Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu saponin từ rễ ngưu tất ( achyranthes bidentata blume)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG MSV: 1201629 ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ HUYỀN TRANG MSV: 1201629 ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG LÀM GIÀU SAPONIN TỪ RỄ NGƯU TẤT (ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hân TS Nguyễn Tuấn Hiệp Nơi thực hiện: Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN! Lời em xin tỏ lòng biết ơn chân thành thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, người thầy giàu kinh nghiệm đầy nhiệt huyết tạo điều kiện, giúp đỡ bảo em q trình thực khóa luận Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Tuấn Hiệp định hướng, giúp đỡ dạy dỗ em suốt thời gian làm nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới anh Đỗ Quang Thái anh chị khoa công nghệ chiết xuất- Viện Dược liệu trực tiếp hướng dẫn, bảo em tận tình giúp đỡ em hồn thành khố luận Tiếp theo em xin phép gửi lòng biết ơn tới Viện Dược liệu tạo điều kiện thuận lợi nhiều động lực để em có hội học hỏi nhiều Và em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy dỗ bảo em tận tình suốt tháng năm học tập trường Cuối cùng, với lịng biết ơn vơ hạn, em xin phép gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè động viên hỗ trợ em suốt thời gian qua Do thời gian có hạn trình độ thân cịn hạn chế nên khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, em mong nhận bảo tận tình thầy góp ý chân thành bạn bè Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Hoàng Thị Huyền Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN! DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ 10 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Achyranthes bidentata Blume 1.1.1 Về thực vật 1.1.1.1 Vị trí phân loại Ngưu tất 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.1.3 Phân bố, sinh thái 1.1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.2.1 Saponin 1.1.2.2 Phytoecdysteroid 1.1.2.3 Polysacharid 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.2 Tổng quan phương pháp tinh chế 1.2.1 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 1.2.1.1 Khái niệm 1.2.1.2 Nguyên tắc chế SPE 1.2.1.3 Ứng dụng 1.2.2 Tổng quan hạt nhựa macroporous 10 1.2.2.1 Định nghĩa phân loại 10 1.2.2.2 Đặc điểm hạt nhựa macroporous 11 1.2.2.3 Tổng quan hạt nhựa macroporous D101 11 1.2.2.3.1 Thông số vật lý 11 1.2.2.3.2 Cơ chế hấp phụ saponin hạt nhựa D101 12 1.2.2.3.3 Ứng dụng tách chiết saponin 12 1.2.2.4.4 Ứng dụng hạt nhựa nghiên cứu Ngưu tất 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng, nguyên liệu, hoá chất thiết bị nghiên cứu 15 2.1.1 Nguyên vật liệu 15 2.1.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ 16 2.1.2.1 Hoá chất 16 2.1.2.2 Dụng cụ 16 2.1.2.3 Thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Nghiên cứu cách xử lý hạt nhựa ban đầu 17 2.2.2 Nghiên cứu trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous D101 17 2.2.3 Nghiên cứu trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101 17 2.2.4 Đề xuất ổn định quy trình trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1.Phương pháp định tính, định lượng 17 2.3.1.1 Phương pháp thuỷ phân 17 2.3.1.2 Phương pháp định tính 18 2.3.1.3 Phương pháp định lượng 18 2.3.2 Phương pháp chiết 19 2.3.3 Phương pháp xử lý dịch chiết 19 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu 19 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu trình hấp phụ saponin từ dịch chiết lên hạt nhựa macroporous D101 21 2.3.5.1 Phương pháp khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 21 2.3.5.2 Phương pháp xác định dung lượng hấp phụ hạt nhựa điều kiện động 22 2.3.6 Phương pháp nghiên cứu trình giải hấp phụ saponin từ hạt nhựa macroporous D101 23 2.3.6.1 Khảo sát dung môi giải hấp phụ 23 2.3.6.2 Khảo sát thể tích rửa giải 24 2.3.7 Đề xuất ổn định quy trình làm giàu saponin từ rễ Ngưu tất ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu xử lý hạt nhựa ban đầu 27 3.2 Khảo sát trình hấp phụ saponin lên hạt nhựa macroporous D101 điều kiện động 28 3.2.1 Khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 28 3.2.2 Xác định dung lượng hấp phụ hạt nhựa điều kiện động 29 3.3 Khảo sát trình giải hấp phụ saponin hạt nhựa macroporous D101 30 3.3.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ saponin 30 3.3.2 Khảo sát thể tích rửa giải 31 3.3.2.1 Quá trình rửa tạp chất 31 3.3.2.2 Quá trình giải hấp phụ ethanol 50%, 70%, 96% 33 3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 Bàn luận phương pháp nghiên cứu 37 4.1.1 Phương pháp chiết xử lý dịch chiết 37 4.1.2 Bàn luận phương pháp tinh chế saponin rễ Ngưu tất 37 4.2 Bàn luận kết 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên Glc β-D-glucopyranosyl Abp Achyranthes bidentata polysacharid AbpS Achyranthes bidentata polysacharid sulfat BV Bed volume HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao SKLM Sắc ký lớp mỏng SPE Qe EtOH Chiết pha rắn Dung lượng hấp phụ Ethanol v:v Thể tích: thể tích kl:v Khối lượng/ thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Trình bày số saponin oleanolic phân lập từ rễ Ngưu tất 1.2 Đặc tính vật lý số loại hạt nhựa macroporous 10 1.3 Thông số vật lý hạt nhựa D101 theo nhà sản xuất 11 2.1 Tên hoá chất nguồn gốc 16 3.1 Ảnh hưởng tác nhân đến dung lượng hấp phụ hạt nhựa 27 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lên dung lượng hấp phụ 38 3.3 Kết dung lượng hấp phụ hạt nhựa 39 3.4 Khối lượng cắn loại sau rửa tạp với nước ethanol 33 3.5 Kết phân lập saponin Ngưu tất quy mơ 170 g (n=3) 36 DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Achyranthes bidentata 1.2 Axit oleanolic 1.3 Cấu trúc hóa học β-ecdysterone (I), inokosterone (II), rubrosterone (III) 2.1 Hình ảnh dược liệu Ngưu tất 15 2.2 Hình ảnh hạt nhựa macroporous D101 15 3.1 Ảnh hưởng tác nhân đến dung lượng hấp phụ hạt nhựa 27 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lên hiệu suất giải hấp phụ 38 3.3 Hình ảnh sắc ký dịch theo BV 39 3.4 So sánh khả rửa giải dung môi lựa chọn 30 3.5 Sắc ký đồ dịch theo thứ tự dung môi rửa tạp nước, ethanol 10% 20% 32 3.6 Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải với nước 32 3.7 Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải với ethanol 20% 33 3.8 (a) Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải ethanol 50% theo thứ tự BV thứ từ trái qua phải, (b) Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải ethanol 70% theo thứ tự BV thứ 1, từ trái qua phải, (c) Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải ethanol 96% 34 3.9 Đường cong giải hấp phụ ethanol 50% 35 3.10 Hình (a), (b) thứ tự hình ảnh cao trước sau tinh chế 36 Kết luận: Quá trình rửa giải gồm trình: rửa tạp (7 BV nước BV ethanol 20%) với vận tốc BV/h giải hấp phụ (6 BV ethanol 50% BV mg/g ethanol 70%) với vận tốc 1,5 BV/h 9.00 8.00 8.02 7.00 6.00 5.00 4.00 3.76 3.00 2.00 1.76 1.29 1.00 0.80 0.37 0.00 10 BV Hình 3.9 Đường cong giải hấp phụ ethanol 50% 3.4 Đề xuất quy trình làm giàu saponin ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 Tiến hành thí nghiệm mục 2.3.7 với thông số lựa chọn: - Dịch hấp phụ qua cột L với vận tốc BV/h - Sau rửa tạp thứ tự với BV nước (1680 ml) BV ethanol 20% (1440 ml) với tốc độ BV/h tiến hành giải hấp phụ: thứ tự với BV (1440 ml) ethanol 50% BV (720 ml) ethanol 70% với tốc 1,5 BV/h Dịch giải hấp phụ cô đặc sấy đến thể chất cao khô 35  Kết thu bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết phân lập saponin Ngưu tất quy mô 170 g (n=3) Mẻ Khối lượng cao (g) Hàm lượng saponin cao (%) Hiệu suất giải hấp phụ (%) Hiệu suất trình (%) 9,27 39,83 85,87 77,73 9,50 39,94 88,24 79,83 9,54 40,45 89,77 80,88 TB± SD 9,44± 0,15 40,07± 0,33 87,96± 1,96 79,48± 1,60 RSD (%) 1,59 0,83 2,23 2,01 Nhận xét: Kết bảng 3.5 cho thấy quy trình ổn định Sau trình tinh chế saponin mẻ 170 g dược liệu Ngưu tất, thu khoảng 9,44 g cao với hàm lượng saponin 40,07% hiệu suất rửa giải khoảng 87,96% Sau chiết xuất phân lập hiệu suất q trình tính theo saponin 79,48% (a) (b) Hình 3.10 Hình (a), (b) thứ tự hình ảnh cao trước sau tinh chế 36 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Bàn luận phương pháp nghiên cứu 4.1.1 Phương pháp chiết xử lý dịch chiết Về phương pháp chiết xuất saponin từ rễ Ngưu tất Các nghiên cứu thành phần hóa học thường sử dụng dung môi MeOH để chiết xuất nhiên dung mơi độc hại ứng dụng quy mơ cơng nghiệp Đã có vài nghiên cứu quy trình chiết xuất từ rễ ngưu tất dung môi thường sử dụng dung môi ethanol + nước Khảo sát trước xí nghiệp dược phẩm TW-5 đưa kết luận: dung môi chiết ethanol nồng độ 85%, nhiệt độ 90o, tỷ lệ dược liệu: dung môi 1:8 chiết lần vòng Với mục tiêu lấy hết saponin dược liệu nhóm chọn thông số chiết lần với dung môi lựa chọn ethanol 50% Saponin tồn phần chiếm khoảng 3,5 dược liệu khơ (định lượng theo phương pháp đo quang) 4.1.2 Bàn luận phương pháp tinh chế saponin rễ Ngưu tất Hiện có nhiều cách để phân lập saponin Ngưu tất sử dụng sắc ký cột silica gel, cột ODS hay lắc phân đoạn với dung môi hữu cơ, gặp phải số nhược điểm tính kinh tế khơng cao, khó áp dụng lên quy mơ lớn hay vấn đề liên quan đến sức khoẻ môi trường Hướng sử dụng hạt nhựa macroporous D101 phân lập saponin từ rễ Ngưu tất có nhiều ưu điểm như: thực đơn giản, chi phí thấp, hạt nhựa tái sử dụng nhiều lần, dung môi thân thiện với môi trường dễ áp dụng quy mơ lớn Thực tế, hạt nhựa macroporous có nhiều loại khác nhau, D101 chứng minh hiệu phân lập saponin nên nhóm chọn loại hạt nhựa để nghiên cứu Bàn luận giai đoạn tiến hành: Giai đoạn xử lý hạt nhựa: mục đích để hạt trương nở hồn tồn loại 37 tạp q trình sản xuất cịn bám hạt nhựa Trong nghiên cứu trước thường xử lý hạt nhựa theo cách sau: ngâm ethanol tuyệt đối 24 sau ngâm ethanol tiếp tục ngâm thứ tự với dung dịch HCl NaOH Tuy nhiên chưa có nghiên cứu chứng minh ảnh hưởng nhân tố đến dung lượng hấp phụ hạt nhựa Vì nghiên cứu đánh giá tác nhân: ethanol, axit, bazơ để khảo sát ảnh hưởng chúng lên khả hấp phụ hạt nhựa Giai đoạn hấp phụ: Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến trình hấp phụ saponin hạt nhựa macroporous D101 nhiệt độ, pH dịch nạp cột, tốc độ dịch hấp phụ, tỷ lệ chiều cao: đường kính cột Tốc độ dịch hấp phụ nhỏ thời gian tiếp xúc chất tan hạt nhựa tăng lên thời gian hấp phụ tăng lên, trình hấp phụ kéo dài Tìm hiểu tài liệu khác thông số cung cấp nhà sản xuất, tốc độ hấp phụ khoảng từ 1-4 BV/giờ Đề tài chọn tốc độ hấp phụ BV/giờ trình kéo dài đảm bảo hạt hấp phụ tối đa Tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột lớn qng đường di chuyển chất tan dài, thời gian tiếp xúc chất tan hạt nhựa tăng lên, dung lượng hấp phụ tăng lên Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ 4, 6, 10 để khảo sát tìm tỷ lệ thích hợp cho q trình hấp phụ rửa giải Khi xác định dung lượng hấp phụ hạt nhựa điều kiện động dùng phương pháp SKLM để xác định thời điểm dừng hấp phụ chi phí rẻ, mục đích nhận biết lúc mà dịch sau hấp phụ có saponin hay khơng để xác định thời điểm dừng hấp phụ Để đơn giản quy trình, xuất vết mờ saponin sắc ký đồ tức dịch chứa saponin xem phần nhỏ 38 Giai đoạn rửa giải: Loại tạp giúp rửa số tạp chất cho hàm lượng saponin sản phẩm cao sau tăng lên Trước khảo sát rửa tạp với nước kết hàm lượng saponin cao thấp (37,21 ), để tăng hàm lượng saponin sản phẩm ethanol 20% sử dụng lượng saponin theo dịch rửa khoảng 3% Tốc độ rửa giải lớn tốn dung mơi rửa đồng thời dịch lỗng Tốc độ chọn 1,5 BV/h (chậm tốc độ hấp phụ) để giảm thiểu lượng dung môi sử dụng, tăng tỷ lệ chuyển khối saponin đồng thời dịch đặc hơn, tốn lượng để cô thành sản phẩm cao 4.2 Bàn luận kết Kết nghiên cứu cho thấy xử lý hạt nhựa ban đầu thêm với NaOH 4% làm tăng dung lượng hấp phụ, giải thích ngồi rửa hết tạp tan ethanol cịn loại thêm tạp có chất axit bên hạt Cũng vậy, HCl rửa chất bazơ làm tăng khả hấp phụ ít, mà sử dụng thêm axit để xử lý dẫn đến tốn dung mơi hố chất nên chúng tơi định ngâm thêm với NaOH 4% Sự khác biệt có ý nghĩa lớn áp dụng quy trình phạm vi rộng Khi lượng hạt nhựa cố định, lượng dịch hấp phụ nhiều dẫn đến thu nhiều sản phẩm cao Kết khảo sát tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột thích hợp cho q trình hấp phụ rửa giải cho thấy, tỷ lệ không ảnh hưởng đến dung lượng hấp phụ hạt nhựa hiệu suất giải hấp phụ Nguyên nhân vận tốc hấp phụ chậm dẫn đến hạt nhựa tiếp xúc với chất tan đủ lâu để hấp phụ tối đa nên chiều dài cột không ảnh hưởng đến thông số Tuy nhiên hiệu suất giải hấp phụ lại tăng lên tỷ lệ chiều cao/ đường kính tăng bắt đầu giảm tăng tỷ lệ đến mức độ Có thể giải thích sau: 39 tỷ lệ nhỏ, quãng đường dung môi ngắn làm giảm tỷ lệ chuyển khối chất tan, tỷ lệ lớn, quãng đường dung môi dài điều kiện làm saponin hấp phụ trở lại lên hạt nhựa nên tỷ lệ rửa giải bị giảm Vì vậy, tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột thường hợp: dung môi tiếp xúc với hạt nhựa lâu tỷ lệ hấp phụ trở lại lên hạt nhựa Loại tạp với khoảng BV nước BV ethanol 20% quan sát màu sắc dịch rửa có màu vàng nâu (phụ lục 4.1) sắc ký đồ dịch ethanol 20% có thêm vết tạp màu xanh Thể tích rửa định vết tạp sắc ký đồ màu sắc dịch Sau rửa giải hết ethanol 50% cột rửa tiếp với 3BV ethanol 70% để kết luận xem rửa giải tối đa chưa qua quan sát sắc ký đồ Kết rửa giải thêm saponin vết sắc ký đậm Vì chúng tơi chọn rửa giải với hai nồng độ Với ethanol 96% có khả rửa giải tốt phần sử dụng ethanol 96% kéo theo số tạp tan chưa loại bỏ trình rửa nước ethanol nồng độ thấp (phụ lục 4.2), ethanol 96% dễ bay gây hao hụt cháy nổ sản xuất Kết cuối thu cao có hàm lượng saponin tồn phần 40,07% cao gấp khoảng lần so với cao thô ban đầu (5%) với hiệu suất toàn rửa giải đạt 87,96% hiệu suất theo saponin tồn q trình 79,48 Điều quan trọng kết ổn định lặp lại quy trình lần So với hàm lượng saponin cao Bidentin- sản phẩm ưa chuộng thị trường Viện Dược liệu nghiên cứu trước 25 (định lượng theo phương pháp đo quang) tinh chế hạt nhựa macroporous D101 làm tăng hàm lượng saponin cao lên 40,07%, xấp xỉ lần 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Từ kết thu được, số kết luận rút sau: Hạt nhựa ban đầu xử lý với ethanol 96% 24 giờ, sau loại hết ethanol tiếp tục ngâm hạt NaOH 4% rửa đến pH trung tính để đạt hiệu hấp phụ cao Dịch đưa qua cột để hấp phụ với vận tốc BV/h với dung lượng hấp phụ hạt nhựa khoảng 25,77 mg saponin/ g hạt nhựa quy mô động với tỷ lệ chiều cao/ đường kính cột 6, sau thứ tự loại tạp BV nước BV ethanol 20% Sau loại tạp, rửa cột thứ tự BV ethanol 50% BV ethanol 70% với vận tốc 1,5BV/h Áp dụng thông số thu sản phẩm cao Ngưu tất hàm lượn saponin 40,07%; hiệu suất tồn q trình 79,48% cỡ mẻ 170 g dược liệu ĐỀ XUẤT Các kết bước đầu tìm hiểu ứng dụng hạt nhựa macroporous D101 làm giàu sponin từ rễ Ngưu tất sở để tiến hành nghiên cứu sau Em xin đề xuất: - Tiếp tục khảo sát thêm hoạt tính sinh học cao sau tinh chế - Tiếp tục nghiên cứu để tìm phương pháp tái sử dụng hạt nhựa nhằm tăng số lần sử dụng - Khai triển quy trình tinh chế lên quy mô lớn 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ môn Dược học cổ truyền trường Đại học Dược Hà Nội (2013), Dược học cổ truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội, p 232 Đỗ Tất lợi (2004), Những câu thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học, pp 48- 49 Hội đồng Dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, p 748 Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Sách dược liệu tập 1, Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp 233-234 Nguyễn Hải Phong (2013), Kỹ thuật chiết pha rắn ứng dụng, Đại học Quốc gia Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam tập 1, Nhà xuất trẻ HCM, p 730 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 2, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, pp 430-435 Tài liệu tiếng Anh Chen, Qinghua Liu, Zhuying He, Jian-hua (2009), "Achyranthes bidentata polysaccharide enhances immune response in weaned piglets", Immunopharmacology and immunotoxicology 31 (2), pp 253260 Chen, XM Xu, YJ Tian, GY (2005), "Physical-chemical properties and structure elucidation of abPS isolated from the root of Achyranthes bidentata", Acta pharmaceutica Sinica 40 (1), pp 32-35 10 Devi, P Uma, Murugan (2007), "Antibacterial, in vitrolipid peroxidation and phytochemical observation on Achyranthes bidentata Blume", Pakistan Journal of Nutrition (5), pp 447-451 11 Ding, Fei Cheng, Qiong Gu, Xiaosong (2008), "The repair effects of Achyranthes bidentata extract on the crushed common peroneal nerve of rabbits", Fitoterapia 79 (3), pp 161-167 12 Guo, Jian-jun Lei, Xiao Ren, Dao-yuan Yang, Hong-yan Yang, Xingbin (2015), "Study on purification and antioxidant activity of total saponins of Gynostemma tea", Science and Technology of Food Industry 5, p 024 13 He, Cui-Cui Hui, Rong-Rong Tezuka, Yasuhiro Kadota (2010), "Osteoprotective effect of extract from Achyranthes bidentata in ovariectomized rats", Journal of ethnopharmacology 127 (2), pp 229234 14 Hong, Xiu-yun Wu, Xiao-ying (2012), "Purification and HPLC-ELSD determination of Gypenosides from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Leaves [J]", Food Science 14, p 056 15 LA Karimi, R Srinivasan (2012), 11th International Symposium on Process Systems Engineering, Elsevier, pp 725- 726 16 Li, Jing Chase, Howard A (2010), "Development of adsorptive (nonionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically-active natural products from plant sources", Natural product reports 27 (10), pp 1493-1510 17 Li, Hu (1995), "Determination of oleanolic axit in the root of Achyranthes bidentata Bl from different places of production by TLCscanning", China journal of Chinese materia medica 20 (8), pp 459460, 511 18 Li (1997), "The immunomodulatory effect of Achyranthes bidentata polysaccharides", Acta pharmaceutica Sinica 32 (12), pp 881-887 19 Lin, Jinyang Zhang, Zhuoying Shan (2010), "Effect of Achyranthes bidentata polysaccharides on the expression of the BCL-2 and BAX in hepatic tissues of exhaustive exercise in rats", African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines (4) 20 Liu, Yanze Wang, Zhimin Zhang, Junzeng (2015), Dietary Chinese herbs: Chemistry, pharmacology and clinical evidence, Springer Science & Business Media p 45 21 Liu, Zhen Wang, Jieyin Gao, Wenyuan Man, Shuli Wang, Ying Liu, Changxiao (2013), "Preparative separation and purification of steroidal saponins in Paris polyphylla var yunnanensis by macroporous adsorption resins", Pharmaceutical biology 51 (7), pp 899-905 22 Lu, Mao, Zhang, Xu (1997), "The research on analgestic and antiinflammatory action of different processed products of Achyranthes bidentata", Journal of Chinese medicinal materials 20 (10), pp 507509 23 Bo Mattiasson, Ashok Kumar, Igor Yu Galaev (2010), Macroporous polymers Production Properties and Biotechnological/Biomedical applications, CRC press, USA, p 24 Meng, Da-Li, Li, Xian Wang, Jin-Hui Li, Wei (2005), "Note: A new phytosterone from Achyranthes bidentata Bl", Journal of Asian natural products research (2), pp 181-184 25 Oh, Sang Deog Kim, Mihyun Min, Byung-Il Choi, Gi Soon Kim, SunKwang Bae (2014), "Effect of Achyranthes bidentata Blume on 3T3-L1 adipogenesis and rats fed with a high-fat diet", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 2014 26 Phillipson, J David (1993), Chinese drugs of plant origin—chemistry, pharmacology and use in traditional and modern medicine, Pergamon 27 Rensheng Xu, Yang Ye, Weimin Zhao (2011), Introduction to Natural Products Chemistry, Science press, p 18 28 Su, Zhixing Chang, Xijun Xu, Keli Luo, Xingyin Zhan, Guangyao (1992), "Efficiency and mechanism of macroporous poly (vinylthiopropionamide) chelating resin for adsorbing and separating noble metal ions and determination by atomic spectrometry", Analytica chimica acta 268 (2), pp 323-329 29 Armen Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer, Russia, pp 142 30 Vetrichelvan, Jegadeesan, (2002), "Effect of alcoholic extract of Achyranthes bidentata blume on acute and sub acute inflammation", Indian journal of pharmacology 34 (2), pp 115-118 31 Wagner, Hildebert Bauer, Rudolf Melchart, Dieter Xiao, Pei-Gen Staudinger, Anton (2011), Chromatographic fingerprint analysis of herbal medicines, Springer 32 Wang, Qiu-Hong Yang, Liu Jiang, Hai Wang, Zhi-Bin Yang, Bing-You Kuang, Hai-Xue (2011), "Three new phytoecdysteroids containing a furan ring from the roots of Achyranthes bidentata Bl", Molecules 16 (7), pp 5989-5997 33 Wang Xiao, Fang Lei, Zhao Hengqiang, Lin Xiaojing (2013), Natural product extraction: principles and applications, The Royal Society of Chemistry, pp 317- 319 34 Wang, Zp Gao, Ying Li, Wm Liu, Jie (2010), "Study on purification of total flavonoids and saponins of Astragalus with macroporous resin", Journal of Chinese medicinal materials 33 (7), pp 1163-1166 35 Xu, Xianxiang Xia, Lunzhu "Study on separation and purification of total saponins from Radix clematidis with macroporous absorptive resin [J]", Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology 1, p 020 36 Xue, Shengxia Chen, Xiaoming Lu, Jianxin Jin, Liqin (2009), "Protective effect of sulfated Achyranthes bidentata polysaccharides on streptozotocin-induced oxidative stress in rats", Carbohydrate Polymers 75 (3), pp 415-419 37 Yang, Liu Jiang, Hai Yan, Mei-Ling Xing, Xu-Dong Zhang (2016), "A new phytoecdysteroid from the roots of Achyranthes bidentata Bl", Natural Product Research, pp 1-7 38 Yu, Zhang (1995), "Effect of Achyranthes bidentata polysaccharides on antitumor activity and immune function of S180-bearing mice", Chinese journal of oncology 17 (4), pp 275-278 39 Zhang, Rong Hu, Shi-Jie Li, Chen Zhang, Feng Gan, Hong-Quan Mei, Qi-Bing (2012), "Achyranthes bidentata root extract prevent OVXinduced osteoporosis in rats", Journal of ethnopharmacology 139 (1), pp 12-18 40 Zhao, Wan-ting Meng, Da-li Li, Xian Li, Wei (2007), "Chemical constituents of Achyranthes bidentata Bl.[J]", Journal of Shenyang Pharmaceutical University 4, p 004 41 Zheng, Jie-zhen Zhou, Da-xing Gu, Jing Li, Fen-fen Chen (2008), "Effect of Active Components of Achyranthes Bidentata Blume on Contraction of Vascular Smooth Muscle [J]", Journal of Anhui Traditional Chinese Medical College 4, p 021 42 Zhou, Songlin Chen, Xia Gu, Xiaosong Ding, Fei (2009), "Achyranthes bidentata Blume extract protects cultured hippocampal neurons against glutamate-induced neurotoxicity", Journal of ethnopharmacology 122 (3), pp 547-554 43 Żwir-Ferenc, Biziuk (2006), "Solid phase extraction technique–trends, opportunities and applications", Polish Journal of Environmental Studies 15 (5), pp 677-690 44 Teng Chen (2012), Preparation method of Achyranthes bidentata saponin, Google Patents, CN 101837034 A PHỤ LỤC C:M 20:1 CT C T Phụ lục 4.1 Hình ảnh sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn mẫu thử (CT), mẫu chuẩn (C) mẫu thử (T) với hệ dung môi Cloroform: Methanol (20:1) (a) (b) Phụ lục 4.2 Hình ảnh màu sắc dịch rửa với nước ethanol 20% thứ tự (a), (b) Phụ lục 4.3 Hình ảnh sắc ký dịch rửa giải với ethanol 96% Phụ lục 4.4 Hình ảnh sắc ký mẫu chuẩn (C), dịch lên cột ban đầu (Đ) dịch rửa giải (S)