tạo một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh.
Bướ c 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11.
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người. Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein. Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó.
Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người
Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn. Nối bằng ADN ligase của phageT4. Trong thành phần của vector biểu hiện phải có các promoter mạnh giúp gen biểu hiện được trong vi khuẩn.
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất.
Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
- Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một promoter mạnh. Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.
Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện.
Tách và biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli
Sau quá trình biến nạp, cần chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn. Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình và gen đánh dấu trên vector được sử dụng. Thông thường là sử dụng laoij gan kháng sinh Ampixilin hoặc Tetraxilin để chọn lọc. Sau đó kiểm tra dòng chọn lọc theo nhiều cách khác nhau bằng cách giải đoạn trình tự nucleotic của đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp và so sánh với trình tự gốc.
Qúa trình lên men
Bước 6: Hoạt hoá.
27 | P a g e
Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào nồi lên men. Nuôi chúng trong các nồi lên men với các điều kiện tối ưu. Sử dụng các phương pháp nuôi cấy liên tục, theo đó các chất dinh dưỡng liên tục được bổ sung để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm mũ. Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ được nhân lên qua nguyên phân. Như vậy, chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối sẽ tăng lên rất nhanh và gen insulin sẽ được tổng
Bước 5: Tiền tinh sạch
Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng nhiệt.
Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin nhưng không có khả năng hoạt hoá insulin.
Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin. Khi đó sản phẩm thu được mới có hoạt tính cần thiết.
Bước 7:Hỗn hợp tinh sạch chỉ còn có insulin.
Bằng phương pháp sắc ký, tách và phương pháp miễn dịch gắn enzym.
Độ tinh sạch của insulin được đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian của quá trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá. Cuối cùng insulin được tinh thể hoá.
Hình 12: Các tinh thể insulin