Giá trị của nồng độ trec trong chẩn đoán suy giảm miễn dịch bẩm sinh ở trẻ em

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC *** NGUYỄN HUY KHÁNH GIÁ TRỊ CỦA NỒNG ĐỘ TREC TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẨM SINH Ở TRẺ EM LUÂN VĂN THẠC SĨ Y HỌC THÁI NGUYÊN - NĂM 2022 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC *** NGUYỄN HUY KHÁNH GIÁ TRỊ CỦA NỒNG ĐỘ TREC TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẨM SINH Ở TRẺ EM Chuyên ngành : Nhi khoa Mã số: 8.72.01.06 LUÂN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thị Vân Anh TS Hoàng Hải Yến THÁI NGUYÊN - NĂM 2022 i LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Huy Khánh xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Vân Anh TS Hoàng Hải Yến Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Thái Nguyên, tháng 07 năm 2022 Người viết cam đoan Nguyễn Huy Khánh ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình hồn thành luận văn này, nhận hướng dẫn, giúp đỡ động viên tất thầy cơ, bạn bè đồng nghiệp gia đình Trước tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới người thầy - TS Nguyễn Thị Vân Anh TS Hồng Hải Yến tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt tơi đường nghiên cứu khoa học Tơi xin trân trọng cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo, thầy cô Bộ môn Nhi - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc tập thể cán nhân viên khoa Miễn dịch – Dị ứng – Khớp, Bệnh viện Nhi Trung ương, Ban Giám đốc tập thể nhân viên Trung tâm Sàng lọc, Chẩn đoán trước sinh sơ sinh - Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình triển khai đề tài, học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Hội đồng khoa học đã tạo điều kiện, đóng góp ý kiến quý báu cho luận văn động viên suốt q trình học tập Tơi chân thành cảm ơn thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp, gia đình người thân giúp đỡ, động viên tơi tinh thần vật chất trình học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng 07 năm 2022 Học viên Nguyễn Huy Khánh iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh ADN Acid Deoxyribonucleic CVID Common Tiếng Việt ADN variable immunodeficiency DBS Dried Blood Sample Mẫu máu khô ESID European Society Hiệp hội suy giảm miễn dịch for Immunodeficiencies Châu Âu IgA Immunoglobulin A Immunoglobulin A IgG Immunoglobulin G Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M Immunoglobulin M LASID Latin American Society for Hiệp hội suy giảm miễn dịch NBS Immunodeficiencies Mỹ Latin Newborn screening Sàng lọc sơ sinh NST Nhiễm sắc thể Major Phức hợp tương hợp mơ học histocompatibility complex PCR Polemerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase SCID Severe Combine Suy giảm miễn dịch bẩm sinh Immunodeficiency thể kết hợp trầm trọng MHC SGMD Suy giảm miễn dịch TCR T cell receptor Thụ thể tế bào lympho T TREC T cell receptor excision circle Vòng tròn thụ thể tế bào lympho T ƯCMD Ức chế miễn dịch iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan suy giảm miễn dịch bẩm sinh 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Dịch tễ học SGMD bẩm sinh 1.2 Tổng quan T cell Receptor Excision Circle 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Lịch sử sàng lọc SGMD bẩm sinh .5 1.2.3 Cơ sở khoa học xét nghiệm TREC 1.3 Các thể bệnh SGMD sàng lọc TREC .9 1.3.1 Bệnh SGMD bẩm sinh thể kết hợp trầm trọng (Severe Combine Immunodeficiency – SCID) .9 1.3.2 Hội chứng Omenn 13 1.3.3 Hội chứng Digeorge .14 1.3.4 Bệnh Down .17 1.3.5 Hội chứng Charge 18 1.3.6 Một sớ hạn chế sàng lọc chẩn đốn TREC .19 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng sàng lọc TREC chẩn đoán sớm bệnh SGMD bẩm sinh trẻ sơ sinh 21 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu .23 2.2.1 Thời gian nghiên cứu: 23 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu .23 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu .23 2.3.2 Chọn mẫu cỡ mẫu .24 2.3.3 Phương tiện nghiên cứu 24 v 2.4 Biến số số nghiên cứu .25 2.4.1 Biến số nghiên cứu mục tiêu 25 2.4.2 Biến số nghiên cứu mục tiêu 26 2.4.3 Chí sớ nghiên cứu 27 2.5 Phương pháp thu thập số liệu .28 2.6 Thu thập xử lý số liệu 28 2.7 Sai số cách khống chế 29 2.8 Đạo đức nghiên cứu 29 2.9 Sơ đồ nghiên cứu 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Một số đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 32 3.2 Đặc điểm nồng độ TREC trẻ sơ sinh Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội 33 3.2.1 Đặc điểm nồng độ TREC trẻ sơ sinh 33 3.2.2 Đặc điểm nồng độ TREC theo giới tính .33 3.2.3 Đặc điểm nồng độ TREC theo tuổi thai .34 3.3 Giá trị nồng độ TREC chẩn đoán suy giảm miễn dịch bẩm sinh 35 3.3.1 Tổng quan sàng lọc 35 3.3.2 Kết ứng dụng sàng lọc TREC .36 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 42 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 42 4.2 Đặc điểm nồng độ TREC trẻ sơ sinh Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội 43 4.2.1 Đặc điểm nồng độ TREC trẻ sơ sinh 43 4.2.2 Đặc điểm nồng độ TREC theo giới tính .44 4.2.3 Đặc điểm nồng độ TREC theo tuổi thai .45 4.2.4 Đặc điểm nồng độ TREC theo cân nặng 46 4.3 Giá trị nồng độ TREC cho chẩn đoán suy giảm miễn dịch bẩm sinh 47 4.3.1 Tổng quan sàng lọc 47 4.3.2 Kết ứng dụng sàng lọc TREC 48 KẾT LUẬN KHUYẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại SCID theo kiểu hình miễn dịch và chế di truyền Bảng 3.1: Phân bớ tuổi thai nhóm trẻ sơ sinh làm xét nghiệm TREC 32 Bảng 3.2: Phân bớ giới nhóm trẻ sơ sinh làm xét nghiệm TREC 32 Bảng 3.3: Phân bố cân nặng nhóm trẻ sơ sinh làm xét nghiệm TREC .33 Bảng 3.4: Đặc điểm nồng độ TREC trẻ sơ sinh 33 Bảng 3.5: Phân bố nồng độ TREC theo giới 33 Bảng 3.6: Phân bố nồng độ TREC nhóm tuổi thai 34 Bảng 3.7: Phân bố nồng độ TREC theo cân nặng 34 Bảng 3.8 : Tiền sử sản khoa và gia đình 36 Bảng 3.9: Tỷ lệ bất thường hình thể và nhiễm khuẩn nhóm nguy cao 39 Bảng 3.10: Sớ lượng bạch cầu nhóm bệnh nhân nguy cao 37 Bảng 3.11: Số lượng tế bào lympho nhóm bệnh nhân nguy cao 40 Bảng 3.12: Nồng độ kháng thể nhóm bệnh nhân nguy cao 38 Bảng 3.13: Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân mắc SCID 40 Bảng 3.14: Đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân mắc SCID 43 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phân bớ tỷ lệ SGMD bẩm sinh giới Hình 1.2 Quá trình trưởng thành tế bào lymopho T tuyến ức Hình 1.3 Quá trình hình thành TREC Hình 1.4 Hội chứng Omenn trẻ nữ tháng tuổi người Sardinia (khơng có đột biến RAG1-RAG2, khiếm khuyết gen không xác định) 14 Hình 1.5 Hình ảnh vùng gen bị xóa nhiễm sắc thể sớ 22 dựa xét nghiệm FISH 16 ĐẶT VẤN ĐỀ Suy giảm miễn dịch (SGMD) bẩm sinh hay gọi suy giảm miễn dịch tiên phát (primary immunodeficiency) nhóm bệnh lý bất thường mặt di truyền liên quan tới tình trạng suy giảm thiếu hụt nhiều yếu tố hệ thống miễn dịch Theo Hiệp hội miễn dịch học quốc tế năm 2019, có 430 bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh khác Trong có nhiều thể nặng, ảnh hưởng nghiêm trọng tới tính mạng trẻ [66] Biểu lâm sàng nhóm bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh phụ thuộc vào thể bệnh Với thể bệnh nặng, bệnh nhân thường xuất nhiễm khuẩn sớm, nặng tái diễn nhiều đợt cần điều trị kháng sinh đường tĩnh mạch, tác dụng mạnh kéo dài, chí tử vong sớm không điều trị kịp thời Một số thể nặng phải điều trị ghép tế bào gốc cấp cứu để cứu sống bệnh nhân Vì vậy, chẩn đốn sớm đóng vai trị quan trọng,giúp đưa định điều trị kịp thời Năm 2005, Chan Puck lần ứng dụng xét nghiệm định lượng vòng tròn thụ thể tế bào lympho T (T-cell receptor excision circle – TREC) để sàng lọc bệnh suy giảm miễn dịch bẩm sinh cho trẻ sơ sinh Đối với bệnh nhân mắc SGMD bẩm sinh có giảm lympho T, đặc biệt SGMD thể kếp hợp trầm trọng, nồng độ TREC giảm thấp [22] Do đó, phương pháp giúp sàng lọc từ định hướng giúp chẩn đốn sớm bệnh nhân có nguy cao ngày đầu sau sinh nhanh chóng áp dụng nước giới Mỹ, châu Âu nước châu Á [12, 13, 23, 45, 54] Tại Việt Nam nhiều thể bệnh SGMD bẩm sinh chẩn đoán điều trị năm qua Tuy nhiên, nhóm bệnh nhân SGMD bẩm sinh thể trầm trọng kết hợp, đa số bệnh nhân tử vong vài tháng sau sinh phát muộn, tình trạng nhiễm trùng nặng mà chưa kịp ghép tế bào gốc tạo máu Gần đây, xét nghiệm TREC thực vài đơn vị y tế DCLRE1C, RAG1, and RAG2 mutations in a cohort of Chinese and Southeast Asian children; 31(2):281-96 47 Lee WI, Huang JL, Jaing TH, et al (2011), ''Distribution, clinical features and treatment in Taiwanese patients with symptomatic primary immunodeficiency diseases (PIDs) in a nationwide population-based study during 1985-2010'' Immunobiology; 216(12):1286-94 48 Modell V, Gee B, Lewis DB, et al (2011), ''Global study of primary immunodeficiency diseases (PI) diagnosis, treatment, and economic impact: an updated report from the Jeffrey Modell Foundation'' Immunologic research; 51(1):61-70 49 Modell V, Quinn J, Orange J, et al (2017), Primary immunodeficiencies worldwide: an updated overview from the Jeffrey Modell Centers Global Network Immunologic research; 64(3):736-53 50 Ochs HD, Smith CE, Puck JM (2006), Primary immunodeficiency diseases: a molecular & cellular approach: Oxford University Press 51 Ostermaier KKJUU, Post TW, UpToDate (2019), Waltham Accessed Feb Down syndrome: Clinical features and diagnosis; 4:2018 52 Puck JM (2012), ''Laboratory technology for population-based screening for severe combined immunodeficiency in neonates: the winner is T-cell receptor excision circles'' The Journal of allergy and clinical immunology; 129(3):607-16 53 Puck JM (2019), Newborn screening for severe combined immunodeficiency and T-cell lymphopenia, Immunological reviews; 287(1):241-52 54 Rechavi E, Lev A, Simon AJ, et al (2017), ''First Year of Israeli Newborn Screening for Severe Combined Immunodeficiency-Clinical Achievements and Insights'' Frontiers in immunology; 8:1448 55 Routes JM, Grossman WJ, Verbsky J, et al (2009), Statewide newborn screening for severe T-cell lymphopenia Jama, 302(22):2465-70 56 Sanlaville D, Verloes A (2007), ''CHARGE syndrome: an update'' European journal of human genetics EJHG, 15(4):389-99 57 Seidel MG, Kindle G, Gathmann B, et al (2019), ''The European Society for Immunodeficiencies (ESID) Registry Working Definitions for the Clinical Diagnosis of Inborn Errors of Immunity'' The journal of allergy and clinical immunology In practice; 7(6):1763-70 58 Seroogy CMJUJ (2019), DiGeorge (22q11 deletion) syndrome: Clinical features and diagnosis; 11 59 Stray-Pedersen A, Abrahamsen TG, Frøland SS (2000), ''Primary immunodeficiency diseases in Norway'', Journal of clinical immunology; 20(6):477-85 60 Sullivan KE (2007), ''DiGeorge syndrome/velocardiofacial syndrome: the chromosome 22q11.2 deletion syndrome'' Advances in experimental medicine and biology; 601:37-49 61 van der Spek J, Groenwold RH, van der Burg M, et al (2015), TREC Based Newborn Screening for Severe Combined Immunodeficiency Disease: A Systematic Review Journal of clinical immunology; 35(4):416-30 62 Verbsky JW, Baker MW, Grossman WJ, et al (2012), ''Newborn screening for severe combined immunodeficiency; the Wisconsin experience (20082011)'' Journal of clinical immunology; 32(1):82-8 63 Villa A, Santagata S, Bozzi F, et al (1999), Omenn syndrome: a disorder of Rag1 and Rag2 genes; 19(2):87-97 64 Vogel BH, Bonagura V, Weinberg GA, et al (2014), ''Newborn screening for SCID in New York State: experience from the first two years'' Journal of clinical immunology; 34(3):289-303 65 Wang LL, Jin YY, Hao YQ, et al (2011), ''Distribution and clinical features of primary immunodeficiency diseases in Chinese children (2004-2009)'' Journal of clinical immunology; 31(3):297-308 66 Tangye SG, Al-Herz W, Bousfiha A, et al (2020), Human Inborn Errors of Immunity: 2019 Update on the Classification from the International Union of Immunological Societies Expert Committee Journal of clinical immunology; 40(1):24-64 PHỤ LỤC Phụ lục BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã số nghiên cứu: _Mã số y tế _ □ Hồi cứu I Mục tiêu 1 Hành Tiên sử sản khoa Con thứ Tuần thai _ Để thường/đẻ mổ □ Tiến cứu BW _kg Họ tên bệnh nhân Ngày sinh / _/ Dân tộc: _Giới: nam/nữ Địa chỉ: _ Liên lạc: Bố sinh năm Điện thoại Mẹ sinh năm Điện thoại Tuổi thời điểm lấy mẫu (ngày tuổi) : _ Tuổi thời điểm đến khám bệnh viện Nhi Trung ương (nếu có): Nồng độ TREC Ngày, TREC (copies/μl) _/ _/ _ II Mục tiêu (khi kết sàng lọc dương tính) Tiền sử gia đình Bố mẹ BN có kết cận huyết khơng? Gia đình có người bị bệnh NK tái diễn chết sớm NK không? (Nếu có ghi vào phả hệ: năm sinh, bệnh, tuổi) Mẹ có mắc bệnh q trình mang thai khơng? Cụ thể: Mẹ có sử dụng thuốc ức chế miễn dịch q trình mang thai khơng? Cụ thể: _ □ Có □ Có □ Khơng □ Khơng □ Có □ Có □ Khơng □ Khơng Sơ đồ phả hệ I II III IV Tiền sử thân □ Lao □ Sởi – Quai bị - Rubella Tiêm phòng □ Rota virus □ Bạch hầu – uốn ván – Ho gà □ Viêm gan B □ Phế cầu □ Biến chứng sau tiêm vaccine?Có/Khơng □ Thuốc cam □ Hoá chất, xạ trị Tiền sử dùng th́c □ Chloramphenicol □ Chì  Tiền sử bệnh Cơ quan NK Viêm đường HH Viêm phổi Viêm tai Viêm màng não Viêm não, Ápxe não NK tiêu hoá Viêm khớp Viêm phúc mạc Ápxe da, Nhiễm khuẩn huyết Lâm sàng TOÀN THÂN Chiều cao cm Phát triển tinh thần Số lần/Thời gian lần Cân nặng _□ Bình thường □ Chậm phát triển Phát triển vận động □ Bình thường Bộ mặt □ Bình thường Da, □ Bình thường □ Nhiễm khuẩn ngồi da □ Sẹo lao Niêm mạc □ Bình thường □ Nấm miệng Tóc + □ Bình thường □ Nấm móng Hạch □ Khơng □ Nách _cm Amydal □ Bình thường BỘ PHẬN Tai – Mũi – Họng □ Bình thường □ Sứt môi □ Viêm mũi Hô hấp □ Bình thường □ Viêm phổi Mắt □ Bình thường Tim mạch □ Bình thường Thần kinh □ Bình thường □ Ápxe não Tiêu hố □ Bình thường Gan – Lách □ Gan bình thường □ Lách bình thường Khớp □ Bình thường □ Sưng khớp □ Đau khớp Nhiễm khuẩn huyết Xét nghiệm 5.1 Công thức máu Ngày WBC Neut Lymp Mono (G/L) (G/L) (G/L) (G/L) Lần Lần □ Chậm phát triển □ Bất thường □ Chàm □ Viêm, ápxe □ Sẹo vị trí nhiễm khuẩn □ Viêm lợi □ Cùn cụt □ Rụng tóc □ Khác: vị trí: _cm □ Nhỏ □ Viêm xoang □ Hở hàm ếch □ Viêm tai □ Lồng ngực bất thường □ Khác □ Mắt bất thường □ Bất thường □ Viêm não □ Viêm màng não □ RL Phân máu Phân nhày □ Gan to _cm □ Lách to cm □ Nóng, đỏ khớp □ Có dịch khớp EO (G/L) BASO (G/L) Hb (g/dl) Plt (T/L) 5.2 Nồng độ kháng thể Ngày Trước truyền Lần □ Lần □ 5.3 Sinh hoá Protein (g/l) Ngày Sau truyền □ □ IgA (g/l) IgM (g/l) IgG (g/l) IgE (UI/l) Albumin (g/l/) Ure Creatini (µmol/l) AST (U/l) ALT (U/l) (mmol/l) Lần1 Lần 5.4 Đếm tế bào dòng chảy Ngày CD3 CD4 CD8 CD19 CD56 abs % abs % abs % abs % abs % Lần Lần Chẩn đoán □ SCID □ Giảm bạch cầu lympho tự phát □ Hội chứng DiGeorge □ Dương tính giá □ Hội chứng Down □ Khác _ Điều trị 7.1 Thuốc điều trị Thuốc Đường Liều dùng Thời gian (từ ngày…đến ngày) dùng 7.2 Ghép tế bao gốc tạo máu □ Không Ghép tế bào gớc tạo máu □ có 7.3 Điều trị khác: Kết điều trị Thời gian Phụ lục HƯỚNG DẪN LẤY MÁU GÓT CHÂN Chuẩn bị - Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ cần thiết:  Giấy lấy mẫu  Kim chích máu vơ trùng có đầu kim dài khoảng mm  Bông tẩm cồn sát trùng  Gạc khô vô trùng  Găng vô trùng loại không bột Khăn tẩm nước ấm (do người nhà chuẩn bị) Tiến hành - Điền đầy đủ thông tin vào giấy lấy mẫu Chú ý không làm bẩn vòng tròn phần giấy thấm để thấm máu, không đụng chạm vào phần giấy thấm trước sau lấy mẫu - Vùng lấy an toàn vùng đánh dấu - Ủ chân trẻ khăn ấm từ 3-5 phút - Dùng tẩm cồn sát trùng để sát trùng vùng trích máu gót chân trẻ, sau sát trùng dùng gạc khô vô trùng để lau khơ vùng trích máu - Dùng kim trích máu gót chân, dùng gạc khơ vơ trùng để thấm bỏ giọt máu đầu Để làm tăng lượng máu chảy, bóp RẤT NHẸ NHÀNG cách quãng lên gót chân trẻ phần quanh chỗ trích máu để giọt máu sau chẩy có kích thước LỚN - Chạm nhẹ giấy thấm vào giọt máu LỚN từ phía MẶT SAU vịng trịn - Để giọt máu thấm qua thấm vòng tròn MỘT LẦN chạm DUY NHẤT lên giọt máu LỚN Chỉ thấm máu phía giấy thấm - Thấm vòng tròn khác giấy thấm theo cách thức hướng dẫn giọt máu đủ lớn Nếu máu không chảy nữa, tiếp tục thực bóp nhẹ Chăm sóc vị trí chích gót chân trẻ sau lấy máu - Để giấy lấy mẫu máu lên mặt phẳng sẽ, khô khơng thấm nước tiếng đồng hồ - Chuyển mẫu đến phòng xét nghiệm Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm - Mẫu đạt chuẩn  Có lượng máu thấm phủ khắp vòng tròn in giấy thấm Khơng có nhiều lớp máu hay áp mẫu giấy thấm để lấy máu nhiều lần vịng trịn Khơng đụng chạm mẫu giấy thấm dàn giọt máu mẫu giấy thấm Các mẫu không đạt tiêu Mẫu không đạt chuẩn Nguyên nhân chuẩn 1.Lượng mẫu không đủ xét nghiệm  Di chuyển giấy thấm trước máu thấm vòng tròn trước máu thấm qua mặt bên tờ giấy  Cho máu lên giấy thấm ống mao quản  Tay mang găng không mang găng chạm lên giấy thấm trước sau lấy mẫu máu  Chạm mẫu giấy thấm trước sau lấy mẫu lên tay mang găng không mang găng chạm vào bột chống dính găng tay loại dung dịch chùi tay 2.Mẫu máu thấm giấy nham nhở  Cho máu lên giấy thấm ống mao quản dụng cụ khác 3.Mẫu chưa khô trước mang gửi  Để mẫu khô tối thiểu 4h trước mang gửi 4.Mẫu máu có giọt thấm  Cho nhiều máu lên mẫu giấy thấm, thường khơng phải thấm máu từ gót sang giọt khác chân mà nhỏ máu lên giấy thấm dụng cụ  Cho máu thấm hai mặt giấy thấm 5.Mẫu máu bị pha loãng,  Thấm phần dịch tiết vùng quanh vị trí mầu, nhiễm bẩn trích máu  Giấy thấm bị chạm vào tay mang găng không mang găng, chất cồn, dung dịch sát trùng, nước, dung dịch chùi tay bột chống dính găng tay v.v trước sau lấy mẫu  Mẫu máu bị tiếp xúc trực tiếp với nhiệt 6.Mẫu có vịng huyết  Khơng chùi khơ cồn gót chân trẻ trước trích máu  Để giấy thấm chạm vào cồn, loại dung dịch chùi tay v.v  Thấm nhiều dịch tiết quanh vị trí trích máu  Làm khơ mẫu khơng quy cách  Nhỏ máu lên giấy thấm ống mao mạch 7.Mẫu máu bị đông cục  Chạ m giọt máu nhiều lần lên vị trí tạo thành lớp giấy thấm  Thấm máu đầy vòng tròn cách thấm máu hai mặt giấy 8.Mẫu giấy thấm khơng có  Khơng lấy máu máu Những lưu ý cần thiết - Mẫu máu khô lấy tốt khoảng 48 đến 72 sau sinh Có thể lấy sau 24 với trường hợp xuất viện sớm, không lấy trước 24 sau sinh - Các trường hợp cần truyền máu cần lấy trước truyền máu - Mẫu máu phải để khô tự nhiên không sấy Tránh tiếp xúc với nguồn nhiệt ánh nắng mặt trời - Để mẫu gọn gàng tránh nhiễm chéo mẫu Phụ lục QUY TRÌNH KĨ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG TREC Bước Mô tả Trách nhiệm Dùng mẫu máu khơ Thực theo quy trình khuyến cáo sau việc thao tác, thực bảo quản bệnh phẩm máu: - Lấy máu trực tiếp từ gót chân trẻ sơ sinh nhỏ vào giấy thấm máu khơ - Thực quy trình lấy máu, xử lý vận chuyển theo hướng dẫn theo quy định địa phương - Mẫu bệnh phẩm nên bảo quản 2-8°C Nhân viên Bảo quản bệnh phẩm 2-8°C không 14 ngày xét - Nếu xét nghiệm khơng hồn tất vịng 14 ngày vận chuyển bệnh phẩm: bảo quản -20°C lạnh Thực hướng dẫn sau chuẩn bị mẫu: - Đưa thuốc thử mẫu nhiệt độ phòng trước tiến hành xét nghiệm - Thực theo khuyến cáo nhà sản xuất Chuẩn bị dung dịch đệm rửa giải mẫu khu vực chuẩn bị phản ứng PCR Thêm 1275 µL dung dịch đệm phản ứng 5x Reaction Buffer vào lọ dung dịch pha loãng rửa giải mẫu Elution Diluent Đóng nắp lọ dung dịch đệm rửa giải mẫu trộn nhẹ nhàng cách đảo ngược lọ 10 lần (tránh tạo bong bóng bọt khí) Chuẩn bị hỗn hợp chất phản ứng vào lọ dung dịch pha loãng PCR (PCR Diluent) cung cấp kèm theo kit cách thêm dung dịch đệm phản ứng (5x Reaction Buffer), thuốc thử cô đặc (Reagent Concentrate), enzyme DNA Polymerase theo bảng sau Thuốc thử Dung dịch đệm phản ứng Thuốc thử cô đặc Enzyme ADN Polymerase Thêm vào lọ Thêm vào lọ dung dịch pha dung dịch pha loãng PCR (cho loãng PCR đĩa 96 giếng) (cho đĩa 96 (µL) giếng) (µL) 495 1800 186 675 75 270 Bảo quản dung dịch đệm rửa giải mẫu +19–+25°C thời gian đục mẫu trước phân phối Bảo quản hỗn hợp nghiệm chất phản ứng +2–+8°C tránh ánh sáng đục mẫu trước phân phối Thay găng tay Dán mã vạch vào đĩa PCR 96 giếng màu đen theo khuyến cáo nhà sản xuất Thao tác với đĩa PCR cách chạm vào mặt đĩa, tránh chạm lên bề mặt đĩa Sử dụng thiết bị khử tĩnh điện để xử lý đĩa PCR đặt đĩa vào máy đục Đục lỗ chất hiệu chuẩn (DBS calibrators), vật liệu kiểm soát (DBS controls), mẫu thật vào giếng theo sơ đồ đĩa Sử dụng đầu đục 1,5 mm Thay găng tay Cho 10 µL dung dịch đệm rửa giải mẫu vào giếng đảm bảo giếng có mẫu giấy thấm theo sơ đồ đĩa Trong phân phối dung dịch, tránh tạo bong bóng bọt khí tránh chạm vào đĩa giấy thấm Dán kín đĩa cách sử dụng miếng dán PCR dụng cụ chuyển miếng dán Ly tâm đĩa tốc độ 500 x g 20 giây +19–+25°C Chuyển đĩa đến máy PCR ủ nhiệt sử dụng nắp nhiệt, miếng đệm silicon đặt bề mặt đĩa xét nghiệm, theo chương trình elution incubation: Bước 1: 98°C, 45 phút Bước 2: 4°C, phút Thêm 20 µL hỗn hợp chất phản ứng vào giếng Tránh tạo bọt khí tránh chạm dung dịch vào đĩa giấy thấm giếng 10 Dán kín đĩa cách sử dụng miếng dán PCR dụng cụ chuyển miếng dán Kiểm tra miếng dán mắt thường, trường hợp bị xước nhăn, cần thay miếng dán Ly tâm đĩa tốc độ 500 x g 20 giây +19–+25°C 11 Chuyển đĩa đến máy PCR ủ nhiệt sử dụng nắp nhiệt, miếng đệm silicon đặt bề mặt đĩa xét nghiệm, theo chương trình thermal incubation: Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian 98 phút 98 15 giây 62,5 phút 72 15 giây 95 phút 35 60 phút 23* phút 37 chu kỳ từ bước (giữ) giống Bước 12 Chuyển đĩa dán từ máy luân nhiệt đến máy ly tâm đĩa Ly tâm đĩa tốc độ 500 x g phút +19–+25°C 13 Đọc tín hiệu huỳnh quang máy đọc huỳnh quang phân lập thời gian dựa hiệu ứng truyền lượng cộng hưởng Nhận kết trả từ máy xét nghiệm