Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất mẫu nước tiểu giả định bằng phương pháp đông khô ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm chất lượng vi sinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - VŨ MINH HỮU NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT MẪU NƯỚC TIỂU GIẢ ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - VŨ MINH HỮU NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT MẪU NƯỚC TIỂU GIẢ ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM CHẤT LƯỢNG VI SINH Chuyên ngành: Kỹ thuật Xét nghiệm Y học Mã số : 8720601 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật Xét nghiệm Y học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1: PGS.TS.BS TRẦN DIỆP TUẤN NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS.BS HUỲNH MINH TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2020 .1 LỜI CAM ĐOAN ***** Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Vũ Minh Hữu i MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CÂU HỎI NGHIÊN CỨU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương nước tiểu 1.2 Bệnh nhiễm khuẩn đường tiết niệu 1.3 Vi khuẩn E coli E faecalis 10 1.4 Quy trình xét nghiệm cấy nước tiếu 12 1.5 Đông khô 16 1.6 Quản lý chất lượng xét nghiệm 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Thiết kế nghiên cứu 26 2.2 Địa điểm nghiên cứu 26 2.3 Thời gian nghiên cứu 26 2.4 Cỡ mẫu 26 2.5 Tiêu chí chọn mẫu vào thực nghiệm 26 2.6 Đối tượng nghiên cứu 27 2.7 An toàn nghiên cứu 27 2.8 Xử lý số liệu 28 2.9 Vật liệu điều kiện sở vật chất 28 ii 2.10 Nội dung 32 2.11 Kỹ thuật vi sinh nghiên cứu 45 2.12 Vấn đề y đức nghiên cứu 47 2.13 Kiểm soát sai lệch 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 49 3.1 Kết nội dung 1: Thử nghiệm tính bảo vệ vi khuẩn chất phụ gia: skim milk, sucrose, glucose, lactose môi trường nước tiểu giả định phương pháp đông khô 49 3.2 Kết nội dung 2: Nghiên cứu chất phụ gia: skim milk, glucose, mannitol, NaCl giúp tế bào vi khuẩn hồi phục từ tình trạng đơng khơ tình trạng tăng trưởng 55 3.3 Kết nội dung 3: Xây dựng qui trình sản xuất thử nghiệm mẫu nước tiểu giả định phương pháp đơng khơ ứng dụng chương trình ngoại kiểm chất lượng vi sinh 59 3.4 Kết nội dung 4: Đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu 66 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 86 4.1 Thử nghiệm tính bảo vệ vi khuẩn chất phụ gia: skim milk, sucrose, glucose, lactose môi trường nước tiểu giả định phương pháp đông khô 86 4.2 Nghiên cứu chất phụ gia: skim milk, glucose, mannitol, NaCl giúp tế bào vi khuẩn hồi phục từ tình trạng đơng khơ tình trạng tăng trưởng 92 iii 4.3 Xây dựng qui trình sản xuất thử nghiệm mẫu nước tiểu giả định phương pháp đông khô ứng dụng chương trình ngoại kiểm chất lượng vi sinh 96 4.4 Đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu 99 KẾT LUẬN 102 KIẾN NGHỊ 104 iv DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ATCC Americal Type Culture Chủng vi khuẩn tiêu Collection chuẩn Hoa kỳ BA Blood Agar Thạch máu CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc Chất lượng xét nghiệm CLXN External Quality Assessment Chương trình ngoại schemes kiểm tra chất lượng IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượng ISO International Standard Tổ chức tiêu chuẩn quốc Organization tế Mac Conkey agar Thạch Mac Conkey EQAs MC NKĐTN Nhiễm khuẩn đường tiết niệu PXN Phòng xét nghiệm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TTKCCLXNYH- Trung tâm Kiểm chuẩn DHYD Chất lượng Xét nghiệm Y học -Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh SOP Standard Operating Procedure Quy trình thao tác chuẩn WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới .v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Phương pháp cấy định lượng 14 Hình 2.1: Sinh phẩm dụng cụ 29 Hình 2.2: Trang thiết bị sở vật chất 31 Hình 2.3: Pha mơi trường giả định xác định nồng độ vi khuẩn 33 Hình 2.4: Phương pháp đếm sống vi khuẩn 46 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1: Mật độ vi khuẩn E coli (CFU/mL) biểu thị log E coli nhóm (S) nhóm (C) 50 Biểu đồ 2: Mật độ vi khuẩn E faecalis (CFU/mL) biểu thị log E faecalis nhóm (S) nhóm (C) 53 Biểu đồ 3: Mật độ vi khuẩn E coli (CFU/mL) biểu thị log E coli nhóm (S) nhóm (C) 56 Biểu đồ 4: Theo dõi độ ổn định lô L.A1 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 69 Biểu đồ 5: Theo dõi độ ổn định lô L.A2 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 72 Biểu đồ 3.6: Theo dõi độ ổn định lô L.A3 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 75 Biểu đồ 3.7: Theo dõi độ ổn định lô L.B1 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 78 Biểu đồ 3.8: Theo dõi độ ổn định lô L.B2 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 81 Biểu đồ 3.9: Theo dõi độ ổn định lô L.B3 qua biểu đồ kiểm soát chất lượng 84 Biểu đồ 3.10: Độ ổn định lô 85 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xi 1,19 x 106 Lọ 20 Mật độ vi 1,24 x 106 khuẩn TB 1,22 x 106 1,19 x 106 5,50 x 105 5,19 x 105 2,17 x 105 2,12 x 105 5,10 x 103 4,92 x 103 Bảng mật độ vi khuẩn E faecalis (CFU/mL) nhóm (S) nhóm (C) nội dung Trước đông khô Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ Lọ 10 Lọ 11 Lọ 12 Lọ 13 Lọ 14 Lọ 15 Lọ 16 Ống S1 Ống S2 ( Ống S3 ( Ống S4 ( ( Skim Sucrose Glucose Lactose milk 10%) %) 5%) 5%) Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) 1,64 x 107 Mật độ vi khuẩn (log) =7,21 1,56 x 10 1,59 x 106 7,10 x 105 3,90 x 105 1,54 x 106 1,55 x 106 7,90 x 105 4,60 x 105 1,66 x 106 1,35 x 106 7,30 x 105 4,20 x 105 1,48 x 106 1,43 x 106 7,00 x 105 4,40 x 105 1,62 x 106 1,41 x 106 7,80 x 105 4,20 x 105 5,00 x 103 5,10 x 103 5,00 x 103 5,60 x 103 5,90 x 103 1,54 x 106 1,43 x 106 1,46 x 106 1,50 x 106 1,53 x 106 1,55 x 106 1,50 x 106 1,52 x 106 1,48 x 106 1,47 x 106 1,49 x 106 5,50 x 103 5,80 x 103 5,30 x 103 4,90 x 103 5,10 x 103 5,70 x 103 5,00 x 103 4,80 x 103 4,90 x 103 5,60 x 103 5,40 x 103 1,39 x 106 1,45 x 106 1,38 x 106 1,55 x 106 1,45 x 106 1,47 x 106 1,41 x 106 1,40 x 106 1,39 x 106 1,44 x 106 1,37 x 106 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 8,10 x 105 7,70 x 105 8,80 x 105 7,40 x 105 7,00 x 105 7,20 x 105 7,90 x 105 8,20 x 105 7,10 x 105 7,80 x 105 7,30 x 105 3,90 x 105 4,60 x 105 4,30 x 105 4,10 x 105 4,20 x 105 4,00 x 105 4,20 x 105 4,40 x 105 3,90 x 105 3,80 x 105 3,90 x 105 Ống C Mật độ vi khuẩn (CFU/mL) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xii Lọ 17 Lọ 18 Lọ 19 Lọ 20 Mật độ vi khuẩn TB 1,43 x 106 1,49 x 106 1,52 x 106 1,44 x 106 1,51 x 106 1,40 x 106 1,42 x 106 1,41 x 106 1,38 x 106 1,46 x 106 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 8,40 x 105 8,10 x 105 7,30 x 105 7,70 x 105 7,62 x 105 4,00 x 105 4,20 x 105 4,10 x 105 4,00 x 105 4,15 x 105 5,20 x 103 5,80 x 103 5,00 x 103 5,10 x 103 5,29 x 103 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xiii PHỤ LỤC Bảng mật độ vi khuẩn E coli (CFU/mL) nhóm (S) nhóm (C) nội dung Ống S1 Ống S2 Ống S3 Ống S4 Ống C (Skim (Glucose (Mannitol (NaCl ( Nước milk 10%) 5%) 5%) 0,9%) cất) Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) Trước 1,75 x 107 đông khô Mật độ vi khuẩn (log) = 7,24 Lọ 9,00 x 106 2,01 x 106 2,20 x 106 1,92 x 106 1,41 x 106 Lọ 8,80 x 106 2,06 x 106 2,15 x 106 1,89 x 106 1,33 x 106 Lọ 8,90 x 106 2,08 x 106 2,10 x 106 1,93 x 106 1,42 x 106 Lọ 9,20 x 106 2,06 x 106 2,14 x 106 1,98 x 106 1,47 x 106 Lọ 8,80 x 106 1,99 x 106 2,19 x 106 1,95 x 106 1,31 x 106 Lọ 9,30 x 106 1,94 x 106 2,01 x 106 1,94 x 106 1,40 x 106 Lọ 9,10 x 106 2,05 x 106 2,06 x 106 1,90 x 106 1,44 x 106 Lọ 9,20 x 106 2,02 x 106 2,09 x 106 1,97 x 106 1,38 x 106 Lọ 9,30 x 106 2,05 x 106 2,10 x 106 1,90 x 106 1,30 x 106 Lọ 10 9,00 x 106 2,01 x 106 2,15 x 106 1,99 x 106 1,40 x 106 Lọ 11 8,90 x 106 2,00 x 106 2,18 x 106 1,97 x 106 1,34 x 106 Lọ 12 8,80 x 106 2,04 x 106 2,19 x 106 1,92 x 106 1,33 x 106 Lọ 13 8,70 x 106 1,98 x 106 2,11 x 106 2,01 x 106 1,40 x 106 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xiv Lọ 14 8,60 x 106 2,09 x 106 2,16 x 106 2,03 x 106 1,44 x 106 Lọ 15 8,80 x 106 2,10 x 106 2,22 x 106 1,99 x 106 1,42 x 106 Lọ 16 8,90 x 106 2,03 x 106 2,20 x 106 1,90 x 106 1,46 x 106 Lọ 17 9,00 x 106 2,06 x 106 2,15 x 106 1,94 x 106 1,35 x 106 Lọ 18 8,60 x 106 2,04 x 106 2,18 x 106 1,98 x 106 1,30 x 106 Lọ 19 8,80 x 106 2,08 x 106 2,12 x 106 1,95 x 106 1,36 x 106 Lọ 20 9,10 x 106 2,06 x 106 2,14 x 106 1,93 x 106 1,32 x 106 Mật độ vi 8,94 x 106 2,04 x 106 2,14 x 106 1,95 x 106 1,38 x 106 khuẩn TB Bảng mật độ vi khuẩn E faecalis (CFU/mL) nhóm (S) nhóm (C) nội dung Ống S1 Ống S2 Ống S3 Ống S4 Ống C (Skim (Glucose (Mannitol (NaCl ( Nước milk 10%) 5%) 5%) 0,9%) cất) Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi Mật độ vi khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn khuẩn (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) Trước 1,35 x 107 đông khô Mật độ vi khuẩn (log) = 7,19 Lọ 9,80 x 106 2,14 x 106 2,99 x 106 1,94 x 106 1,94 x 106 Lọ 9,70 x 106 2,19 x 106 3,00 x 106 2,05 x 106 1,90 x 106 Lọ 9,80 x 106 2,01 x 106 2,91 x 106 2,02 x 106 1,97 x 106 Lọ 9,90 x 106 2,06 x 106 2,89 x 106 2,05 x 106 1,90 x 106 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xv Lọ 9,80 x 106 2,09 x 106 2,96 x 106 2,01 x 106 1,99 x 106 Lọ 1,00 x 107 2,10 x 106 2,98 x 106 2,00 x 106 1,97 x 106 Lọ 9,70 x 106 2,15 x 106 2,94 x 106 2,04 x 106 1,92 x 106 Lọ 1,01 x 107 2,18 x 106 2,99 x 106 1,98 x 106 2,01 x 106 Lọ 9,70 x 106 2,19 x 106 2,90 x 106 2,09 x 106 2,03 x 106 Lọ 10 9,90 x 106 2,11 x 106 2,95 x 106 2,10 x 106 1,99 x 106 Lọ 11 9,20 x 106 2,18 x 106 2,97 x 106 2,01 x 106 1,99 x 106 Lọ 12 9,60 x 106 2,19 x 106 2,92 x 106 2,06 x 106 1,97 x 106 Lọ 13 9,00 x 106 2,11 x 106 3,00 x 106 2,08 x 106 1,92 x 106 Lọ 14 9,50 x 106 2,16 x 106 2,86 x 106 2,06 x 106 2,01 x 106 Lọ 15 1,02 x 107 2,22 x 106 2,94 x 106 1,99 x 106 2,03 x 106 Lọ 16 1,00 x 107 2,20 x 106 2,98 x 106 1,94 x 106 1,99 x 106 Lọ 17 9,80 x 106 2,15 x 106 2,99 x 106 2,05 x 106 1,90 x 106 Lọ 18 9,30 x 106 2,18 x 106 3,00 x 106 2,02 x 106 1,94 x 106 Lọ 19 9,40 x 106 2,12 x 106 2,88 x 106 2,05 x 106 1,98 x 106 Lọ 20 9,90 x 106 2,14 x 106 3,00 x 106 2,01 x 106 1,99 x 106 Mật độ vi 9,72 x 106 2,14 x 106 2,95 x 106 2,03 x 106 1,97 x 106 khuẩn TB Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xvi PHỤ LỤC Chỉ tiêu kiểm tra tính chất sinh hóa vi khuẩn Chỉ tiêu kiểm tra sinh hóa vi khuẩn E coli ATCC 25922 *: Kit định danh vi khuẩn API 20E (BioMerieux) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xvii Chỉ tiêu kiểm tra sinh hóa vi khuẩn E faecalis ATCC 29212 *: Kit định danh vi khuẩn API Strep (BioMerieux) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xviii PHỤ LỤC Bảng kết xác định thể tích hồn ngun Lọ Khối lượng mẫu trước đơng khô (m1)(g) Khối lượng mẫu sau đông khô (m2)(g) 10 Trung bình SD CV% 5,99 6,02 6,00 6,14 5,94 6,08 6,12 5,95 5,90 6,06 6,02 0,08 1,33 5,22 5,02 4,98 4,92 5,12 5,20 5,16 4,96 5,01 5,11 5,07 0,11 2,17 Bảng khảo sát độ ẩm Lọ Khối lượng lọ (g) 4,030 4,039 4,025 4,032 4,038 4,031 4,028 4,036 4,033 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Khối lượng mẫu trước sấy (m1)(g) 5,149 5,048 4,974 4,996 5,110 5,130 5,060 4,970 5,050 Khối lượng mẫu sau sấy (m2)(g) 5,104 5,018 4,946 4,970 5,094 5,100 5,036 4,955 5,022 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xix 10 TB 4,027 4,032 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 5,105 5,059 5,071 5,032 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xx PHỤ LỤC Mẫu chạy thử nghiệm EM01 A Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xxi Mẫu chạy thử nghiệm EM01 B Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xxii Mẫu chạy thử nghiệm EM01 C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xxiii Mẫu chạy thử nghiệm EM02 A Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xxiv Mẫu chạy thử nghiệm EM02 B Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.xxv Mẫu chạy thử nghiệm EM02 C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn