87 2338366 Total (corrected) 21.775281 88 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Ruot_truoc by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 46 3043478 0685922 0712980 2041194 4045762 43 5581395 0766283 0737432 4544738 6618053 Total 89 4269663 0512579 0512579 3549095 4990230 Multiple range analysis for KETQUA.Ruot_truoc by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 46 3043478 X 43 5581395 X contrast difference +/limits - -0.25379 0.20392 * * denotes a statistically significant difference 67 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Tuyen_anten Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.757709 1.7577089 7.620 0070 Within groups 21.221014 92 2306632 Total (corrected) 22.978723 93 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Tuyen_anten by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 48 2916667 0663000 0693216 1942913 3890420 46 5652174 0738988 0708126 4657477 6646871 Total 94 4255319 0495365 0495365 3559485 4951153 Multiple range analysis for KETQUA.Tuyen_anten by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 48 2916667 X 46 5652174 X contrast difference +/limits - -0.27355 0.19686 * * denotes a statistically significant difference 68 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Da_day Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 981579 9815788 4.055 0471 Within groups 21.545894 89 2420887 Total (corrected) 22.527473 90 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Da_day by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 46 3478261 0709997 0725451 2458768 4497754 45 5555556 0749111 0733468 4524797 6586314 Total 91 4505495 0515782 0515782 3780654 5230335 Multiple range analysis for KETQUA.Da_day by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 46 3478261 X 45 5555556 X contrast difference +/limits - -0.20773 0.20503 * * denotes a statistically significant difference 69 One-Way Analysis of Variance Data: KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo Level codes: KETQUA.Lieu_tiem Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level Between groups 1.041667 1.0416667 4.273 0415 Within groups 22.916667 94 2437943 Total (corrected) 23.958333 95 missing value(s) have been excluded Table of means for KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo by KETQUA.Lieu_tiem Stnd Error Stnd Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean 48 3750000 0706166 0712674 2749197 4750803 48 5833333 0719124 0712674 4832530 6834136 Total 96 4791667 0503937 0503937 4083992 5499341 Multiple range analysis for KETQUA.Bieu_mo_duoi_vo by KETQUA.Lieu_tiem Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups 48 3750000 X 48 5833333 X contrast difference +/limits - -0.20833 0.20016 * - * denotes a statistically significant difference