Microsoft Word bia mau doc ®¹i häc quèc gia hµ néi tr−êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ®éc lËp cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu quy tr×nh chiÕt t¸ch ent kauran ditecpenoit cã t¸c dông chèn[.]
đại học quốc gia hà nội trờng đại học khoa học tự nhiên Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nớc Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung th chống viêm từ khổ sâm bắc Mà số ĐTĐL-2005/05 Chủ nhiệm đề tài: gs, tskh phan tống sơn 6761 24/3/2008 hà nội - 2007 Lời mở đầu Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) mọc hoang đợc trồng khắp nơi tỉnh phía Bắc nớc ta Cây dễ trồng sau thời gian ngắn đà thu hái lấy nguyên liệu Cây khổ sâm Bắc Bộ đợc dùng phổ biến y học dân gian Việt Nam Lá khổ sâm Bắc Bộ dùng chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, đau bụng, tiêu hóa kém, lỵ, viêm loét dày - tá tràng Kết công trình nghiên cứu gần đà phát có mặt nhiều ent-kauran ditecpenoit khổ sâm Bắc Bộ, số có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đáng quan tâm, nh hoạt tính độc hại tế bào ung th, tác dụng ức chế hoạt hóa nhân tố phiên mà NF-B, tác dơng øc chÕ enzym nitric oxide synthase (iNOS) Ho¹t chÊt entkauran ditecpenoit chủ yếu khổ sâm Bắc Bộ ent-7-hydroxy-15oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) Đề tài nghiên cứu Khoa học Phát triển Công nghệ độc lập cấp Nhà nớc Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung th chống viêm từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), Mà số: ĐTĐL-2005/05, có mục tiêu: - Xây dựng quy trình chiÕt t¸ch ent-kauran ditecpenoit cã t¸c dơng chèng ung th− chống viêm từ khổ sâm Bắc Bộ; - Thử độ an toàn hoạt chất chiết tách đợc; - Chứng minh tác dụng chống ung th chống viêm thực nghiệm hoạt chất chiết tách đợc Các nội dung nghiên cứu đợc xác định cho Đề tài ĐTĐL-2005/05 là: Xây dựng quy trình ổn định chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung th chống viêm quy mô Phòng thí nghiệm; Phân lập hoạt chất Chế phẩm CT-2005 giàu hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung th dùng làm chuẩn đối chứng kiểm nghiệm; Thử độ an toàn Chế phẩm CT-2005; Khảo sát hoạt tính kháng u trực tiếp Chế phẩm CT-2005 số dòng tế bào ung th ngời nuôi cấy in vitro; Nghiên cứu tác dụng Chế phẩm CT-2005 đến hạn chế phát triển ung th sarcoma 180 động vật thực nghiệm; Nghiên cứu tác dụng chống viêm Chế phẩm CT-2005 súc vật thực nghiệm Chơng TổNG QUAN 1.1 Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật liệu pháp chống bệnh ung th chống viêm Theo thống kê, bệnh ung th nguyên nhân thứ hai gây tử vong nớc phát triển Mỹ năm có khoảng 500.000 ngời chết ung th [1] nớc phát triển bệnh ung th trở thành phổ biến Theo đánh giá Diễn đàn Y tế châu đợc tổ chức Singapore trung tuần tháng năm 2007 châu lục bệnh ung th tăng vọt năm gần đây; riêng năm 2002, 3,5 triệu ca ung th đà đợc phát nớc châu [2] Theo ớc tính Cơ quan nghiên cứu ung th quốc tế Việt Nam năm 1990 có 52.700 ca ung th− míi vµ 37.000 ng−êi chÕt bệnh [3] Đà có nhiều tiến việc chẩn đoán sớm điều trị ung th Vào đầu kỷ hai mơi, bệnh nhân ung th sống sót đợc Vào năm 1930 dới năm bệnh nhân ung th sống năm năm sau chẩn đoán bệnh Vào năm 1940, số đà đạt bốn, vào năm 1960 ba, vào khoảng 1990 gần 50% [1] Mặc dầu đà có nhiều liệu pháp đợc phát triển, phẫu thuật, xạ liệu pháp (xạ trị) hóa liệu pháp đợc dùng riêng biệt phối hợp phơng pháp điều trị ung th có hiệu [1] Các bệnh viêm tự miễn, bao gồm viêm khớp dạng thấp, bệnh viêm ruột, đa xơ cứng, bệnh vảy nến suyễn, đặt cho nhà nghiên cứu phát triển thuốc chữa bệnh thách thức to lớn Những bệnh đợc điều trị thuốc chống viêm non-steroid (NSAIDs), corticosteroit methotrexat, thuốc có tác dụng hạn chế và/hoặc không đủ an toàn [4] Một chạy đua diễn nhằm tạo hệ thuốc chống viêm có hiệu cao, an toàn đem lại nhiều lợi nhuận, bổ sung thay liệu pháp đợc áp dụng Các hợp chất thiên nhiên có vai trò việc phát phát triển dợc phẩm [5-11] Giá trị nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh häc kh«ng chØ ë c«ng dơng trùc tiÕp cđa chóng làm thuốc chữa bệnh, mà chúng dùng làm nguyên mẫu cấu trúc dẫn đờng cho phát phát triển dợc phẩm Thực vật bậc cao trọng tâm đặc biệt quan trọng nghiên cứu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đa dạng sinh học - đa dạng hoá học - chúng Cũng nh lĩnh vùc thc chèng HIV, nhiỊu thc chèng bƯnh ung th− đợc sử dụng liệu pháp hóa học đợc thu nhận cách trực tiếp từ sản phẩm thiên nhiên chất đợc tổng hợp dựa mẫu hợp chất thiên nhiên [1, 7, 8, 12-19] Các tác nhân chống ung th bắt nguån tõ thiªn nhiªn (thùc vËt, vi sinh vËt, sinh vật biển) cho ta hội to lớn để đánh giá lớp hợp chất hóa học chống ung th hoàn toàn mới, mà lại chế tác dụng Nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật đợc sử dụng có hiệu điều trị ung th Một thí dụ đáng kể nhóm Vinca ancaloit đợc phân lập từ dừa cạn (Catharanthus roseus) Trong số bốn ancaloit dừa cạn thể hoạt tính chống bệnh bạch cầu chuột có vincristin vinblastin đợc sử dụng để điều trị ung th ngời Các hợp chất đà chứng tỏ có hiệu điều trị bệnh bạch cầu, u bạch huyết, số carcinoma Các Vinca ancaloit phá vỡ cân tubulin/microtubule, liên kết với Vinca ancaloit mà dime tubulin tập hợp để tạo OH thành microtubule N N H N H H3COOC H3CO OCOCH3 N R HO COOCH3 Vincristin: R = CHO Vinblastin: R = CH3 Mét thÝ dô khác tác nhân có hoạt tính cao có nguồn gốc thực vật etoposide (VP-16), chất đà đa lại tỷ lệ chữa khỏi cao điều trị ung th tinh hoàn dùng phối hợp với bleomycin (cũng sản phẩm thiên nhiên) cisplatin; etoposide có hoạt tính đáng kể chống lại carcinoma phổi tế bào nhỏ Etoposide dẫn xuất bán tổng hợp podophyllotoxin, chất ức chế gián phân liên kết thuận nghịch với tubulin ức chế việc lắp ráp microtubule Podophyllotoxin thành phần Podophyllum pelatum, P emodi, vµ P pleianthum Etoposide øc chÕ enzym hÕt søc quan träng DNA topoisomerase II vµ, sau đó, làm tăng phân cắt DNA H H 3C OH O O HO O O HO O O O O O O O H3CO OCH3 OCH3 Podophyllotoxin O H3CO OCH3 OH Etoposide (VP-16) Chất ancaloit tự nhiên camptothecin đợc phân lập từ Camptotheca acuminata Trung Quốc hợp chất khác đà đợc liên tục biến cải cấu trúc nhằm phát triển tác nhân hữu ích cho liệu pháp hóa học Camptothecin đợc dùng điều trị bệnh ung th dày, trực tràng, ruột kết, bàng quang, nhiên khó kiếm đợc từ thiên nhiên tan nớc Các chất thiên nhiên camptothecin 10-hydroxy-camptothecin nh dẫn xuất tổng hợp camptothecin (9-aminocamptothecin, topotecan, irinotecan (CPT-11)) tác nhân chống khối u mạnh ức chế DNA topoisomerase I Các hợp chất topotecan irinotecan muối amin-hydroclorua; topotecan tan nớc nhiều gấp 100 lần so với camptothecin đợc dùng để chữa ung th buồng trứng tái phát; irinotecan chuyển hóa thành chất phenolic có tác dụng ức chế topoisomerase I in vivo mạnh hơn, chí gấp 200-1.000 lần Irinotecan cịng thĨ hiƯn ho¹t tÝnh chèng khèi u m¹nh ®èi víi ung th− bng trøng C¶ topotecan lÉn irinotecan có tác dụng mạnh chống ung th ruột kết-thẳng R2 R1 O N N O HO O Camptothecin: R1 = R2 = H 10-Hydroxycamptothecin: R1 = OH; R2 = H 9-Aminocamptothecin: R1 = H; R2 = NH2 HCl CH2N(CH3)2HCl HO N O N N N O O O N N O O HO HO O Topotecan O Irinotecan Các taxoit taxolđ (paclitaxel), lúc đầu đợc phân lập từ vỏ thông đỏ Tây Thái bình dơng (Taxus brevifolia), taxoteređ (docetaxel), chất tơng tự đợc bán tổng hợp từ 10-deacetyl-baccatin III nhận đợc từ Taxus baccata thể hoạt tính mạnh lâm sàng ®èi víi ung th− vó vµ ung th− bng trøng Paclitaxel có phơng thức tác dụng độc đáo, ức chế gián phân cách đẩy mạnh lắp ráp microtubule Nh Vinca ancaloit taxoit đợc coi nh thuốc tác dụng đích, tức máy gián phân, nhng có chế tác dụng khác bổ sung nhau: Vinca ancaloit ức chế polyme hóa tubulin thành microtubule, taxoit ức chế phản ứng ngợc lại, depolyme hóa microtubule thành tubulin hòa tan Hai họ thuốc chống gián phân có tính chất lâm sàng có giá trị khác R1O O R2 O H O OH CH3 CH3 CH3 OH HO H H OCOC6H5 O OCOCH3 Taxol: R1 = COCH3, R2 = HNCOC6H5 Taxotere: R1 = H, R2 = HNCOOC(CH3)3 H3COCO O H3C CH3 CH3 OH HO CH3 HO H H OCOC6H5 O OCOCH3 10-Deacetyl-baccatin III Flavopiridol tác nhân bắt nguồn từ thực vật lý thú bớc phát triển, chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin vào nghiên cứu lâm sàng Flavopiridol flavon tổng hợp có nguån gèc tõ chÊt ancaloit thùc vËt rohitukine, ancaloit nµy đợc phân lập từ thân Amoora rohituka sau từ Dysoxylum binectariferum Cơ chế tác dụng flavopiridol bao hàm việc cản trở photphoryl hóa kinase phụ thuộc cyclin, ngăn trở hoạt hóa chúng ngăn cản tiến triển chu trình tế bào giai đoạn khối u (G1) (G2) Các thử lâm sàng giai đoạn I đà đạt đợc tỷ lệ đáp ứng đáng khích lệ nhiều loại u ác tính rắn u huyết ác tính Các kết đà dẫn đến bắt đầu thử lâm sàng giai đoạn II với bệnh nhân mắc bệnh carcinoma ruột kết- thẳng, tuyến tiền liệt, tế bào thận phổi tế bào không nhỏ, nh u lymphô không Hodgkin bệnh bạch cầu lymphô m¹n tÝnh OH O O HO O C HO O CH3 OH CH3 Rohitukine (absolute configuration) O O S C CH3 N CH3 O CH3 HO CH3 O S R H N O Homoharringtonine Một số tác nhân có nguồn gốc thực vật khác đợc nghiên cứu Thí dụ, homoharringtonine, ancaloit đợc phân lập từ Cephalotaxus harringtonia cđa Trung Qc, thĨ hiƯn tÝnh hiƯu qu¶ chống nhiều bệnh bạch cầu khác Cơ chế tác dơng chđ u cđa homoharringtonine lµ øc chÕ sù tỉng hợp protein, ngăn cản tiến triển chu trình tế bào 4-Ipomeanol dẫn xuất furan độc phổi đợc phân lập từ củ khoai lang (Ipomoeca batatas) bị nấm Fusarium solani Ceratocystis fimbriata làm h hại đợc đánh giá lâm sàng tác dụng chống ung th đặc hiệu bệnh ung th phổi Hợp chất chuyển hóa thành sản phẩm chuyển hóa liên kết với DNA nhờ hoạt hóa chuyển hóa enzym cytochrome P450 có mặt tế bào phổi -Lapachone ((từ gỗ lõi tếch, Tectona grandis) chất ức chế DNA topoisomerase I g©y sù chËm trƠ cđa chu trình tế bào giai đoạn G1 S (tổng hợp) trớc gây chết tế bào chơng trình hóa hoại tử nhiều loại tế bào carcinoma ngời, bao gồm buồng trứng, ruột kết, phổi, tuyến tiền liệt vú Một tác nhân đợc thử lâm sàng combretastatin A4 phosphate (CA4-P) Combretastatin A4 hợp chất thiên nhiên đợc phân soya broth, nấm môi trờng Sabauraud dextrose broth Các chủng kiểm định đựơc hoạt hãa tr−íc thư nghiƯm m«i tr−êng dinh d−ìng dịch thể (24 vi khuẩn, 48 ®èi víi vi nÊm) Sau ®ã ®−ỵc pha lo·ng tíi nồng độ 0,5 đơn vị Mc Land (khoảng 108 vi sinh vật/ml) để tiến hành thí nghiệm - Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử đợc hòa tan dung dịch DMSO 100% máy Vortex với nồng độ mg/ml Tõ dung dÞch gèc nhá sang phiÕn vi lợng 96 giếng, giếng 10 àl mẫu Nhỏ vào giếng đà có mẫu sẵn 190 àl vi sinh vật đà hoạt hóa - Đối chứng dơng: DÃy 1: môi trờng DÃy 2: Vi sinh vật kiểm định + kháng sinh - Đối chứng âm: có vi sinh vật kiểm định - Để tủ ấm 37oC/24 giê cho vi khuÈn; 30oC/48 giê cho vi nÊm - Đọc kết quả: nhìn mắt thờng thấy chứng dơng suốt, vi sinh vật phát triển giống nh hình ảnh giếng âm 5.1.4 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu đợc xử lý phơng pháp thống kê y sinh học theo thuật toán t-test Student test trớc-sau khác biệt có ý nghÜa thèng kª p < 0,05 5.2 KÕt nghiên cứu 5.2.1 Tác dụng giảm đau 5.2.1.1 Phơng pháp mâm nóng (hot plate) 171 Bảng 5.1: Thời gian chuột phản ứng với nhiệt độ (giây) Lô thử N 10 10 10 10 10 10 * p< 0,05 Thêi gian ph¶n øng tr−íc uống thuốc Thuốc dùng liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Morphin 7,5 mg/ kg ChÕ phÈm CT 12 mg/ kg ChÕ phÈm CT 24 mg/ kg Hỵp chÊt 12 mg/ kg Hỵp chÊt 24 mg/ kg ** p< 0,01 Thêi gian ph¶n øng sau giê uèng thuèc Thêi gian ph¶n øng sau giê uèng thuèc 13,06 ± 0,63 12,82 ± 1,14 13,63 ± 0,98 11,70 ± 0,87 21,06 ± 1,15*** 15,32 ± 1,54 < 0,05 11,47 ± 0,86 13,82 ± 0,96 15,68 ± 0,91** > 0,05 12,74 ± 1,26 15,35 ± 0,63 18,93± 0,97*** > 0,05 12,08 ± 0,55 13,93 ± 1,21 17,63 ± 1,37** < 0,05 12,44 ± 0,95 14,97 ± 0,59 18,75 ± 1,02*** < 0,05 p so víi morphin *** p< 0,001 so víi nhãm chøng ë cïng thêi ®iĨm Kết nghiên cứu Bảng 5.1 cho thấy Chế phẩm CT hợp chất với liều 12- 24 mg/kg đà làm cho chuột giảm phản ứng với nhiệt độ, kéo dài thời gian phản ứng chuột rõ rƯt so víi tr−íc ng thc vµ so víi chøng Tác dụng rõ rệt thứ sau chuột uống thuốc 5.2.1.2 Phơng pháp gây quặn ®au b»ng axit axetic B¶ng 5.2: ¶nh h−ëng cđa thc nghiên cứu lên phản ứng đau axit axetic Lô Thc thư Vµ liỊu dùng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Aspirin 0,05 g/ kg ChÕ phÈm CT 12 mg/ kg ChÕ phÈm CT 24 mg/ kg Hỵp chÊt 12 mg/ kg Hỵp chÊt 24 mg/ kg * p, 0,05 n Sè quặn đau trung bình khoảng thời gian 0-5 >5-10 >10-15phót >15-20phót >20-25phót 10 4,6 ± 0,5 19,6 ± 1,6 15,7 ± 1,1 11,3 ± 0,6 7,1 ± 1,2 10 3,7 ± 0,5 14,7 ± 2,5* 11,2 ± 0,9* 7,7 ± 1,1** 4,2 ± 0,4 10 4,0 ± 0,7 11,1 ± 1,3*** 9,1 ± 1,2** 6,4 ± 0,8*** 3,6 ± 0,5* 10 4,0 ± 0,8 11,8 ± 1,3*** 8,6 ± 0,9*** 6,2 ± 0,8*** 2,5± 0,4** 10 4,0 ± 0,7 11,1 ± 1,3*** 6,5 ± 0,7* 5,7 ± 0,7* 3,6± 0,5** 10 3,3 ± 0,5 14,5 ± 1,2*** 6,5 ± 1,0* 6,3 ± 0,6* 3,8 ± 0,6** ** p< 0,01 *** p< 0,001 so với nhóm chứng thời điểm Kết nghiên cứu cho thấy Chế phẩm CT hợp chất có tác dụng giảm đau quặn bụng chuột nhắt từ phút thứ sau gây đau 172 axit axetic, tác dụng rõ rệt phút thứ đến 20 Chế phẩm CT hợp chất liều 12 mg/kg có tác dụng giảm đau tơng tự aspirin 0,05g/kg 5.2.2 Tác dụng chống viêm 5.2.2.1 Tác dụng chống viêm cấp * Gây phù viêm lòng bàn chân chuột cống trắng carrageenin Bảng 5.3: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất lên phản ứng viêm cấp chuột cống trắng Thuốc thử liều dùng Lô Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg * p< 0,05 % tăng thể tích chân chuột n Sau giê Sau giê Sau giê Sau giê Sau 24 giê 10 45,8 ± 6,2 58,9 ± 7,6 55,8 ± 7,1 51,5 ± 5,6 10,3 ± 5,6 10 13,3 ± 4,6** 35,4 ± 7,5** 38,9 ± 4,3** 35,3 ± 4,7** -0,6 ± 1,8** 10 14,1 ± 2,7** 44,1 ± 5,6** 36,4 ± 4,2*** 26,7 ± 4,6*** -3,5 ± 2,6** 10 29,9 ± 11,0 46,7 ± 10,8 36,7 ± 9,3** 28,4 ± 7,8** -2,8 ± 7,2*** 10 32,5 ± 7,3 50,1 ± 4,4 39,3 ± 6,8* 37,9 ± 6,8 4,3 ± 4,7 10 34,6 ± 8,0 * 54,7 ± 7,6 * 39,6 ± 8,8** 33,2 ± 9,3*** -1,9 ± 2,1*** 10 19,9 ± 6,3** 29,5 ± 5,6*** ** p< 0,01 25,2 ± 7,4*** 15,1 ± 7,2*** -13,2 ± 2,7*** *** p< 0,001 so víi nhãm chøng ë thời điểm Qua nghiên cứu thấy hợp chất có tác dụng làm giảm phù viêm thực nghiệm chân chuột rõ rệt Tác dụng chống viêm hợp chất liều 14 mg/kg tơng đơng với Indomethacin 2,5 mg/kg prednisolon mg/kg, nhiên tác dụng ức chế viêm hợp chất mạnh thời điểm giờ, Indomethacin prednisolon thời điểm sau gây phù viêm carrageenin Sau gây viêm, Chế phẩm CT thể đợc tác dụng chống viêm *Phơng pháp gây viêm màng bụng Bảng 5.4: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất thể tích dịch rỉ viêm Lô Thuốc thử liều lợng n Số lợng dịch trung bình (ml) % giá trị TB làm giảm thể tích dịch so với p so với lô chứng p so víi Indomethacin vµ prednisolon 173 Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg 10 10 10 10 10 10 10 4,27 ± 0,51 2,63 ± 0,25 2,99 ± 0,35 1,77 ± 0,24 1,48 ± 0,35 1,57 ± 0,43 1,09 ± 0,24 l« chøng 38,41 < 0,05 29,98 < 0,05 58,55 < 0,01 < 0,05 65,34 < 0,01 < 0,05 63,24 < 0,01 < 0,05 74,48 < 0,001 < 0,05 B¶ng 5.5: ¶nh h−ëng Chế phẩm CT hợp chất số lợng bạch cầu dịch rỉ viêm Lô Thuốc thử liều lợng Dầu hớng dơng 10ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg p so víi lô chứng p so với Indomethacin prednisolon N Số lợng bạch cầu (nghìn/ mm3) 10 9,63 1,82 10 7,11 ± 2,12 < 0,05 10 6,10 ± 1,69 < 0,05 10 7,51 ± 2,59 > 0,05 > 0,05 10 6,28 ± 1,66 < 0,01 > 0,05 10 7,91 ± 2,36 > 0,05 > 0,05 10 6,06 ± 1,98 < 0,01 > 0,05 Kết nghiên cứu Bảng 5.4 5.5 cho thấy Chế phẩm CT hợp chất có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt, làm giảm lợng dịch rỉ viêm 58,55% - 74,48% so với lô chứng (p< 0,05) Tác dụng Chế phẩm CT hợp chất mạnh Indomethacin prednisolon Ngoài ra, Chế phẩm CT hợp chất liều 14 mg/kg làm giảm số lợng bạch cầu dịch rỉ viêm so với lô chứng (p< 0,05) 5.2.2.2 Tác dụng chống viêm mạn tính 174 Bảng 5.6: Trọng lợng trung bình u hạt sau dùng thuốc L« Thc thư liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Indomethacin 2,5 mg/ kg Prednisolon mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg n Trọng lợng trung bình u hạt (mg) 10 208 ± 27 10 p so víi Indomethacin vµ prednisolon Tỷ lệ % giảm trọng lợng u p so víi l« chøng 102 ± 50,97 < 0,01 10 118 ± 43,27 < 0,05 10 169 ± 16 18,75 > 0,05 > 0,05 10 116 ± 10 44,24 < 0,01 > 0,05 10 128 ± 38,77 < 0,05 > 0,05 10 120 ± 11 42,31 < 0,01 > 0,05 B¶ng 5.6 cho thÊy víi liỊu mg/kg Chế phẩm CT làm giảm 18,75% trọng lợng u hạt, với liều 14 mg/kg Chế phẩm CT làm giảm 44,24% trọng lựơng u hạt so với lô chứng Hợp chất có tác dụng chống viêm mạn tính rõ rệt, làm giảm 38,7742,31% trọng lợng u hạt thực nghiệm Tác dụng hợp chất liều 14 mg/kg tơng đơng với indomethacin 2,5 mg/kg prednisolon mg/kg (p> 0,05) 5.2.3 Tác dụng bảo vệ dày 5.2.3.1 Trên mô hình thắt môn vị Bảng 5.7: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất đến thể tích dịch vị toàn phần Lô Thuốc thử liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Omeprazol 10mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg n Thể tích dịch vị (ml) % giảm so với lô chøng p so víi l« chøng 10 11,79 ± 1,69 10 p so víi omeprazol 4,29 ± 0,84 63,62 < 0,01 10 7,86 ± 0,64 33,34 < 0,05 < 0,05 10 5,86 ± 1,67 50,3 < 0,05 > 0,05 10 8,71 ± 2,69 26,13 > 0,05 < 0,05 10 6,71 ± 0,81 43,09 < 0,05 < 0,05 175 KÕt qu¶ Bảng 5.7 cho thấy omeprazol 10 mg/kg làm thể tích dịch vị giảm 63,62% so với lô chứng (p < 0,01) Trong ®ã ChÕ phÈm CT 14 mg/kg hợp chất 14 mg/kg làm giảm thể tích dịch vị tơng ứng 50,%% 43,09% so với lô chứng Bảng 5.8: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất pH dịch vị Lô Thuốc thử liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Omeprazol 10 mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg % thay ®ỉi pH dịch vị p so với lô chứng 3,22 0,37 ↑ 38,79 < 0,05 10 2,18 ± 0,32 ↓ 6,04 > 0,05 10 3,90 ± 0,31 ↑ 68,83 < 0,001 10 2,00 ± 0,11 ↓ 13,79 > 0,05 10 1,90 ± 0,10 ↓ 18,11 < 0,05 N pH cđa dÞch vị 10 2,32 0,17 10 Kết Bảng 5.8 cho thÊy ChÕ phÈm CT víi liỊu 14 mg/kg làm tăng pH dịch vị lên 68,83% so với lô chứng, mạnh omeprazol 10 mg/kg Tuy nhiên hợp chất lại có xu hớng làm giảm pH dịch vị (giảm 18,11% so với lô chứng) Bảng 5.9: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất số ổ loét dày Lô Thuốc thử liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Omeprazol 10 mg/ kg ChÕ phÈm CT mg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg Hỵp chÊt mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg p so víi l« chøng N Sè ỉ lt dày 10 2,14 0,83 10 0,00 0,00 < 0,05 10 0,29 ± 0,20 < 0,05 10 0,00 ± 2,63 < 0,05 10 0,57 ± 0,62 > 0,05 10 0,00 ± 0,00 < 0,05 176 KÕt qu¶ nghiên cứu cho thấy hợp chất liều 14 mg/kg làm giảm rõ rệt số ổ loét chuột so với lô chứng, tác dụng tơng đơng với omeprazol 10 mg/kg 5.2.3.2 Trên mô hình gây loét Indomethacin Bảng 5.10: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất số ổ loét dày Lô Thc thư vµ liỊu lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Misoprostol 100 àg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg ChÕ phÈm CT 20 mg/ kg Hỵp chÊt 14 mg/ kg Hỵp chÊt 20 mg/ kg N Sè æ loÐt ë dày p so với lô chứng 10 10,63 4,31 10 5,83 ± 2,13 < 0,05 10 7,66 ± 5,09 > 0,05 10 7,00 ± 2,61 = 0,05 10 7,00 ± 2,78 > 0,05 10 6,50 ± 3,51 = 0,05 Kết nghiên cứu đợc ghi lại Bảng 5.10 cho thấy: misoprostol liều100 àg/kg làm giảm rõ rệt số ổ loét dày chuột so với lô chứng (p< 0,05) Chế phẩm CT hợp chất có xu hớng làm giảm số ổ loét dày chuột thực nghiệm, song khác biệt cha có ý nghĩa thống kê Bảng 5.11: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất độ dài trung bình ổ loét dày Lô Thuốc thử liều lợng Dầu hớng dơng 10 ml/ kg Misoprostol 100 µg/ kg ChÕ phÈm CT 14 mg/ kg ChÕ phÈm CT 20 mg/ kg Hỵp chÊt p so với chứng n Độ dài TB æ loÐt (mm) 10 25,75 ± 14,48 10 11,37 ± 5,06 < 0,05 10 13,77 ± 5,52 < 0,05 10 14,22 ± 5,39 < 0,05 10 16,87 ± 10,50 > 0,05 177 14 mg/ kg Hỵp chÊt 20 mg/ kg 9,43 ± 5,69 10 < 0,05 KÕt qu¶ thực nghiệm cho thấy Chế phẩm CT hợp chất với liều 20 mg/kg làm giảm rõ rệt độ dài trung bình ổ loét dày chuột so với lô chứng, tác dụng tơng đơng với misoprostol 100 àg/kg 5.2.4 Tác dụng huyết áp nhịp tim chó Bảng 5.12: ảnh hởng Chế phẩm CT hợp chất lên huyết áp trung bình chó Thuốc thử Dầu hớng dơng Chế phẩm CT Hợp chất LiỊu dïng n HA tr−íc ng thc (mmHg) ml/ kg 107,3 ± 6,0 4mg/ kg 112,0 ± 7,6 mg/ kg 107,3 ± 6,6 HA thời điểm sau uống thuốc (mmHg) 30 phút 60 90 120 180 240 300 360 100 ±1 115 ±8 116 ±2 123 ± 16 109 ±6 105 ±9 120 ± 13 108 ±5 112 ±3 106 ±6 112 ±9 108 ± 11 109 ±7 115 ± 12 105 ±2 104 ±3 113 ± 12 111 ±1 122 ± 16 109 ± 10 113 ±4 103 ±3 107 ±6 102 ±5 420 480 121 ± 15 106 ±6 102 ± 0,3 109 ±6 107 ±7 103 ±2 B¶ng 5.13: ¶nh hởng Chế phẩm CT hợp chất lên nhịp tim chó Thuốc thử Dầu hớng dơng Chế phẩm CT Hợp chất Nhịp tim/ phút trớc uống thuốc LiÒu dïng n ml/ kg 170 ± 4mg/ kg 171 ± mg/ kg 183 Nhịp tim thời điểm sau ng thc (lÇn/ phót) 30 60 90 120 180 240 300 360 420 171 ±1 170 ±1 172 ±8 170 ±1 174 ±5 186 ±11 171 ±1 169 ±2 183 ±2 175 ±4 180 ±6 174 ±10 177 ±5 178 ±10 183 ±7 176 ±2 180 ±13 180 ±8 185 ±7 181 ±11 176 ±7 179 ±4 181 ±12 181 ±14 175 ±1 184 ±13 181 ±4 480 180 ±4 184 13 188 Kết ghi lại Bảng 5.12 5.13 cho thấy Chế phẩm CT hợp chất với liều mg/kg thể trọng không làm thay đổi huyết áp nhịp tim chó cách có ý nghĩa thống kê suốt thời gian theo dâi (5 giê) so víi tr−íc uèng thuèc so với chó uống dung môi dầu hớng dơng 5.2.5 Tác dụng kháng khuẩn in vitro 178 Bảng 5.14: Kết thử hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ ml) Thc thư Vi khn Gr (-) ChÕ phÈm CT Hỵp chÊt Vi khn Gr (+) NÊm mèc NÊm men E coli P aeruginosa B subtilis S aureus Asp niger F oxysporum S cerevisiae C albicans 50 (-) 50 (-) 25 50 (-) (-) 50 (-) 50 (-) 25 50 (-) (-) (-) : tác dụng kháng vi sinh vật Qua Bảng 5.14 thấy Chế phẩm CT hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli, B subtilis, Asp niger vµ F oxysporum 5.3 KÕt luËn Qua kết nghiên cứu thực nghiệm, rút mét sè kÕt luËn sau: - ChÕ phÈm CT hợp chất với liều uống 12-24 mg/kg chuột nhắt có tác dụng giảm đau theo chế trung ơng ngoại biên - Chế phẩm CT hợp chất có tác dụng chống viêm cấp, giảm phản ứng phù viêm, giảm lợng dịch rỉ viêm lợng bạch cầu dịch rỉ viêm thực nghiệm chuột cống - Chế phẩm CT hợp chất có tác dụng chống viêm mạn tính, ức chế tạo thành khối u hạt gây amiant carrageenin trªn cht cèng - Trªn cht cèng, víi liỊu ng 14 mg/kg Chế phẩm CT hợp chất làm giảm thể tích dịch vị, giảm số ổ loét độ dài trung bình vết loét dày 179 - Chế phẩm CT hợp chất không ảnh hởng đến huyết áp nhịp tim chó với liều uống mg/kg - Cả Chế phẩm CT hợp chất có hoạt tính kháng E coli, B subtilis, Asp niger vµ F oxysporum in vitro Tãm lại, tác dụng dợc lý, hợp chất ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16en-18-yl axetat (1) Chế phẩm CT giàu hoạt chất đợc phân lập từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) đợc nghiên cứu sử dụng cho trờng hợp viêm cấp tính (nh viêm cơ, viêm dày, viêm xuất tiết) viêm mạn tính (nh viêm xơng khớp) Xây dựng tiêu chuẩn sở Xây dựng tiêu chuẩn sở cho hoạt chất ent-7hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) Công thức phân tử: C22H32O4 Công thức hóa học: 13 20 CH3 10 18 CH3COOCH2 11 16 H 17 14 H H 15 H CH3 O OH 19 (1) Khối lợng phân tử: 360 Tên khoa häc: ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (b»ng tiÕng Anh: ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate) 180 Nhiệt độ nóng chảy: 132-135OC Tính chất: Tinh thể hình kim màu trắng, không mùi Dễ tan cloroform; tan đợc axeton; khó tan n-hexan; thực tế không tan nớc Tan đợc dầu béo thực vật, nh dầu hớng dơng, dầu lạc Không lẫn tạp chất vô Đặc điểm phổ sắc ký ; độ tinh khiết : Phổ hồng ngoại (IR): phù hợp với phỉ cđa s¶n phÈm chn (xem Phơ lơc) Phỉ khối lợng (EI-MS): phù hợp với phổ sản phẩm chn (x Phơ lơc) Phỉ céng hng tõ proton (1H-NMR): phù hợp với phổ sản phẩm chuẩn (xem Phơ lơc) Phỉ céng h−ëng tõ carbon-13 (13C-NMR): phï hợp với phổ sản phẩm chuẩn (xem Phụ lục) Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC): Phân tích sắc ký lớp mỏng đợc thực mỏng tráng sẵn TLC aluminium sheets Silica gel 60F254 (bề dày cđa líp silica gel lµ 0,20 mm) cđa h·ng Merck, CHLB Đức Mẫu phân tích (1 mg) đợc hoà tan cloroform (1 ml), àl dung dịch thử đợc đa lên mỏng Hệ dung môi chạy sắc ký n-hexan/etyl axetat 1/1 (v/v) Hiện vệt chất sắc ký đồ TLC cách phun thuốc vanilin/H2SO4 đặc 1%, sau hơ nóng mỏng 100OC (hoạt chất ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) cho màu tím hồng), b»ng thc thư Dragendorff-Munier (ho¹t chÊt ent-7β-hydroxy15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) cho màu da cam) Trên sắc ký đồ TLC, sản phẩm ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) xuất dới dạng vệt tròn nhất, với giá trị Rf 0,53 Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC): Thiết bị HPLC AGILENT TECHNOLOGY víi Photodiode Array Detector 1100 DAD Cét t¸ch cã kÝch th−íc 250 x 4,6 mm; chÊt nhåi cét lµ ODS-18, cỡ hạt àm Pha động hệ dung môi gradient MeOH (loại cho HPLC)/H2O, bắt 181 đầu từ 20% MeOH (v/v) ®Õn 100% MeOH 25 phót, sau 100% MeOH phút Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích bơm mẫu: 10 àl Phát chất detector DAD đợc đặt bớc sóng 210 240 nm Mẫu thử đợc pha nồng độ mg/ml MeOH (loại cho HPLC) Trên sắc ký ®å HPLC cđa s¶n phÈm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) xt hiƯn mét pic chÝnh ë tR 27,086 (xem Phơ lơc) Sản phẩm ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) thực tế hoàn toàn tinh khiết (1H-NMR, TLC, HPLC) Xây dựng tiêu chuẩn së cho chÕ phÈm CT-2005 TÝnh chÊt: ChÕ phÈm CT-2005 có màu trắng, không mùi Dễ tan cloroform; tan đợc axeton; khó tan n-hexan; thực tế không tan nớc Tan đợc dầu béo thực vật, nh dầu hớng dơng, dầu lạc Không lẫn tạp chất vô Thành phần hoá học : Chế phẩm CT-2005 chøa chđ u ho¹t chÊt ent-7βhydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (chiÕm 86 mol% hỗn hợp), chứa ent-kauran ditecpenoit phụ khác ent-1,14-diaxetoxy7-hydroxykaur-16-en-15-on ent-1,7-diaxetoxy-14-hydroxykaur-16en-15-on (mỗi chất chiếm mol% hỗn hợp) (1H-NMR) Phổ cộng huởng từ proton (1H-NMR): phï hỵp víi phỉ cđa ChÕ phÈm CT2005 chuẩn (xem Phụ lục), so sánh phổ với phổ 1H-NMR mẫu ent-kauran ditecpenoit chuẩn từ khổ sâm Bắc Bộ đà cho phép xác định thành phần Chế phẩm CT-2005 (xem trên) Kết phù hợp với khảo sát TLC HPLC Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC): Với thuốc vanilin/H2SO4 đặc 1% sắc ký đồ TLC Chế phẩm CT-2005 xuất ba vệt tròn màu tím hồng gần với giá trị Rf 0,44 ; 0,53 (của hoạt chất chủ yếu 1) ; 0,60 TLC profile dùng vào việc phân tích định tính Chế phẩm CT-2005 182 Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC): phù hợp với sắc ký ®å HPLC cđa ChÕ phÈm CT-2005 chn (xem Phơ lơc) Trên sắc ký đồ HPLC Chế phẩm CT-2005 có ba hợp chất đợc rửa giải tR 22,599 phút (ent1,14-diaxetoxy-7-hydroxykaur-16-en-15-on), 23,301 phút (ent-1,7diaxetoxy-14-hydroxykaur-16-en-15-on), 27,133 phút (hoạt chÊt chđ u ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)) HPLC profile nµy cã thể đợc sử dụng vào việc tiêu chuẩn hóa Chế phẩm CT-2005 đợc sản xuất từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Kết luận đề nghị Đà xây dựng đợc quy trình chiết tách ổn định để thu nhận ent-kauran ditecpenoit (hoạt chất ent-7-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) Chế phẩm CT-2005 giàu hoạt chất 1) từ khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae); quy trình đà đợc áp dụng ổn định quy mô 10-25 kg khô khổ sâm Bắc Bộ/mẻ để sản xuất cung cấp luợng lớn hoạt chất Chế phẩm CT-2005 cho nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro động vật thực nghiệm Đà phân lập hoạt chất Chế phẩm CT-2005 để dùng làm chuẩn đối chứng kiểm nghiệm kiểm tra mẻ sản phẩm chiết tách Đà tiến hành thử độc tính cấp độc tính bán trờng diễn hoạt chất Chế phẩm CT-2005 Kết cho thấy: độc tính cấp, hoạt chất Chế phẩm CT-2005 theo ®−êng ng gÊp 500 lÇn liỊu dïng dù kiÕn cho ngời chuột chết nên không xác định đợc LD50; độc tính bán trờng diễn, thỏ hoạt chất Chế phẩm CT-2005 với liều tơng đơng với gấp ba lần liều dùng dự kiến cho ngời uống 183 liên tục tuần, tình trạng chung, chức phận gan, thận tạo huyết không bị ảnh hởng Kết bớc đầu thực số khảo sát ảnh hởng tới vật liệu di truyền ë sóc vËt thÝ nghiƯm cho thÊy ¶nh h−ëng cđa hoạt chất entkauran ditecpenoit đến số lợng cấu trúc nhiễm sắc thể tủy xơng tinh hoàn chuột nhắt trắng liều điều trị liều điều trị x với thời gian uống thuốc 20 ngày so với nhóm chứng, khác biệt nhóm ý nghĩa thống kê Kết thử hoạt tính kháng u trực tiếp dòng tế bào ung th ngời nuôi cấy in vitro đà cho thấy mẫu hoạt chất Chế phẩm CT-2005 lấy từ mẻ chiết tách khác có hoạt tính mạnh ổn định gây độc dòng tế bào thử nghiệm (Lu Lung cancer, RD Rhabdosarcoma, Hep-G2 Hepatocellular carcinoma) giá trị IC50 thấp Kết thử tác dụng chống ung th động vật thực nghiệm cho thấy hoạt chất Chế phẩm CT-2005 với liều lợng 10 mg/kg 20 mg/kg thể trọng chuột nhắt có tác dụng hạn chế phát triển ung th thực nghiệm sarcoma 180 in vivo uống trớc tháng có tác dụng dự phòng ung th Kết thử động vật thực nghiệm cho thấy hoạt chất Chế phẩm CT-2005 có tác dụng rõ rệt giảm đau; chống viêm cấp, chống viêm mạn tính; giảm thể tích dịch vị, giảm số ổ loét độ dài trung bình vết loét dày Về tác dụng dợc lý, hoạt chất Chế phẩm CT-2005 đợc nghiên cứu sử dụng cho truờng hợp viêm cấp tính nh viêm cơ, viêm dày, viêm xuất tiết; viêm mạn tính nh viêm xơng khớp Đề tài đà đăng ký Bằng độc quyền sáng chế, đào tạo Thạc sĩ Hóa học, hoàn thành báo khoa học để đăng Tạp chí khoa học chuyên ngành 184 Nh Đề tài ĐTĐL-2005/05 đà hoàn thành tốt vợt mức kế hoạch đợc giao Quy trình chiết tách đà đợc hoàn thiện để triển khai ổn định quy mô 10-25 kg khô khổ sâm Bắc Bộ/mẻ (kế hoạch Đề tài yêu cầu quy mô 10 kg khô khổ sâm Bắc Bộ/mẻ) Các thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro động vật thực nghiệm đà đợc thực với hoạt chất lẫn Chế phẩm CT-2005 (kế hoạch Đề tài yêu cầu thử với Chế phẩm CT-2005), điều đòi hỏi nhiều cố gắng mặt thử nghiệm nh mặt sản xuất đủ lợng hoạt chất Chế phẩm CT-2005 cho nghiên cứu, thử nghiệm hoạt tính sinh học Đề nghị: Với kết nghiên cứu thu đợc, Đề tài ĐTĐL-2005/05 đà tạo sở để phát triển dợc phẩm tạo thuốc chống viêm, giảm đau, bảo vệ dày, hỗ trợ điều trị ung th dự phòng ung th từ hoạt chất entkauran ditecpenoit khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Chúng kính đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ xét duyệt tài trợ kinh phí cho nghiên cứu tiếp vấn đề Giai đoạn để đa kết Giai đoạn vừa qua vµo øng dơng thùc tiƠn Cơ thĨ, ë Giai đoạn vừa qua Đề tài đà nghiên cứu đợc quy trình chiết tách ổn định để thu nhận hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ khổ sâm Bắc Bộ đà có kết nghiên cứu tiền lâm sàng (xác định độc tính cấp độc tính bán trờng diễn, xác định hoạt tính in vitro động vật thực nghiệm, xác định liều dùng dự kiến cho ngời) Vì vậy, để đa kết vào ứng dụng, kính đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ xét duyệt cho nghiên cứu tiếp vấn đề Giai đoạn với nội dung chủ yếu sản xuất hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ khổ sâm Bắc Bộ, nghiên cứu bào chế thuốc nghiên cứu ứng dụng lâm sàng tác dụng chống viêm, giảm đau, bảo vệ dày, hỗ trợ điều trị ung th dự phòng ung th 185