Nghiên cứu phát triển kit lamp phát hiện neisseria meningitidis

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển kit LAMP phát Neisseria meningitidis NGUYỄN THU TRANG Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong TS Võ Viết Cường Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Hà Nội, 2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu phát triển kit LAMP phát Neisseria meningitidis NGUYỄN THU TRANG Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong Chữ ký GVHD TS Võ Viết Cường Chữ ký GVHD Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Hà Nội, 2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn : Nguyễn Thu Trang Đề tài luận văn: Nghiên cứu phát triển kit LAMP phát Neisseria meningitidis Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: 20211182M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 14 tháng năm 2023 với nội dung sau: STT Yêu cầu chỉnh sửa phản Nội dung chỉnh sửa, bổ sung, biện hội đồng làm rõ (ghi số trang chỉnh sửa) Chỉnh sửa cụm từ “Bệnh nhiễm Đã chỉnh sửa phần Tóm tắt luận văn, não mô cầu” thành “Bệnh viêm Danh mục từ viết tắt, từ trang 1, 2, màng não mô cầu” 43 Mục 1.4 cần có tiểu mục riêng Đã bổ sung thêm mục 1.4.3.1 1.4.3.2 kỹ thuật LAMP ứng dụng (trang 123, 13) kỹ thuật LAMP chẩn đốn N meningitidis Trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo cho Hình 1.1, 1.4 đến 1.7, 1.10 đến 1.13; Bảng 1.1 Đã trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo cho Hình Bảng theo yêu cầu Trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo cho thông tin, số liệu đơn vị Quân đội Đã trích dẫn nguồn tài liệu tham khảo cho thông tin, số liệu đơn vị Quân đội (tài liệu tham khảo số 7) Cần làm rõ đối tượng nghiên cứu mục 2.1 Đã bổ sung đối tượng nghiên cứu mục 2.1.1: Mẫu DNA khuôn tinh từ chủng N meningitidis (trang 15) Chỉnh sửa cụm “mẫu dương” thành “mẫu dương tính”, “mẫu âm” thành “mẫu âm tính” Đã sửa trang 15, 22, 30, 41, 43, 45 Cần chỉnh sửa tên mục 2.1.3 Đã chỉnh sửa tên mục 2.1.3 từ “Oligonucleotide” thành “Các mồi sử dụng” Cần bổ sung thông tin mồi sử dụng luận văn Cần bổ sung tên hãng sản xuất thiết bị mục 2.1.5 Đã bổ sung thông tin mồi sử dụng luận văn (trang 15) Đã bổ sung (trang 16) Cần kiểm tra lại phần đánh số thứ tự phương pháp phần Phương pháp nghiên cứu Đã kiểm tra chỉnh sửa mục 2.2.1.1, 2.2.1.2 (trang 17, 19) mục 2.2.2, 2.2.2.1, 2.2.2.2, 2.2.2.3 (trang 23- 26) Chỉnh sửa từ “Cấu trúc vỏ” thành “Cấu trúc thành tế bào” Đã chỉnh sửa mục 1.3.1 (trang 6) Bổ sung Accession number chủng N meningitidis týp huyết khác Đã bổ sung mục 3.1 (trang 28) 13 Bổ sung trình tự mồi vào kết luận Đã bổ sung mục Kết luận (trang 51) 14 Bổ sung cột Giải nghĩa vào Danh mục từ viết tắt Đã bổ sung 15 Sửa dấu “.” thành dấu “,” số thập phân Đã sửa trang từ 17 đến 14 16 In nghiên tên báo phần Tài liệu tham khảo Đã chỉnh sửa (trang 51 đến trang 55) 10 11 12 Ngày 16 tháng 03 năm 2023 Giáo viên hướng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm anh chị Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga tận tình dạy em suốt thời gian vừa qua Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Trương Quốc Phong, Phó Viện trưởng, giảng viên mơn Vi Sinh - Hóa Sinh - Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Võ Viết Cường Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga bảo, hướng dẫn tận tình tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể bạn/ anh/ chị/ em, thầy làm việc Phịng Thí nghiệm Proteomics phòng ban khác thuộc Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Hà Nội Cảm ơn người giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em trình thực luận văn Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bố mẹ anh chị em, bạn bè, người gia đình sát cánh, động viên, chỗ dựa tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Trong trình thực luận văn, thời gian kiến thức cịn hạn chế nên cịn có thiếu sót khơng thể tránh khỏi Em mong nhận đóng góp ý kiến, bảo tận tình q thầy để luận văn hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thu Trang TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: Nghiên cứu phát triển kit LAMP phát Neisseria meningitidis Tác giả luận văn: Nguyễn Thu Trang Khóa: 2021A Cán hướng dẫn chính: PGS TS Trương Quốc Phong – Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội Cán hướng dẫn phụ: TS Võ Viết Cường – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga Nội dung tóm tắt:  Lý chọn đề tài Bệnh viêm màng não mô cầu (NMC) bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây dịch lây truyền qua đường hô hấp nhiễm loại song cầu Neisseria meningitidis Vi khuẩn cư trú vùng hầu họng người lây theo giọt nước nhỏ tiết qua đường hô hấp Bệnh nhiễm NMC lâm sàng: viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, viêm khớp, viêm màng tim viêm màng não mủ nhiễm khuẩn huyết thường gặp Người sống điều kiện đông đúc, chật hẹp nhà trẻ, trường học, khu tập thể, doanh trại quân đội thường có nguy gây lây nhiễm cao Vi khuẩn xâm nhập vào thể người qua đường mũi họng, từ lan tỏa vào máu gây nhiễm trùng máu qua đường máu đến màng não gây viêm màng não mủ gây viêm màng não mủ kèm theo nhiễm trùng huyết Bệnh thường để lại di chứng nặng nề chậm phát triển tinh thần, điếc, liệt với tỷ lệ từ 10 đến 20%, tỷ lệ tử vong từ đến 15% Bệnh tiến triển nhanh tử vong vòng 24 sau phát bệnh Bệnh khó phát giai đoạn sớm triệu chứng giống với bệnh viêm màng não nhiễm siêu vi thông thường Hiện giới thành cơng việc chẩn đốn vi khuẩn N meningitidis phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) So với phương pháp PCR, Real-time PCR, LAMP có nhiều ưu điểm như: độ xác cao, đơn giản, giá thành thấp, khơng địi hỏi trang thiết bị đại đặc biệt thời gian thực ngắn kết đọc mắt thường Nhưng việc chẩn đốn sớm bệnh viêm não mơ cầu vi khuẩn N meningitidis gây nên kỹ thuật LAMP chưa có nhóm nghiên cứu Việt Nam thực Vì đề tài có ý nghĩa khoa học thực tiễn Do đó, nhóm nghiên cứu thực đề tài: "Nghiên cứu phát triển kit LAMP phát Neisseria meningitidis"  Mục đích đề tài • Lựa chọn thành cơng gen đặc hiệu N meningitidis • Thiết kế mồi dùng phản ứng LAMP xác định thành phần kit LAMP phát N meningitidis • Tối ưu thành công điều kiện phản ứng LAMP • Thành cơng đánh giá đặc tính kit LAMP dựa panel mẫu chuẩn  Nội dung nghiên cứu đề tài • Xác định trình tự gen đích N meningitidis • Khảo sát, thiết kế cặp mồi dùng phản ứng LAMP nghiên cứu thành phần kit LAMP phát N meningitidis • Tối ưu điều kiện phản ứng LAMP • Đánh giá đặc tính kit LAMP dựa mẫu chuẩn  Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp PCR khuếch đại gen đích • Kỹ thuật LAMP • Kỹ thuật màu đánh giá kết LAMP  Kết luận • Thành cơng xác định trình tự gen đích phát N meningitidis: Gen ctrA • Thiết kế thành cơng mồi dùng phản ứng LAMP • Tối ưu thành công điều kiện nồng độ thành phần kit LAMP phát N meningitidis • Đánh giá đặc tính kit LAMP với độ bao phủ týp huyết A, B, C; độ nhạy đạt 100% độ đặc hiệu đạt 100% MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh viêm màng não mô cầu 1.2 Dịch tễ học bệnh viêm màng não mơ cầu ngồi nước 1.2.1 Ngoài nước 1.2.2 Trong nước 1.3 Đặc điểm sinh học N meningitidis 1.3.1 Cấu trúc thành tế bào N meningitidis 1.3.2 Đặc điểm gen đích phát N meningitidis 1.3.3 Đặc điểm gen đích xác định nhóm huyết N meningitidis 10 1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán N meningitdis 12 1.4.1 Kỹ thuật nuôi cấy, phân lập 12 1.4.2 Kỹ thuật ngưng kết 12 1.4.3 Kỹ thuật sinh học phân tử phát N meningitidis 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Mẫu thí nghiệm 15 2.1.2 Trình tự gen ctrA nhóm huyết khác N meningitidis 15 2.1.3 Các mồi sử dụng 15 2.1.4 Hóa chất 16 2.1.5 Thiết bị 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử 17 2.2.2 Các phương pháp đánh giá kết LAMP 22 2.3 Sơ đồ quy trình thực 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Lựa chọn trình tự gen đích phát chủng N meningitidis 27 3.2 Thiết kế, lựa chọn mồi LAMP phát chủng N meningitidis 28 3.2.1 Thiết lập điều kiện ban đầu cho phản ứng LAMP 32 3.3 Tối ưu hóa phản ứng LAMP 34 3.3.1 Tối ưu hóa nồng độ FIP/ BIP 34 3.3.2 Tối ưu hóa nồng độ mồi F-Loop/ B-Loop 35 3.3.3 Tối ưu hóa nồng độ dNTPs 36 3.3.4 Tối ưu nồng độ MgSO4 37 3.3.5 Tối ưu hóa hàm lượng enzyme Bst DNA polymerase 38 3.3.6 Tối ưu hóa nồng độ betaine 38 3.3.7 Tối ưu hóa nhiệt độ 39 3.3.8 Tối ưu hóa ngưỡng phát 40 3.3.9 Tối ưu hóa thời gian phản ứng 40 3.4 Phương pháp màu kỹ thuật LAMP 41 3.4.1 Khảo sát thay đổi màu theo pH chất thị 41 3.4.2 Kết màu phản ứng LAMP theo chất thị 42 3.5 Đánh giá đặc tính kit 43 3.5.1 Đánh giá độ bao phủ mồi LAMP 43 3.5.2 Khảo sát biến tính nhiệt với DNA khuôn 44 3.5.3 Độ nhạy 44 3.5.4 Độ đặc hiệu 46 3.5.5 Phản ứng chéo 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Em bé sống sót sau mắc bệnh viêm màng não mơ cầu[1] Hình 1.2: Sự lưu hành nhóm huyết gây bệnh giới [2] .1 Hình 1.3: Tỷ lệ nhiễm NMC khu vực khác giới [2] Hình 1.4: Ảnh hiển vi điện tử Neisseria meningitidis (màu xanh), sợi pili (màu vàng)[11] Hình 1.5: Neisseria meningitidis dịch não tủy[12] Hình 1.6: Neisseria meningitidis sống mơi trường thạch máu[9] Hình 1.7: Màng tế bào cắt ngang [15] cấu trúc màng N meningitidis Hình 1.8: Cấu trúc LOS N meningitidis [19] Hình 1.9: Sơ đồ tổ chức vùng vỏ polysaccharide chủng N meningitidis, biểu diễn nhóm huyết A, E, B/C, W/Y [27] Hình 1.10: Bản đồ gen capsule (CPS) Nmen[34] 11 Hình 1.11: Hình ảnh ni cấy N meningitidis mơi trường thạch chocolate có kháng sinh[9] 12 Hình 2.1: Sơ đồ nguyên tắc hoạt động phương pháp PCR ……………….17 Hình 2.2: Vị trí sáu vùng đặc trưng gen bốn loại mồi LAMP 19 Hình 2.3: Tiến trình phản ứng LAMP bước đến 11 21 Hình 2.4: Điện di gel Agarose sản phẩm LAMP 22 Hình 2.5: Nguyên tắc phương pháp phát phản ứng LAMP dương tính dựa vào tượng xuất kết tủa trắng magnesium pyrophosphate (Mg2P2O7) 23 Hình 2.6: Nguyên tắc phát phản ứng LAMP dương tính thuốc thử HNB 24 Hình 2.7: Phát phản ứng LAMP thị màu dựa vào độ giảm pH phản ứng 24 Hình 2.8: Nguyên tắc phát phản ứng LAMP Calcein 25 Hình 2.9: Nguyên tắc phát phản ứng LAMP SYBR 26 Hình 2.10: Sơ đồ quy trình thực 26 Hình 3.1: Trình tự gen ctrA so sánh công cụ Multalin từ nhóm huyết khác N meningitidis ……………………………………27 Hình 3.2: Kết điện di phản ứng LAMP mồi theo thứ tự A, B, C, D 30 Hình 3.3: Kết PCR khuếch đại gen ctrA nhóm huyết A, B, C 31 Hình 3.4: Vị trí bắt cặp cặp mồi LAMP với khn đích .32 Hình 3.5: Ảnh điện di phổ sản phẩm phản ứng LAMP 33