Nhân giống in vitro cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana)

Nhân giống in vitro cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM oOo ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM oOo ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD:Ths. NGUYỄN THÀNH SUM SVTH: MSSV PHẠM TRỌNG 10261191 MAI ĐỨC DŨNG 10251691 NGUYỄN ĐỨC THIỆN 10 149321 TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6/ 2013 Trang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập tại trường ĐH công nghệp Tp.HCM , chúng em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của Quý Thầy, Cô, Gia đình và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, chúng em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực Phẩm– Trường Đại Học Công Nghệp Thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành . Với tri thức và tâm huyết của mình, các thầy, cô đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường. Chúng em xin chân thành cảm ơn Ths.Nguyễn Thành Sum đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp cũng như những buổi nói chuyện, thảo luận về lĩnh vực trong nghiên cứu khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy thì đồ án của chúng em rất khó có thể hoàn thành. Bài báo cáo này không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Quý Thầy Cô để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG vi CÁC TỪ VIẾT TẮT viii PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1. Giới thiệu cây Cỏ ngọt 2 2.1.1. Vị trí phân loại 2 2.1.2. Nguồn gốc cây cỏ ngọt 2 2.1.3. Phân bố 3 2.1.4. Đặc điểm hình thái 3 2.1.5. Đặc điểm sinh trưởng: 4 2.1.6. Điều kiện sinh trưởng 5 2.2. Nhân giống cây trồng in vitro 6 2.2.1. Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 2.2.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 2.2.3. Lợi ích của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. 8 2.2.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro 8 2.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 10 2.2.6. Điều kiện nuôi cấy 12 2.2.7. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 12 2.2.8. Chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) 13 Trang iii 2.2.9. Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt Nam 15 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Vật liệu 16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ 16 3.1.3. Môi trường nuôi cấy 18 3.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro 18 3.2. Phương pháp nghiên cứu 19 3.2.1. Phương pháp khử trùng 19 3.2.2. Phương pháp thí nghiệm 19 3.2.3. Phân tích thống kê 25 3.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu cấy cây Cỏ Ngọt in vitro. 26 4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển cây Cỏ ngọt in vitro 27 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các nhóm chất điều tiết sinh trưởng lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 29 4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 30 4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung Ki kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 32 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l IBA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 33 Trang iv 4.3.1. Thí nghiệm 3c: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường có bổ sung BA kết hợp với 0.2 mg/l NAA lên khả năng tạo chồi cây Cỏ ngọt in vitro. 34 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 35 4.4.1. Thí nghiệm 4a: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 36 4.4.2. Thí nghiệm 4b: Khảo sát ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 37 4.4.3. Thí nghiệm 4c: Khảo sát ảnh hưởng của IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro. 39 PHẦN 5: KẾT LUẬN 42 KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trang v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana) 2 Hình 2.1 Cây Cỏ Ngọt 2 Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt. 4 Hình 4.1 Các dạng mẫu trong thí nghiệm khử trùng mẫu: a. mẫu sống và mọc chồi; 27 Hình 4.2 Kết quả nghiệm thức tìm môi trường cơ bản cho cỏ ngọt in vitro 29 Hình 4.3 Chiều cao và số chồi ở các nghiệm thức nhân nhanh chồi trong môi trường có sự kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA 31 Hình 4.4 Nghiệm thức nhân nhanh chồi kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA 33 Hình 4.5 Chiều cao và hình thái chồi trong các nghiệm thức kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA 34 Hình 4.6 Hình thái cây trong các nghiệm thức nhân nhanh chồi có kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA 35 Hình 4.7 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung IBA 37 Hình 4.8 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bổ sung NAA. 39 Hình 4.9 Rễ hình thành ở các nghiệm thức bố sung IAA 41 Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số chất khử trùng và khoảng thời gian khử trùng thường dùng trong nhân giống in vitro 9 Bảng 3.1 Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo mẫu Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh 20 Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in vitro. 21 Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi . 22 Bảng 3.4 các nghiệm thức trong thí nghệm tìm môi trường ra rễ cho cây Cỏ Ngọt in vitro 24 Bảng 4.1 Kết quả nghiệm thức khảo sát nồng độ và thời gian khử trùng mẫu Cỏ ngọt bằng chất khử trùng TCCA 26 Bảng 4.2 Kết quả của thí nghiệm tìm môi trường cơ bản tối ưu cho cây Cỏ ngọt in vitro 28 Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có sự bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l IBA 30 Bảng 4.4 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi có bổ sung kết hợp giữa Ki và 0.2 mg/l NAA 32 Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l IBA 33 Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm nhân nhanh chồi kết hợp giữa BA và 0.2 mg/l NAA 34 Bảng 4.7 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IBA 36 Bảng 4.8 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung NAA 37 Bảng 4.9 Kết quả thí nghiệm khảo sát môi trường tạo rễ bổ sung IAA 39 Trang vii Trang viii CÁC TỪ VIẾT TẮT MS : Murashige và Skoog IBA : Indol butyric acid NAA : Napthlacetic acid IAA : Indol acetic acid Ki : Kinetin BA : Benzyl adenin ĐC : Nghiệm thức đối chứng [...]... về việc nhân giống cây cỏ ngọt in vitro trên thế giới Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây cỏ ngọt bằng phương pháp in vitro đã được công bố trên các tạp chí như : MUHAMMAD RAFIQ và cộng sự thuộc Viện Công nghệ sinh học và kỹ thuật di truyền, Đại học Sindh, Jamshoro, Pakistan được đăng trên tạp chí Pak J Bot., 39(7): 2467-2474 (2007) Họ tiến hành khảo sát khả năng ra rễ của cây cỏ ngọt in vitro trên... (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những lợi điểm sau: Tạo ra cây con đồng nhất và giống như cây mẹ Phần này giống như nhân giống vô tính Đối với các cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo như phần lớn các loài cây ăn trái, các cây con sinh ra từ hạt không hoàn toàn đồng nhất, và có thể không giống như cây mẹ, trong trường hợp này nhân giống vô tính có lợi điểm hơn nhân giống qua hạt So với kiểu nhân giống. .. nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro Và môi trường ½ MS bổ sung 0.1 mg/l IBA cho kết quả tạo rễ của cây cỏ ngọt in vi tro là tối ưu nhất b Tại việt nam Cây cỏ ngọt là loại cây mới có mặt ở nước ta khoảng 20 năm nay Việc nhân giống cỏ ngọt chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, giâm cành Việc nghiên cứu Trang 15 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum về nhân giống bằng phương pháp in vitro còn ít Một... chất lượng, tính đồng nhất của giống và có thể gây thoái hóa giống Vì vậy, chúng tôi thực hiên đề tài: “NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT IN VITRO (STEVIA REBAUDIANA) Nhằm mục đích góp một phần nhỏ vào việc tạo nguồn cây con đồng nhất cho sản xuất Trang 1 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cây Cỏ ngọt Tên thường gọi: Cỏ ngọt, Cỏ mật, cỏ cúc Tên khoa học: Stevia... hoạch cao, hàm lượng các chất ngọt tăng Đất sét không thích hơp cho sự sinh trưởng của cỏ ngọt Cỏ ngọt là cây thu hoạch lá do vậy nó yêu cầu chế độ dinh dưỡng cao, vì thế bón phân là biện pháp tích cực để tăng năng suất cỏ ngọt Cỏ ngọt ưa đất trung tính, PH trong đất khoảng từ 6,5 đến 7 là tốt nhất Trang 5 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum 2.2 Nhân giống cây trồng in vitro 2.2.1 Sơ lược về nuôi... của cây cỏ ngọt 2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng: Cỏ ngọt là cây lâu năm, nó có thể sống từ 5-10 năm Tuy nhiên, khi năng suất Trang 4 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum của cỏ ngọt đã xuống thấp thì nên nhổ bỏ và trồng lại cây mới Là cây bán nhiệt đới ưa ẩm, ưa sáng nhưng sợ úng và chết khi ngập nước Sinh sản hữu tính (gieo hạt) hoặc vô tính (giâm cành) 2.1.6 Điều kiện sinh trưởng a Nhiệt độ Cỏ ngọt. .. mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu không nhiễm vi sinh vật (%) Tỉ lệ mẫu sống và mọc chồi (%) Trang 20 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Ths.Nguyễn Thành Sum b Thí nghiệm 2: khảo sát tìm môi trường cơ bản của cây Cỏ ngọt in vitro Mục đích thí nghiệm: khảo sát môi trường cơ bản thích hợp cho việc nhân giống Cỏ Ngọt in vitro Vật liệu thí nghiệm: các đoạn thân mang chồi nách của cây Cỏ Ngọt đã được vô trùng ở thí nghiệm 1 Các... cấy Hệ số nhân: Số đốt trung bình/ bình nuôi cấy Số đốt thân/mẫu cấy ( hệ số nhân) d Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA , NAA và IAA đến sự hình thành rễ của cây Cỏ ngọt in vitro Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ IBA , NAA và IAA thích hợp cho quá trình tạo rễ của cây Cỏ ngọt in vitro, nhằm chuẩn bị cây con khoẻ mạnh để đưa ra vườn ươm Vật liệu thí nghiệm: Mẫu được lấy từ chồi Cỏ Ngọt ở nghiệm... được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất Việc trao đổi giống được dễ dàng 2.2.4 Các giai đoạn nhân giống in vitro Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), sự thành công của việc nhân giống in vitro chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn: a Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên... auxin Trong một tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokynin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi Và ngược lại, auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự tạo rễ Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp DNA và protein, kích thích quá trình trao đổi chất 2.2.9 Những thành tựu về nuôi cấy cây cỏ ngọt trên thế giới và Việt . Kỳ. Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau :  Stevia eupatoria  Stevia ovata  Stevia plummerae  Stevia rebaudiana  Stevia salicifolia  Stevia serrata Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo. thấy rằng mẫu cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. c. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Giai đoạn này được coi là giai đoạn. Cỏ Ngọt in vitro sạch bệnh 20 Bảng 3.2 Các nghiệm thức thí nghiệm tìm môi trường cơ bản cho cây Cỏ Ngọt in vitro. 21 Bảng 3.3 Các nghiệm trong thí nghiệm nhân nhanh chồi thức nhân nhanh chồi