Insulin trong điều trị tiểu đường typI,II. Vai trò của insulin trong cơ thể. Các sản phẩm insulin hiện nay. Sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, các phương pháp sản xuất cũ và trong tương lai.
INSULIN VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT T r ư ờ n g Đ ạ i h ọ c H ả i P h ò n g V i ệ n đ à o t ạ o v à n g h i ê n c ứ u p h á t t r i ể n S i n h - N ô n g C a n h . c o m i c @ g m a i l . c o m [ T y p e t h e f a x n u m b e r ] Nguyễn Đình Cảnh Đoàn Thị Hải Dương !"#$ %& '()#*+,-. %& /01 INSULIN VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN I. MỞ ĐẦU. Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.Trên thế giới, con số những người mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), và dự kiến con số này sẽ là 221 triệu (năm 2010), năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng con số những người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch… Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục gia tăng. Trong đó, tiểu đường type 2 chiếm khoảng hơn 90% tổng số ca bệnh. Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiệp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này. 2 | 2 3 II. NỘI DUNG. 1. Insulin 1.1 Lịch sử phát hiện Insulin. Bệnh tiểu đường từng được biết đến từ thời cổ đại. Những tài liệu cổ của người Ai Cập từ 1.500 năm trước Công nguyên đã mô tả một bệnh suy mòn với tình trạng nước tiểu của người bệnh có vị ngọt. Từ những năm 1850 trở đi, các cuộc khám nghiệm tử thi trên bệnh nhân bị bệnh tiểu đường đã gợi ý, bệnh xuất hiện là do tuyến tụy không bảo đảm được chức năng bình thường. Nhiều bác sĩ cho rằng các tế bào biệt hóa, được gọi là tiểu đảo Langerhan, sản sinh ra một hóa chất giúp cơ thể điều hòa nồng độ đường trong máu. Bệnh tiểu đường xuất hiện khi hóa chất này không được sản sinh. Năm 1922, Fred Banting và Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp Toronto(Canada) thông báo họ đã tìm ra insulin và ứng dụng thành công chất này trong điều trị bệnh tiểu đường ở người. Vào thời điểm đó, người bị bệnh tiểu đường phải vật lộn với căn bệnh để tồn tại và chưa có biện pháp điều trị hiệu quả nào. Bệnh nhân nhanh chóng trở thành những bộ xương di động và thường chết sớm do bị sút cân nghiêm trọng. Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó, và hậu quả là chúng bị tiểu đường (thử nghiệm này nghe có vẻ tàn nhẫn, nhưng đã giúp cứu sống hàng triệu con người). Họ đã cố gắng tinh chế ra một hoóc môn hóa học từ tụy và chiết xuất nhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan. Sau đó, những chất này được tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm và họ nhận thấy bệnh tiểu đường đã bị đẩy lùi. Ban đầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây những tai biến nguy hiểm. Một đội ngũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên cứu và tạo ra được tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm trên người bệnh. Vào tháng 5 năm 1922, Leonard Thompson, 14 tuổi, đã được điều trị thành công ở Bệnh viện Toronto bằng tinh chất này (được gọi là insulin). Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã chứng minh rằng insulin là một protein.Tin tức về sự thành công của Banting và Best đã nhanh chóng lan rộng và ngay sau đó phòng thí nghiệm của họ đã không thể đáp ứng đủ nhu cầu về loại thần dược mới này. Quy trình sản xuất thương mại insulin bắt đầu bằng việc chiết suất chất này từ tụy của bò và lợn thịt (hiện vẫn là nguồn insulin quan trọng đối với y học). Quá trình biến đổi hóa học đã làm cho insulin này giống với hoóc môn của người và cũng tạo cho nó 3 | 2 3 những đặc tính thuận tiện hơn cho việc sử dụng. Ban đầu, insulin được tiêm 3-4 lần/ngày trước bữa ăn. Sau đó, loại insulin có tác dụng kéo dài được ra đời, vì vậy số lần tiêm đã giảm xuống. Năm 1955, Frederick Sanger, người đoạt giải thưởng Nobel, đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin người. Điều này đã cho phép các nhà khoa học tạo ra một gene insulin, dùng để tạo ra chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả năng sản sinh ra số lượng lớn insulin với độ tinh khiết cao. Ngày nay, chúng ta đều biết rằng insulin giúp các tế bào của cơ thể hấp thu đường từ thức ăn đã được tiêu hóa. Gan có vai trò đặc biệt quan trọng trong quy trình điều hòa nồng độ đường máu của cơ thể. Insulin giúp cho gan có thể tiếp nhận đường (glucose) sau bữa ăn và lưu trữ dưới dạng glycogen. Glycogen sau đó sẽ được chuyển hóa thành glucose và trở lại máu khi nồng độ đường máu bắt đầu giảm. 1965, người ta đã tổng hợp nhân tạo hai chuỗi polipepetit A và B rồi tạo ra Insulin nhân tạo nhưng giá thành quá đắt. Năm 1978, lần đầu tiên Insulin được tổng hợp nhờ vi khuẩn E.Coli bằng công nghệ di truyền. Người ta đã tạo ra các dòng plasmic tái tổ hợp bằng cách gắn các đoạn gen tổng hợp chuỗi polipeptit A và B vào các vật chất di truyền của tế bào E.Coli , sau đó gắn hai loại chuỗi polipeptit với nhau tạo ra phân tử Insulin có hoạt tính dùng trong chữa bệnh. 4 Insulin và bệnh tiểu đường. 45 Cấu trúc phân tử insulin. Insulin là một hoocmon protein do các tế bào tuyến tụy beta của đảo Langerhans sinh ra. Phân tử Insulin tương đối nhỏ, có khối lượng khoãng 6000 Dalton, được cấu tạo bởi hai chuỗi polipeptit A và B. Các chuỗi A và B liên kết nhau bằng cầu nối disulfua, ngoài ra còn có một cầu nối disulfua nằm trong chuỗi A. Ở hầu hết các loài, chuỗi A gồm 21 axitamin còn chuỗi B gồm 30 axitamin. Mặc dù trình tự các aaxitamin khác nhau giữa các loài nhưng một số đoạn nhất định của phân 4 | 2 3 tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó có chứa 3 cầu nối disulfua, cả hai đầu của chuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B. Sự tương đồng trong tình tự axitamin dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau. Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác Các phân tử Insulin có xu hướng tạo thành dạng dime trong dung dịch do hình thành các liên kết H giữa các đầu COOH của các chuỗi B. Ngoài ra, khi có mặt ion kẽm, các dime insulin liên kết tạo thành hexame. Các mối tương tác này có ý nghĩa rất quan trọng trong điều trị. Dạng monome và dime dễ dàng khuếch tán vào trong máu, trong khi đó dạng hexame khuếch tán rất kém. Do đó, sự hấp thụ các thuốc chứa hàm lượng hexame cao thường bị chậm và ngừng hẳn. Vấn đề này đã thúc đẩy sự ra đời của một số loại chất insulin giả tái tổ hợp. Loại chất đầu tiên như thế được bán trên thị trường là insulin lispro, phân tử chất này có trật tự lisin và prolin trên đầu COOH của chuỗi B bị đảo ngược, làm giảm khả năng hình thành dạng dime và hexame. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B-C-A. Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng là tạo thành insulin. 5 | 2 3 Cấu trúc phân tử Insulin 44 Vai trò của Insulin. Insulin là một trong những hoocmon điều hòa nồng độ Glucose trong máu. Chức năng cân bằng nội môi và năng lượng sinh học này cực kỳ quan trọng bởi vì Glucose là nguồn nguyên liệu chính của hô hấp tế bào và nguồn khung Cacbon quyết định cần cho tổng hợp các chất hữu cơ. Cân bằng trao đổi chất phụ thuộc vào việc duy trì Glucose máu ở gần một điểm ổn định,khoãng 90mg/ml ở người ( Theo Campbell) 1.2.2.1 Insulin và trao đổi Hidratcacbon: Glucose được giải phóng từ tinh bột, saccarose….nhờ thủy phân khi tiêu hóa thức ăn, sau đó được hấp thụ vào máu ở ruột non. Nồng độ Glucose cao trong máu kích hoạt sự giải phóng Insulin và Insulin hoạt động trong các tế bào khắp cơ thể nhằm thscđẩy sự hấp thụ, sử dụng và dự trữ Glucose. Tác động của Insulin lên trao đổi Glucose thay đổi tùy theo mô đích. Các phân tử Insulin tuần hoàn theo dòng máu cho tới khi chúng gắn vào thụ thể của chúng trên màng tế bào. Khi đó, phức hợp thụ thể -Insulin khởi phát một chuỗi truyền tín hiệumang thông tin được phát ra từ Insulin : chuyển glucose ra khỏi huyết tương. 6 | 2 3 Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào và tuần hoàn trong máu Trong một loạt các đáp ứng tế bào do sự hoạt hóa Insulin gây ra thì bước chìa khóa trong trao đổi chất Glucose GLUT4 glucose transporter. Nhờ sự vận chuyển thuận lợi glucose vào trong các tế bào, các GLUT4 đã loại glucose ra khỏi dòng máu một cách hiệu quả. Những thay đổi như vậy kéo dài từ vài phút đến vài giờ. GLUT4 có mặt trên màng tế bào của nhiều loại mô trong cơ thể như mô cơ xương( đốt cháy Glucose làm năng lượng), mô mỡ ( chuyển glucose thành tryglyxerit để dự trữ) và mô gan. Insulin thúc đẩy gan dự trữ Glucose để hình thành Glycogen. Phần lớn Glucose được hấp thụ ngay tại ruột non vào các tế bào gan, chuyển hóa thành chất dự trữ glycogen. Insulin có nhiều tác động trong gan thúc đẩy sinh tổng hợp glycogen. Đầu tiên nó hoạt hóa enzym hexokinaza, chất này photphorin hóa glucose, nhờ đó glucose bị bẩy vào trong tế bào. Insulin còn ức chế hoạt động của Glucose-6-phosphatase. Insulin cũng hoạt hóa nhiều enzym liên quan trực tiếp đến sinh tổng hợp glycogen, bao gồm phosphofructokinase và glucogen syntase. Khi không có mặt Insulin, tổng hợp Glycogen trong gan dừng lại và các enzym chịu trách nhiệm phân hủy Glycogen sẽ hoạt động. 7 | 2 3 Insulin điều hòa lượng glucose trong máu Vì Insulin ngăn cản mức độ tăng quá cao của đường máu nên không được phép có quá nhiều Insulin. Một bước trong kiểm soát mức độ Insulin là enzym Insulinnase ( được tìm thấy trong gan và thận ) phân hủy Insulin đang tuần hoàn trong máu, làm cho hoocmon này phân hủy với thời gian bán rã khoãng 6 phút. Quá trình này bảo đảm mức độ Insulin lưu hành trong máu được điều chỉnh và mức độ glucose máu không giảm xuống thấp đến mức nguy hiểm. 1.2.2.2 Insulin và trao đổi lipit: Insulin có tác động quan trọng lên quá trình trao đổi lipit. Các tác động đó bao gồm: - Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp axit béo trong gan: Khi lượng Glycogen tích tụ trong gan quá cao ( > 5% khối lượng thô của gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế. Khi gan bão hòa Glycogen thì bất kỳ lượng Glucose nào được hấp thụ thêm vào tế bào gan đều phải chuyển sang con đường tổng hợp axit béo, sau đó được vận chuyển ra khỏi gan dưới dạng lipoprotein. Các lipoprotein đi vào vòng tuần hoàn, cung cấp các axit béo tự do cho các mô, như mô mỡ ( tế bào tạo mỡ) để tổng hợp triglyxerit. 8 | 2 3 - Insulin ức chế phân hủy chất béo trong mô mỡ: Bằng cách ức chế quá trình thủy phân triglyxerit thành glyxerol và axit béo tự do. Enzim nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động khi được photphorin hóa. Insulin ngăn cản quá trình này khi nó kết hợp với các thụ thể trên màng tế bào, làm tăng sự tích tụ glyxerit trong các tế bào mỡ. 1.2.2.3 Insulin và các tác động khác: 46 Tổng hợp tự nhiên Insulin trong cơ thể: Insulin được tổng hợp bởi các tế bào tuyến tụy beta. Các tế bào beta sắp xếp thành các bó gọi là các đảo Langerhan trong tụy. insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để đảm bảo sự gấp nếp đúng. 9 | 2 3 Insulin làm tăng tính thấm ion K, Mg và photphat vô cơ - Insulin làm tăng tính hấp thụ các axitamin - Insulin làm tăng tính thấm của tế bào đối với ion Kali, Magie, photphat vô cơ , tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình photphorin hóa và sử dụng glucose H.6 - Tổng hợp Insulin trong cơ thể ANRm tiến hành dịch mã một protein gọi là preproinsulin. Preproinsulin bao gồm một trình tự tín hiệu đầu amin giúp tiền chất hoocmon này đi qua màng lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã. Tại quá trình sau dịch mã, trình tự tín hiệu đầu amin không cần thiết nên preproinsulin bị thủy phân tạo thành proinsulin. Sau khi hình thành 3 cầu nối disunfua một số peptitdase sẽ phân cắt proinsulin tạo insulin hoàn chỉnh và hoạt động. Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết, tích tụ trong tế bào chất cho đến khi được kích hoạt để giải phóng. 1.2.4 Các loại insulin Insulin tác động nhanh (Novorapid R và Humalog R): có màu trong, tác động rất nhanh trong vòng 20 phút đã có hiệu quả, đạt đỉnh điểm khoảng 1 giờ sau đó và kéo dài 3 đến 5 tiếng. Khi dùng các insulin này, quan trọng là phải ăn ngay sau khi tiêm. 10 | 2 3 [...]... khuẩn E.Coli để sản xuất insulin Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các giai đoạn tinh sạch Sản xuất insulin dựa trên công nghệ gene và công nghệ sinh học mang lại rất nhiều lợi ích và tính năng vượt trội hơn so với việc thu nhận từ động vật Insulin được sản xuất trên nhiều... đổi trình tự axitamin của nó và tạo ra chất tương tự Insulin giả ít kết dính với nhau hơn và khuếch tán vào máu dễ dàng hơn Quy trình sản xuất Insulin giả cũng tương tự như quy trình sản xuất insulin trên • phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in... tách hai dòng gen này Mỗi ADN được chèn vào plasmit Sau đó sản xuất tương tự như sản xuất proinsulin Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng 29 | P a g e Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B 3.2.4 Các phương pháp sản xuất khác: • Ngày nay, nấm men cũng... để sản xuất insulin) • Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn • Giá thành cao 3.2 Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin: 3.2.1 Khái quát về công nghệ AND tái tổ hợp: Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất. .. của quá trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá Cuối cùng insulin được tinh thể hoá 28 | P a g e Hình 12: Các tinh thể insulin 3.2.3.2 Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B Phương pháp này sẽ tránh được việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A và B Xác định trình tự ADN để qua đó tổng hợp và tách hai... bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin Nhược điểm của việc sản xuất Insulin dùng trong lâm sàng chủ yếu có nguồn gốc động vật ( bò và lợn) Tụy của động vật này sẽ được dùng để tách chiết insulin , vì thế cần một lượng lớn tụy mới có thể sản xuất một lượng nhỏ insulin Việc insulin được sản xuất trực... thể sản xuất tế bào tụy tạng (island cells) của người có khả năng sản xuất insulin. Thành công trong việc sản xuất island cells giúp điều trị tiểu đường loại 1 của trẻ em Cấy tế bào tụy tạng giúp trẻ em tiểu đường loại 1 có thể sản xuất insulin, không cần chích insulin mỗi ngày Các khoa học gia đã thành công trong việc cấy island cells điều trị tiểu đường từ năm 2000 Nhưng đây là lần đầu tiên có thể sản. .. số Insulin được bán ở dạng hỗn hợp hai loại cùng đóng trong một lọ, làm tăng hiệu quả điều hòa điều trị bệnh Hiện nay công nghệ sinh học đã trở thành phương tiện hữu hiệu và có rất nhiều ứng dụng vô cùng to lớn sản xuất Insulin là một bước nhảy vọt trong việc chữ trị bệnh tiểu đường Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế khi sử dụng công. .. khả năng sản xuất một hợp chất có tên là C-peptide, một chất protein tiền thân của insulin và chỉ hiện diện khi tế bào sản xuất ra insulin Do đó, sự hiện diện C-pep chứng minh rằng ít nhất đã có một lượng insulin nhất định được sản xuất bởi tế bào gốc được dùng thay thế cho tế bào tụy tạng đã hư hại hoặc bị phá hủy” 32 | P a g e Theo ông, “điều kiện tiên quyết của chúng tôi trong việc sản xuất insulin. .. tổn thương thần kinh thực vật và nhiễm trùng 3 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: 3.1 Quy trình sản xuất Insulin trước đây: 3.1.1 Đặc điểm quy trình: Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G Bantingvà Charles H Best )phát hiện ra insulin và vai trò của chúng từ thí nghiệm về những chú chó, từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách . tụy để sản xuất insulin) • Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn • Giá thành cao. 3.2 . Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin: 3.2.1. Khái quát về công nghệ AND. vật và nhiễm trùng. 6 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN: 3.1. Quy trình sản xuất Insulin trước đây: 3.1.1. Đặc điểm quy trình: Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G. Bantingvà. thể sản xuất với qui mô rộng lớn, giá thành cao. 3.1.2. Nhược điểm quy trình sản xuất Insulin chiết xuất từ động vật: • Insulin động vật (bò và lợn) có cấu trúc không hoàn toàn giống cấu trúc Insulin